信号放大量子点荧光免疫探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 信号放大量子点荧光免疫探针及其制备方法和应用 (Signal amplification quantum dot fluorescence immunoassay probe and preparation method and application thereof ) 是由 陈竹 吴才桂 陈一凡 陈永晨 张海龙 于 2021-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种信号放大量子点荧光免疫探针的制备方法,包括以下步骤：利用缩合剂将羧基量子点荧光微球活化,加入亲和素、酪蛋白进行反应,形成量子点荧光微球-亲和素复合物；连接活化生物素和抗体,得到生物素化抗体；将生物素化抗体和量子点荧光微球-亲和素复合物混合进行一次反应,加入量子点荧光微球-亲和素复合物,再加入生物素化抗体进行二次反应,多次循环标记,制得信号放大的量子点荧光免疫探针。还公开了该制备方法制得的信号放大量子点荧光免疫探针及其在荧光免疫检测中的应用。通过上述方法制得的探针,荧光标记物和抗体充足,结构稳定,用于免疫检测具有捕获能力强、灵敏度高和线性宽等特点。(The invention discloses a preparation method of a signal amplification quantum dot fluorescence immunoassay probe, which comprises the following steps: activating the carboxyl quantum dot fluorescent microspheres by using a condensing agent, adding avidin and casein to react to form a quantum dot fluorescent microsphere-avidin compound; connecting the activated biotin and the antibody to obtain a biotinylated antibody; mixing the biotinylated antibody and the quantum dot fluorescent microsphere-avidin compound for primary reaction, adding the quantum dot fluorescent microsphere-avidin compound, adding the biotinylated antibody for secondary reaction, and circularly labeling for multiple times to obtain the quantum dot fluorescent immune probe with amplified signals. Also discloses a signal amplification quantum dot fluorescence immunoassay probe prepared by the preparation method and application thereof in fluorescence immunoassay. The probe prepared by the method has sufficient fluorescent markers and antibodies, has stable structure, and has the characteristics of strong capture capacity, high sensitivity, wide linearity and the like when being used for immunodetection.)
技术领域
本发明涉及免疫快速分析技术领域，特别是涉及一种信号放大量子点荧光免疫探针 及其制备方法和应用。
背景技术
免疫标记技术是指用可显色发光的物质作为指示剂，通过共价或非共价键标记抗原 或抗体进行抗原抗体反应，借助荧光分析仪、酶联免疫分析仪、灰度检测仪器等仪器对实验结果进行定性定量测定。痕量分析化学方面产生了重大突破，将放射性同位素示踪 与免疫反应相结合建立了放射免疫分析法。此后免疫检测技术不断发展并突破，如酶联 免疫吸附法、胶体金免疫层析法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定。
由于原理不同，上述不同的标记技术，有各自的缺陷。例如胶体金标记蛋白过程，是一个被动吸附的过程，产生的探针不稳定且灵敏度较低；而酶标记则对环境要求高， 酶容易降解或失活；放射性同位素标记，则存在安全隐患，会对生物和环境造成危害。
目前，藻红蛋白、CY5、荧光微球等荧光标记探针已经广泛应用，且具有灵敏度高可定量等特点，但针对痕量物质时，该方法也存在难以检出的问题。因此市场对研发具 生物安全性高、灵敏度强且信号稳定的免疫标记方法和检测技术有进一步的要求。生物 素-亲和素系统是应用较多一种反应放大系统，其超高亲和力以及多级放大效应使免疫 标记和示踪分析技术更加灵敏。
