一种大气污染物导致的心脏毒性评价方法
阅读说明：本技术 一种大气污染物导致的心脏毒性评价方法 (Method for evaluating cardiotoxicity caused by atmospheric pollutants ) 是由 洪敏� 魏丽萍 吴伟娜 段怀龙 刘兵 李青梅 戴敏 于 2020-05-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种非治疗目的的大气污染物导致的心脏毒性评价方法,其包括检测离子通道的功能以评价心脏毒性的步骤。本发明所述的心脏毒性评价方法操作简单、快速、效率高、通量高、可重复性好、样品用量小,能够获知对于心脏电生理的影响,特别适用于心肌细胞功能的评价。(The invention discloses a method for evaluating cardiotoxicity caused by atmospheric pollutants for non-therapeutic purposes, which comprises the step of detecting the function of an ion channel to evaluate the cardiotoxicity. The cardiotoxicity evaluation method provided by the invention is simple and rapid to operate, high in efficiency, high in flux, good in repeatability and small in sample dosage, can know the influence on the heart electrophysiology, and is particularly suitable for evaluating the function of the myocardial cells.)
技术领域
本发明属生物医学领域，具体涉及一种大气污染物特别是PM2.5污染物导致的心脏毒性评价方法。
背景技术
大气污染物包括人类活动或自然过程排入大气的并对人和环境产生有害影响的那些物质。PM2.5(Particulate Matter 2.5)是其中工业生产和日常生产中产生的直径小于等于2.5μm的颗粒污染物。国际标准如National Ambient Air Quality Standards(NAAQS)将PM2.5作为常规大气污染监测的标志物。由于其体积较小，PM2.5能透过肺泡区域吸收入血，从而导致系统毒性。大量的流行病学和动物研究表明PM2.5存在多种毒作用。国内外均有报道显示PM2.5可导致人体出现心脏毒性。近年来，有一些研究旨在探讨其心脏毒性的机制，结果显示PM2.5可以导致氧化应激(ROS)、功能变化、以及其他的细胞学损伤(参考文献：Wang,H.,et al.,Cardiotoxicity and Mechanism of Particulate Matter 2.5(PM2.5)Exposure in Offspring Rats During Pregnancy.Med Sci Monit,2017.23:p.3890-3896)。但是这些技术手段有些采用活体动物实验，其成本高、效率低、样品用量大；有些采用体外细胞培养评价其活性的影响，其培养时间较长、评价指标相对简单、仅局限于心肌细胞损伤、对于心肌功能的探讨不足，特别是不能获知对于心脏电生理的影响。因此急需寻求一种大气污染物特别是PM2.5污染物导致的心脏毒性评价方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的大气污染物(例如PM2.5污染物)导致的心脏毒性的评价方法效率低、样品用量大、培养时间较长、评价指标相对简单、仅局限于心肌细胞损伤、对于心肌功能的探讨不足特别是不能获知对于心脏电生理的影响等缺陷，提供了一种大气污染物特别是PM2.5污染物导致的心脏毒性评价方法及其应用。本发明所述的心脏毒性评价方法通过直接检测离子通道的功能来评价心脏毒性，操作简单、快速、效率高、通量高、可重复性好、样品用量小，能够获知对于心脏电生理的影响，特别适用于心肌细胞功能的评价。
大气污染物(例如PM2.5污染物)导致的心脏毒性与其他药物等导致的心脏毒性不同，其机制复杂，本领域一般采用体外心肌细胞培养等方式，通过活性变化评价大气污染物(例如PM2.5污染物)导致的心脏毒性，这些方式均存在操作时间长、评价指标相对简单、仅局限于心肌细胞损伤、对心肌功能的探讨不足、不能获知对于心脏电生理等缺陷。而本发明人经过大量实验，首次发现大气污染物特别是PM2.5污染物导致心脏毒性的分子机制，即本发明人首次发现了大气污染物特别是PM2.5污染物是通过影响离子通道的作用，进而导致心肌功能变化，产生了心脏毒性，因而使用电生理技术(例如膜片钳技术)来评价大气污染物特别是PM2.5污染物对于心脏的动作电位可能的影响，以评价大气污染物特别是PM2.5污染物导致的心脏毒性，克服了现有技术中大气污染物特别是PM2.5污染物导致的心脏毒性评价方法的不足。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种非治疗目的的大气污染物导致的心脏毒性评价方法，其包括检测离子通道的功能以评价心脏毒性的步骤。
较佳地，所述大气污染物为PM2.5污染物。
