一种用于活细胞力学性能高通量精密检测的装置及方法
阅读说明：本技术 一种用于活细胞力学性能高通量精密检测的装置及方法 (Device and method for high-throughput precision detection of mechanical properties of living cells ) 是由 陈华英 陈震林 张露丹 朱永刚 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于活细胞力学性能高通量精密检测的微流控装置,用于检测活细胞力学性能的微流体芯片置于光学显微镜上方,微流体芯片内设置并列的微通道用于对细胞进行挤压,并且设置分流通道保证挤压压力基本不变；一种用于活细胞力学性能高通量精密检测的方法,包括以下步骤：S1：细胞弹性模量的测量方法；S2：微通道压差控制方法；该装置及方法不但可以快速检测大量活细胞的弹性模量,而且操作简单,高度自动化。(The invention discloses a microfluidic device for high-flux precision detection of mechanical properties of living cells, wherein a microfluidic chip for detecting the mechanical properties of the living cells is arranged above an optical microscope, parallel microchannels are arranged in the microfluidic chip and used for extruding the cells, and a shunting channel is arranged to ensure that the extrusion pressure is basically unchanged; a method for high-throughput precision detection of mechanical properties of living cells comprises the following steps: s1: a method for measuring the cell elastic modulus; s2: a microchannel differential pressure control method; the device and the method not only can rapidly detect the elastic modulus of a large number of living cells, but also have simple operation and high automation.)
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别是一种用于活细胞力学性能高通量精密检测的装置及方法。
背景技术
细胞的弹性模量影响着细胞的增值、分化、迁移及凋亡等各个方面。细胞弹性模量的异常有可能引起细胞功能的改变，甚至导致疾病的发生。例如，人类在感染恶性疟原虫时，人体内红细胞弹性模量会增加。变硬的红细胞难以通过狭窄的毛细血管将导致血流不畅，最终可能导致人的昏迷甚至死亡。另外，在干细胞疗法中，其安全性和有效性受到诸如细胞堵塞毛细血管引起肺栓塞和植入前细胞活性和纯度不够高等多种因素的制约，而这些问题都与细胞弹性模量息息相关。因此，研究细胞的弹性模量可用于定量反映细胞的健康状态，并有望用于疾病的快速诊断和治疗。
对细胞弹性模量的测量研究已经持续了半个世纪，诸如光学、磁学和流体力学等技术都已经被应用于细胞力学性能研究。使用最为广泛的传统测量技术是微量吸管(Micropipette Aspiration)。该技术利用通过玻璃毛细管抽吸球形细胞，基于细胞变形数据获得细胞的弹性模量。原子力显微镜(Atomic Force Microscopy)被认为是目前测量单细胞弹性模量最为精确的技术。该技术使用精密的悬臂自由端按压细胞，使细胞表面产生局部变形，并根据变形和所需的力获得细胞的弹性模量。但原子力显微镜设备价格高昂，操作复杂，测量效率也非常低。除此之外，传统的细胞弹性模量测量技术还有磁性扭曲细胞计数法(Magnetic Twisting Cytometry)、光镊(Optical Tweezers)和剪切流技术(ShearFlow)[8]，但这些技术也都存在相应的问题，如光镊技术中挤压力的大小校准问题。