公开号为CN112326953A的专利中提供了一种生物素化抗体制备方法，将醛基化的抗体和生物素定向交联，提高有效结合率，达成信号放大目的。然而该技术仅实现信 号的一次放大，信号强度提升有限。
公开号为CN102565383A的专利中所述的信号放大荧光探针为【荧光-生物素化抗体】-链霉亲和素-【荧光-聚赖氨酸-生物素】，其制备方法步骤相对复杂，需要生物素 标记两种物质。
因此亟需提供一种新型的信号放大量子点荧光免疫探针来解决上述问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种信号放大量子点荧光免疫探针及其制备方 法和应用，制得的探针荧光标记物和抗体充足，结构稳定，用于免疫检测具有捕获能力强、灵敏度高和线性宽等特点。
为解决上述技术问题，本发明采用的第一个技术方案是：提供一种信号放大量子点 荧光免疫探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用缩合剂将羧基量子点荧光微球活化，加入亲和素、酪蛋白进行反应，形 成量子点荧光微球-亲和素复合物；
(2)连接活化生物素和抗体，得到生物素化抗体；
(3)将所述生物素化抗体和所述量子点荧光微球-亲和素复合物混合进行一次反应；
(4)向一次反应后的溶液中加入所述量子点荧光微球-亲和素复合物，再加入所述生物素化抗体进行二次反应，多次循环标记，制得信号放大的量子点荧光免疫探针。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)的具体步骤包括：
(101)向量子点溶液中加入缩合剂进行活化，混匀超声分散5—20s，振荡反应10—30min；
(102)向步骤(101)得到的溶液中加入亲和素，偶联反应0.5—3h；
(103)向步骤(102)得到的溶液中加入封闭液，常温反应0.5—2h；
(104)将步骤(103)离心后的沉淀用保存液复溶，得到量子点-亲和素复合物。
进一步的，所述缩合剂采用N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺、NN’-羰基二咪唑、4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐中的一种或 两种以上的混合物。
进一步的，所述封闭液为pH6—8、含质量分数0.5—2％酪蛋白和0.01—1％吐温20的5—200mM PBS。
进一步的，所述保存液为pH 6.5—7.8、含0.5—5％牛血清白蛋白、5—30％海藻糖、 0.5—5％聚乙烯吡咯烷酮K30和0.1—5％吐温20的10—200mM PBS。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)的具体步骤为：
向含活化生物素的缓冲液中加入抗体，生物素和抗体的摩尔质量比是20：1—1：1，在透析袋中反应6—12h，得到生物素化的抗体。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)的具体步骤为：
将生物素化抗体和量子点荧光微球-亲和素复合物按1:0.1—1:2的比例进行混合， 反应1—8h。
为解决上述技术问题，本发明采用的第二个技术方案是：提供一种如上所述的制备 方法制得的信号放大量子点荧光免疫探针。
通常的量子点荧光探针制备过程，量子点和抗体之间只标记一次；本发明建立在生 物素与亲和素能够高亲和力结合的基础上：将荧光量子点标记亲和素，生物素标记抗体， 第一步就形成了量子点-亲和素-生物素-抗体这种复合结构，第二步先后加入量子点-亲 和素和生物素-抗体，形成(量子点-亲和素-生物素-抗体)-(量子点-亲和素-生物素-抗体)复合物，如此循环标记，达到荧光探针信号增强的目的。
为解决上述技术问题，本发明采用的第三个技术方案是：提供一种如上所述的制备 方法制得的信号放大量子点荧光免疫探针在荧光免疫检测中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明在生物素与亲和素能够高亲和力结合的基础上，将生物素与亲和素逐级叠加结合，不仅能提高探针的信号强度，同时也增加了探针的捕获能力，其灵敏度和 线性性能得到极大的提高，通过本发明所述方法制得的探针，荧光标记物和抗体充足， 结构稳定，用于免疫检测具有捕获能力强、灵敏度高和线性宽等特点；
(2)本发明利用生物素和亲和素的高亲和力特性，以多次循环放大标记实现荧光免疫探针的信号放大，基于该发明结合全自动免疫分析仪器，可开发出一种新模式的免 疫诊断试剂。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本 领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：胃泌素17(G-17)量子点免疫荧光层析试剂盒的制备，包括以下步骤：
(1)G-17荧光探针的制备：
a.向10mg量子点微球加入1ml的吗啉乙磺酸缓冲液(0.05M pH 5.5),再加入N- 羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺至终浓度为5mM，于室温避光 振荡30min，得到活化的量子点微球；