较佳地，所述离子通道为与心脏相关的离子通道。
较佳地，所述离子通道为钠离子通道、钾离子通道和/或钙离子通道。
较佳地，所述离子通道为钠离子通道Nav1.5和/或hERG钾离子通道。
较佳地，所述检测离子通道的功能通过电生理技术进行。
较佳地，所述检测离子通道的功能通过膜片钳技术进行。
更佳地，所述通过膜片钳技术进行为通过膜片钳技术检测表达了所述离子通道的细胞系进行，所述表达优选为外源表达或内源表达。
进一步更佳地，所述表达了所述离子通道的细胞系为表达了钠离子通道Nav1.5和/或hERG钾离子通道的HEK293细胞系。
较佳地，所述心脏毒性评价方法还包括所述大气污染物的样本采集、所述大气污染物的样本制备和/或所述大气污染物的样本的成分鉴定的步骤。
较佳地，所述检测之前还包括将所述大气污染物溶解的步骤，所述溶解为超声溶解，所述大气污染物的样本终浓度为10-300μg/mL，例如为30μg/mL或100μg/mL。本发明人在实验过程中发现，当样本终浓度在10μg/mL以下时，得不出IC50值，而在300μg/mL以上时，可能因为细胞破裂导致试验失败。
较佳地，检测所述离子通道的功能以获得所述大气污染物对于心脏电生理作用优选心肌细胞的动作电位的影响。
在本发明某一较佳实施例中，所述的心脏毒性评价方法包括以下步骤：(1)PM2.5样本的采集及样本制备；(2)PM2.5样本的成分鉴定；(3)采用膜片钳技术，分别在hERG-HEK293细胞系统和Nav1.5-HEK293细胞系统，评价参与动作电位的离子通道功能，计算IC50值，从而评价心脏毒性。
在本发明某一较佳实施例中，所述的心脏毒性评价方法包括以下步骤：(1)采用玻璃纤维滤膜、KB-1000微电脑颗粒物大流量采样器、QG-1000大流量PM2.5颗粒物切割器采集大气中的PM2.5样本；
(2)将采样的玻璃滤膜剪成小片，在超纯水中超声6次，每次超声30分钟，然后再采用12层无菌纱布过滤，最终的混悬液采用真空干燥制备成粉末；
(3)采用正己烷/丙酮提取液对制备好的PM2.5样本进行萃取，采用气质联用色谱DSQII-MS检测，萃取剩余样品采用硝酸/盐酸溶液在100℃下消化约2小时，采用ICP-MS7700电感耦合等离子体质谱检测其中的金属成分；
(4)采用Patchliner NPC1和Patch clamp Amplifier EPC10(HEKA,德国)分析系统对hERG-HEK293细胞的离子通道进行分析；
(5)采用Patchliner NPC16和Patch clamp Amplifier EPC10(HEKA,德国)分析系统对Na v1.5-HEK293细胞的离子通道进行分析；
(6)分析结束后进行峰值尾电流测定。每个细胞下的每个浓度样品重复三次。峰值尾电流百分比的计算采用PM2.5处理细胞的细胞峰值尾电流检测值除以不含PM2.5的细胞峰值尾电流检测值。
为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种筛选预防和/或治疗大气污染物导致的心脏毒性的药物的方法，其包括使用如本发明第一方面所述的心脏毒性评价方法来筛选药物的步骤。
较佳地，所述大气污染物优选为PM2.5污染物。
为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了离子通道在筛选预防和/或治疗大气污染物导致的心脏毒性的药物中的应用。
较佳地，所述大气污染物优选为PM2.5污染物。
较佳地，所述离子通道为与心脏相关的离子通道。
较佳地，所述离子通道为钠离子通道、钾离子通道和/或钙离子通道；所述钠离子通道优先为Nav1.5，所述钾离子通道优选为hERG钾离子通道。
较佳地，一般通过检测所述离子通道的功能在进行所述筛选，所述检测离子通道的功能(通常是以获得所述大气污染物对于心脏电生理作用优选心肌细胞的动作电位的影响)主要可以通过使用电生理技术进行，例如通过膜片钳技术进行。所述通过膜片钳技术进行优选为通过膜片钳技术检测表达了所述离子通道的细胞系进行，所述表达优选为外源表达或内源表达。所述表达了所述离子通道的细胞系优选为表达了钠离子通道Nav1.5和/或hERG钾离子通道的HEK293细胞系。其中，所述检测之前还包括将所述大气污染物溶解的步骤，所述溶解为超声溶解，所述大气污染物的样本终浓度为10-300μg/mL，例如为30μg/mL或100μg/mL。
为了解决上述技术问题，本发明第四方面提供了表达了离子通道的细胞系在筛选预防和/或治疗大气污染物导致的心脏毒性的药物中的应用。
较佳地，所述大气污染物优选为PM2.5污染物。
较佳地，所述离子通道为与心脏相关的离子通道。
较佳地，所述离子通道为钠离子通道、钾离子通道和/或钙离子通道；所述钠离子通道优先为Nav1.5，所述钾离子通道优选为hERG钾离子通道。
更佳地，所述表达了离子通道的细胞系为表达了Nav1.5和/或hERG钾离子通道的HEK293细胞系。
较佳地，一般通过检测所述离子通道的功能在进行所述筛选，所述检测离子通道的功能(通常是以获得所述大气污染物对于心脏电生理作用优选心肌细胞的动作电位的影响)主要可以通过使用电生理技术进行，例如通过膜片钳技术进行。所述通过膜片钳技术进行优选为通过膜片钳技术检测表达了所述离子通道的细胞系进行，所述表达优选为外源表达或内源表达。所述表达了所述离子通道的细胞系优选为表达了钠离子通道Nav1.5和/或hERG钾离子通道的HEK293细胞系。其中，所述检测之前还包括将所述大气污染物溶解的步骤，所述溶解为超声溶解，所述大气污染物的样本终浓度为10-300μg/mL，例如为30μg/mL或100μg/mL。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的心脏毒性评价方法通过直接检测离子通道的功能来评价心脏毒性，操作简单、快速、效率高、通量高、可重复性好、样品用量小，能够获知对于心脏电生理的影响，特别适用于心肌细胞功能的评价。