上述传统测量技术均存在一些不足，如通量较低，设备昂贵或操作繁琐。因为细胞个体差异较大，应该尽量测量大量细胞以获得具有统计学意义的可靠数据。微流控技术因其可以高通量处理细胞，具有活细胞弹性模量高通量测量的潜力。目前已经出现以微流控技术测量细胞弹性模量的相关研究。流动诱导变形(Flow induced deformation)技术是利用微通道中的剪切流来引起细胞变形并估算其弹性模量。Gossett等人使用该技术计算细胞的可变形性并达到了约为2000个细胞每秒的通量。Otto等人开发的实时细胞变形技术同样使用该技术定量计算细胞的弹性模量并达到了约100个细胞每秒的通量。压缩(Compression)技术在微流体芯片中使用可变形膜挤压细胞并使之产生变形从而获得弹性模量数据。Hohne等人使用该技术测量了杨氏模量在102-105Pa范围内细胞的力学性质。此外，微量吸管(Aspiration)技术与传统测量方法中的微量吸管相似，使细胞在微小通道中被挤压变形从而获得弹性模量数据。该技术在微流体装置中结合显微成像技术记录细胞变形过程，从而获得细胞的弹性模量。Guo等人开发了微米级的锥形收缩通道使细胞变形通过并以此来估算细胞的变形能力。Kim等人在微流控芯片中使细胞通过多个并列的漏斗形收缩微通道并发生变形，进而获得细胞的弹性模量。
综上所述，与本发明相比，
背景技术
具有明显的不足。简要概括如下：1)原子力显微镜的弹性模量测量虽然精度高，但通量很低，难以获得大量具有统计学意义的数据。基于流动诱导变形的实时可变形性细胞术(Real-time deformablecytometry)虽然通量很高，但存在诱导力有限，无法使较硬细胞变形的缺点，而且需要高速相机捕捉细胞变形数据。
2)现有微流控装置虽然能平行处理多个单细胞，但是没有对细胞变形通道两端压力差进行精密测量和控制，并且可能出现所有收缩通道都被堵塞从而导致压差发生剧烈变化的情况，这些都会使细胞弹性模量的计算值有巨大误差。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于活细胞力学性能高通量精密检测的装置及方法，该装置及方法不但可以快速检测大量活细胞的弹性模量，而且操作简单，精度高。
一种用于活细胞力学性能高通量精密检测的装置，包括微流体芯片和光学显微镜，微流体芯片置于光学显微镜上方，微流体芯片内设置并列的微通道用于对细胞进行挤压；
微流体芯片包括入口、出口、位于中部挤压区的并列微通道以及分流通道，所述入口的另一侧设置过滤段，过滤段的另一侧设置分流通道，挤压区的两侧分别设置分流通道，挤压区内部设置微通道，分流通道的另一侧设置出口。
优选地，分流通道入口处设置了宽度为4微米的并列微通道用于防止细胞进入分流通道，所述挤压区的并列微通道宽度小于细胞直径用于迫使细胞发生变形，所述挤压区中微通道上下游间的压降将保持在ΔP。
优选地，一种用于活细胞力学性能高通量精密检测的方法，包括以下步骤：
S1：微通道压差控制方法；
S2：细胞弹性模量的高通量和高精度测量方法。
优选地，S1包括以下子步骤：
S11：芯片将与外部压差传感器连接，用于确定挤压区的准确压降值；
S12：使用精密注射泵或压力泵将不含细胞的液体以一定流速注入芯片，传感器将检测挤压区收缩通道的压降，该压降在细胞通过收缩通道时仍能保持基本不变；
S13：使用相同流速向微流体芯片通入含有待测细胞的悬浮液；
S14：处于通道中部的大部分细胞将沿流线流至挤压区的微通道处，而靠近壁面的个别细胞会沿着通道壁面流至分流通道入口；
S15：由于挤压区和分流通道入口处的微通道十分狭小，而主通道的宽度为微通道的100多倍，通道的压降主要集中在微通道处；
S16：当细胞到达分流通道入口处时，由于入口处的微通道宽度远小于细胞直径，细胞不易发生变形而无法进入分流通道，并在流体作用下沿壁面流动至下游挤压区；
S17：在微通道的分压作用下，在挤压区微通道挤压细胞的过程中，通道的整体压力变化十分微小可以忽略，因此保证了弹性模量检测的高精度；
优选地，S2包括以下子步骤：：