b.用50mM pH 6.5的磷酸缓冲液洗涤活化的量子点微球，取3mg的亲和素与其充分混匀，于室温避光振荡2h，反应结束后加入终浓度为1％的酪蛋白和0.05％吐温20， 对其剩余的活性位点进行封闭，于室温避光振荡1h，完成后，用0.02M pH 7.4含1％BSA 的PBS缓冲液洗涤，并重悬得到3mg/ml量子点-亲和素复合物，4℃待用；
c.将胃泌素17检测抗体3mg用0.1M pH 8.0的碳酸氢钠缓冲液在在透析袋中透析12h；向透析过的胃泌素17检测抗体加入N-羟基琥珀酰亚胺生物素至终浓度0.12mg/ml 在室温下搅拌反应6h，再加入9.6ul 1M的氯化铵，并搅拌15min；在4℃用PBS透析 12h，移除游离的生物素，收集透析过的液体，得到1.5mg/ml的生物素化胃泌素17抗 体，4℃待用；
d.取步骤b溶液0.1ml和步骤c溶液0.2ml进行混合，于室温搅拌反应3h，得到 荧光探针；
e.取步骤b溶液0.1ml加入到步骤d中，再加入步骤c溶液0.2ml进行二次标记， 于室温搅拌反应3h，得到荧光探针；
f.取步骤b溶液0.1ml加入到步骤e中，再加入步骤c溶液0.2ml，进行三次标记， 于室温搅拌反应3h，得到信号加强的G-17荧光探针。
(2)标记垫制备：
用0.02M pH 7.4含1％BSA的PBS缓冲液将信号加强的荧光探针稀释10倍后按5ul/cm的参数将其喷涂在玻璃纤维膜上，于恒温干燥箱37℃避光干燥6小时；
(3)固定相制备：
将胃泌素17捕获抗体用包被缓冲液稀释至1.5mg/ml，质控抗体稀释至1.0mg/ml，采用BIODOT公司的XYZ3060将其按1ul/cm的量包被在颇尔120硝酸纤维素膜的检 测区和质控区后，于恒温干燥箱37℃避光干燥6小时；其中所述包被缓冲液的组成为： 0.02M磷酸盐缓冲液+2％的海藻糖。
(4)样品垫制备：
用处理缓冲液浸泡玻璃纤维膜0.5h后，于恒温干燥箱37℃避光干燥6小时，处理缓冲液为0.02M pH 7.4含1％BSA和0.2％吐温20的PBS；
(5)试纸条的装配：
在10万级别洁净干燥间中将上述标记垫、固定相、样品垫、吸水垫、背衬板进行 搭配组装，用斩切机裁切为4mm的宽度，装入卡壳中待用。
对比例1：
(1)G-17荧光探针的制备：
a.向10mg量子点微球加入1ml的吗啉乙磺酸缓冲液(0.05M pH 5.5),再加入N- 羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺至终浓度为5mM，于室温避光 振荡30min，得到活化的量子点微球；
b.用50mM pH 6.5的磷酸缓冲液洗涤活化的量子点微球，取3mg胃泌素17检测抗与其充分混匀，于室温避光振荡2h，反应结束后加入终浓度为1％的酪蛋白和0.05％吐 温20，对其剩余的活性位点进行封闭，于室温避光振荡1h，完成后，用0.02M pH 7.4含 1％BSA的PBS缓冲液洗涤，并重悬得到3mg/ml的G-17量子点荧光探针，4℃待用；；
(2)标记垫制备：
用0.02M pH 7.4含1％BSA的PBS缓冲液将信号加强的荧光探针稀释10倍后按5ul/cm的参数将其喷涂在玻璃纤维膜上，于恒温干燥箱37℃避光干燥6小时；
(3)固定相制备：
将胃泌素17捕获抗体用包被缓冲液稀释至1.5mg/ml，质控抗体稀释至1.0mg/ml，采用BIODOT公司的XYZ3060将其按1ul/cm的量包被在颇尔120硝酸纤维素膜的检 测区和质控区后，于恒温干燥箱37℃避光干燥6小时；其中所述包被缓冲液的组成为： 0.02M磷酸盐缓冲液+2％的海藻糖。
(4)样品垫制备：
用处理缓冲液浸泡玻璃纤维膜0.5h后，于恒温干燥箱37℃避光干燥6小时，处理缓冲液为0.02M pH 7.4含1％BSA和0.2％吐温20的PBS；
(5)试纸条的装配：
在10万级别洁净干燥间中将上述标记垫、固定相、样品垫、吸水垫、背衬板进行 搭配组装，用斩切机裁切为4mm的宽度，装入卡壳中待用。
对比例1和实例1的区别在于，标记步骤不同，对比例1没有采用该信号放大的步骤，仅仅用量子点微球共价标记胃泌素17的抗体；将实例1和对比例1用胃泌素17 的校准品进行检测，检测数据如表1。
表1对比例1和实例1荧光信号值比较
由表1数据可知，本发明实例1灵敏度显著得到提高，且线性更好 y＝445.99x+1696.9，R2＝0.995，对比例线性方程为y＝139.67x+1088，R2＝0.9338。
重复性实验：将3份阳性样本在同一时间段测定20次，计算变异系数(批内)； 连续制作3批荧光探针，分别测定3份阳性样本10次，计算变异系数(批间)，由结 果知，批内和批间的变异系数均小于10％，表明该荧光探针应用于免疫层析试剂的重 复性好。
表2批内重复性
稳定性实验：将试剂(实例1)密封保存在37℃烘箱放置14天，与常温放置的试剂平行检测3份阳性样本和1份阴性样本，结果显示检测结果均未发现改变，表明该探针荧 光稳定性好。
表3实例1稳定性实验
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明 说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
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