附图说明
图1显示了PM2.5样本对HEK293细胞中Nav1.5钾钠通道的抑制作用的结果图。细胞的峰值尾电流百分比＝加入PM2.5样本的峰值尾电流÷未见PM2.5的峰值尾电流。采用GraphPad Prism 5.0计算半数抑制浓度IC50。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例污染区和非污染区PM2.5样本的心脏毒性评价
1、实验样本
采用Whatman玻璃纤维滤膜(Whatman，英国)、KB-1000微电脑颗粒物大流量采样器(青岛金仕达电子科技有限公司)和QG-1000大流量PM2.5颗粒物切割器(青岛金仕达电子科技有限公司)采集PM2.5样本。将嘉定区和杨浦区分别作为污染区和非污染区进行采样。
2、样本保存和制备
样品在分析前保存于-20℃避光条件下。将采样的玻璃滤膜剪成小片，在超纯水中超声6次，每次超声30分钟，然后再采用12层无菌纱布过滤，最终的混悬液采用真空干燥制备成粉末。
3、PM2.5成分鉴定
采用正己烷/丙酮提取液对制备好的PM2.5样本进行萃取，采用气质联用色谱DSQII-MS(Thermo Fisher，美国)检测，萃取剩余样品采用硝酸/盐酸溶液在100℃下消化约2小时，采用ICP-MS7700电感耦合等离子体质谱(Agilent，美国)检测其中的金属成分。
4、hERG(human Ether-a-go-go Related Gene)离子通道(一种与心脏钾外流相关的离子通道)和Nav1.5离子通道(一种与心脏钠内流相关的离子通道)的检测。采用Patchliner NPC16(Nanion，德国)和Patch clamp Amplifier EPC10(HEKA，德国)分析系统对hERG-HEK293细胞(购自(S.A.R.L CREA-CELL)和Nav1.5-HEK293细胞(制备方法见Cummins TR；Aglieco F；Renganathan M；Herzog RI；Dib-Hajj SD；Waxman SG."Nav1.3sodium channels:rapid repriming and slow closed-state inactivation displayquantitative differences after expression in a mammalian cell line and inspinal sensory neurons."journal of neuroscience the official journal of thesociety for neuroscience21.16(2001):5952.)的离子通道进行分析。本试验中，首先将PM2.5样本超声溶解至细胞外液(其组成包括140mmol/L NaCl,4.5mmol/L KCl,1mmol/LMgCl2,10mmol/L CaCl2,2mmol/L HEPES,和10mmol/L葡萄糖并且使用2mol/L NaOH调整pH至7.2～7.4)中，使得终浓度为10、30、100、300μg/mL。每次分析时加入2mL待测样品至Nav1.5-HEK293细胞和hERG-HEK293cells中，进行峰值尾电流测定。每个细胞下的每个浓度样品重复三次。峰值尾电流百分比的计算采用PM2.5处理细胞的细胞峰值尾电流检测值除以不含PM2.5的细胞峰值尾电流检测值。
5、所得结果
(1)污染区和非污染区PM2.5样本的主要化学成分存在一定的差异，污染区空气PM2.5中PAH(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，多环芳烃)、金属成分、特别是无机盐离子的浓度均高于非污染区样本。两个区域里面的各成分占比基本一致，丰度最高的PAH、金属成分、无机盐离子分别为荧蒽、铝/锰、硝酸根离子。
(2)hERG-HEK293细胞系检测结果如表1所示，表中显示，在10μg/mL到300μg/mL的PM2.5浓度范围内，来源于污染区的样本可导致hERG-HEK293细胞上的hERG钾通道出现浓度依赖性的抑制作用，在300μg/mL可达到约50％抑制作用，来源于非污染区的样本对于hERG钾通道没有抑制作用。
表1 PM2.5样本对HEK293细胞中hERG钾通道的抑制作用
数据以三个重复样本的均值±标准差表示。
(3)Nav1.5-HEK293细胞系检测结果如图1所示。图中显示，污染区来源和非污染区来源的PM2.5样品均可抑制Nav1.5钠通道。在10μg/mL到1000μg/mL的浓度下，污染区和非污染区来源样品对于Nav1.5钠通道的抑制IC50分别为90μg/mL和200μg/mL。污染区样品的抑制作用为非污染区的两倍以上。
综合分析，污染区和非污染区PM2.5样本对于离子通道的不同作用，其原因可能是PAH、金属成分、以及无机盐离子成分的差异所致，特别是污染区样本中金属成分的浓度明显高于非污染区，有两倍的差异。
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