S21：含有待测活细胞的悬浮液由外部精密注射泵或压力泵以一定流速从芯片入口注入主通道；
S22：该细胞随后会在流体的作用下继续流到下游的挤压区，当细胞流至挤压区微通道处，由于收缩通道的宽度小于细胞的直径，细胞被挤压变形进入微通道；
S23：细胞在经过微通道后继续流向下游并从出口流出芯片；
S24：通道中并列分布了40条微通道，在保证细胞可以高通量流过的同时确保可以通过光学显微镜同时观察到所有微通道；
S25：微通道中的细胞变形情况由显微成像系统记录并获得量化的细胞变形数据；
S26：得益于多条并列微通道以及侧面分流通道的分流设置，在细胞挤压过程中可以获得高精度、稳定的压降，保证了细胞力学性能检测的高精度以及高通量。
本发明用于活细胞力学性能高通量精密检测的装置及方法的有益效果如下：
1.通过设置并列挤压通道以及实现检测过程中压差不变，提高了细胞弹性模量检测通量，可快速提供大量细胞弹性模量数据，使细胞弹性模量芯片的商业化应用成为可能。
2.基于流道的设置，严格保证了测量过程中压差的稳定性，从而实现细胞弹性模量的精密测量。
附图说明
图1细胞弹性模量检测装置示意图。
图2微流体芯片通道示意图和收缩通道局部放大图。
图3细胞挤压区和微通道放大图
图4为弹性模量测量流程图。
图5(a)通道流线分布图；
图5(b)分流通道入口阻隔细胞示意图。
图6(a)挤压区细胞变形图；
图6(b)挤压区单个微通道中的细胞变形图；
图6(c)细胞伸长量随时间变化以及根据细胞模型的拟合结果(实线)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
如图1-3所示，该装置主要由微流体芯片和显微成像系统组成，并在微流体芯片中使用并列的微通道对细胞进行挤压。微流体芯片的内部流道如图3所示，包括入口、出口、位于中部挤压区的并列微通道以及位于两侧的分流通道。其中，挤压区的并列微通道由于宽度小于细胞直径可以迫使细胞发生变形，而分流通道入口处设置了微通道用于防止近壁面的细胞进入分流通道。在并列通道以及分流通道的分流作用下，挤压区的压降在挤压细胞的过程中的变化基本可以忽略。
弹性模量测量芯片使用流程图如图4所示。
在进行弹性模量测量前，使用精密注射泵将不含细胞的液体以一定流速注入芯片，并且使用外部压差传感器测量挤压区在不同流速下的精确压降值。
随后，使用精密注射泵或压力泵向微流体芯片通入含有待测细胞的悬浮液，并使用显微成像系统记录微通道处的细胞变形。
如图5a所示，当含有待测活细胞的悬浮液由外部精密注射泵以一定流量从芯片入口流入主通道时，由于芯片中细胞沿流线流动，处于通道中部的大部分细胞将沿流线流至挤压区的微通道处，而个别细胞会沿着通道壁面流至分流通道入口。
当细胞到达分流通道入口处时，由于入口处4微米的微通道宽度远小于细胞直径，细胞不易发生变形并无法进入分流通道，如图5b所示。
该细胞随后会在流体的作用下继续流到下游的挤压区，当细胞流至挤压区微通道处，由于收缩通道的宽度小于细胞的直径，细胞将发生变形并进入微通道。
细胞在经过微通道后继续流向下游并从出口流出芯片。
通道中并列分布了40条微通道，在保证细胞可以高通量流过的同时确保可以通过显微成像系统同时观察到所有微通道。
微通道中的细胞变形情况由光学显微镜记录并获得量化的细胞变形数据。
得益于多条并列微通道以及侧面分流通道的分流，当挤压区的微通道因挤压细胞而被堵塞时，该堵塞对整个通道的流阻影响十分微小，因此挤压区的微通道在挤压细胞的过程中压降基本保持不变。
基于上述测量得到的微通道压差和细胞变形量计算细胞弹性模量。以等截面积的圆管半径表示挤压区各个微通道的半径其中h和w分别表示通道高度和宽度。通过显微成像系统获得待测细胞在收缩通道的伸长量。然后，结合收缩通道的压差，利用细胞幂律模型变形公式计算弹性模量，其中为收缩通道系数，RP为通道半径，ΔP为通道压力差，L为细胞伸长量，α为幂律指数，AJ为剪切模量。当变形时间t＝t0＝1s，细胞的弹性模量AG可以根据公式计算获得。最终，通过收缩通道的每个细胞的弹性模量都会被测量。
如图6a所示，随着细胞不断流入挤压区，并列的微通道上一直有数个细胞在变形伸长。其中每个细胞的变形图像都将被提取并测量细胞伸长量L随时间的变化，如图6b和6c所示。最后，根据细胞幂律模型变形公式 细胞变形数据被用于拟合并获得细胞的弹性模量(如图6c中实线所示)。