一种全量组织免疫荧光方法和应用
阅读说明：本技术 一种全量组织免疫荧光方法和应用 (Full-tissue immunofluorescence method and application ) 是由 许佳祺 李全林 周平红 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种全量组织免疫荧光方法和应用,属于组织免疫荧光技术领域。该免疫荧光方法包括获取待荧光染色的全量组织,甲醛固定液固定过夜后进行免疫荧光染色,其中全量组织来源于经心脏灌注后的实验小鼠。本发明通过对小鼠心脏灌注后获取的全量组织进行免疫荧光染色,有效冲洗血管中残留的血细胞,减少非特异性染色和血管内免疫细胞对染色结果的干扰,可实现细胞立体化观察,避免计数不准确和观察不确切的缺陷,克服传统免疫荧光染色无法对分布稀疏和胞体较大的细胞有效观察和计数的问题。(The invention discloses a full-tissue immunofluorescence method and application, and belongs to the technical field of tissue immunofluorescence. The immunofluorescence method comprises the steps of obtaining the total tissue to be subjected to fluorescent staining, fixing the tissue overnight by formaldehyde fixing solution, and then carrying out immunofluorescence staining, wherein the total tissue is derived from an experimental mouse subjected to heart perfusion. According to the invention, the immunofluorescence staining is carried out on the whole amount of tissues obtained after the heart of the mouse is perfused, so that the residual blood cells in the blood vessel are effectively washed, the interference of nonspecific staining and immune cells in the blood vessel on staining results is reduced, the three-dimensional observation of the cells can be realized, the defects of inaccurate counting and inaccurate observation are avoided, and the problem that the traditional immunofluorescence staining cannot effectively observe and count the cells with sparse distribution and large cell bodies is solved.)
技术领域
本发明属于组织免疫荧光技术领域，具体涉及一种全量组织免疫荧光方法和应用，特别用于立体化观察组织中不同细胞群体的空间分布和计数。
背景技术
既往小鼠组织的免疫荧光染色基于薄切片(2–3μm)的组织，对于横截面小的组织(例如食管)，切片对应的组织量有限，因此这种传统方法对于分布稀疏或者胞体较大的细胞难以有效获得满意的染色结果，所切平面通常难以捕捉目的细胞，以及无法对于该平面中的细胞进行有效计数。此外，对于免疫细胞而言，血管内红细胞的非特异性染色会对荧光造成干扰，血管内染色的免疫细胞也需要排除，而传统的方法通常为处死小鼠后获取组织，血液停滞在血管中，无法避免上述缺陷。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种全量组织免疫荧光方法，通过减少动物血管内血细胞对染色影响，无需切片处理获取经心脏灌注后的全量组织，实现对组织内分布稀疏和胞体较大的细胞进行有效观察和计数。
本发明的另一目的是提供上述立体化组织免疫荧光方法在细胞立体化观察中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种全量组织免疫荧光试剂盒，包括封闭液、清洗液、一抗稀释液、二抗稀释液、DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)荧光染料和抗淬灭封片剂；其中：
所述封闭液含10％BSA和0.5％triton；
所述清洗液为含0.5％triton的PBS溶液；
所述一抗稀释液为含5％BSA和0.5％triton的PBS溶液，所述二抗稀释液为含2.5％BSA和0.5％triton的PBS溶液。
本发明提供上述全量组织免疫荧光试剂盒在消化道肠神经元或免疫细胞立体化观察中的应用。
优选地，所述消化道肠神经元为食管肠肌层神经元，或所述免疫细胞为巨噬细胞。
本发明还提供了一种全量组织免疫荧光方法，包括如下步骤：
(1)获取待荧光染色的全量组织，4％甲醛固定液固定过夜；
(2)全量组织荧光染色：通过所述全量组织免疫荧光试剂盒对上述固定后的全量组织进行荧光染色，步骤如下：
(a)用含0.5％triton的PBS溶液清洗3遍，每次30min；
(b)用含10％BSA和0.5％triton的封闭液室温封闭2小时；
(c)用含0.5％triton的PBS溶液清洗3遍，每次30min；
(d)用含5％BSA和0.5％triton的PBS溶液稀释一抗，4度冰箱孵育一抗过夜；
(e)用含0.5％triton的PBS溶液清洗3遍，每次30min；
(f)用含2.5％BSA和0.5％triton的PBS溶液稀释二抗，室温避光孵育2小时；
(g)用含0.5％triton的PBS溶液清洗3遍，每次30min；
(h)用DAPI即用染液，室温避光孵育20min；
(i)用含0.5％triton的PBS溶液清洗3遍，每次30min；
(j)将处理后的全量组织取出平铺展开于载玻片上，晾干水分，滴加抗淬灭封片剂封片，避光保存；
其中，所述全量组织来源于经心脏灌注后的实验小鼠。
优选地，所述全量组织为消化道肠神经元或免疫细胞。
优选地，所述全量组织的获取方法包括对小鼠进行包含固定、解剖和左心室灌注的步骤，具体为：小鼠腹腔注射剂量为20mg/kg的阿佛丁麻醉，起效后迅速将小鼠四肢固定，逐层打开腹腔，从胸骨角后打开膈肌进入胸腔，向两侧打开胸腔，充分分离后用血管钳夹住胸骨角向上翻起，暴露心脏；用头皮针插入心尖，右手固定头皮针防止滑脱，左手用眼科剪剪开右心耳，头皮针接20ml注射器，缓慢推注20ml生理盐水，肝脏颜色逐渐由红转白后继续灌注10ml 4％的多聚甲醛，小鼠尾巴僵直翘起，结束。
本发明还提供了上述全量组织免疫荧光方法在细胞立体化观察中的应用。
优选地，所述细胞为消化道肠神经元或免疫细胞。
更优选地，所述消化道肠神经元为食管肠肌层神经元，所述免疫细胞为巨噬细胞。
优选地，所述细胞立体化观察包括观察不同细胞群体的空间分布和计数。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的全量组织免疫荧光方法通过对心脏灌注后的全量组织进行免疫荧光染色，利用心脏对组织器官的供血通路，从左心室注射的生理盐水和固定液可以深达组织毛细血管，有效冲洗血管中残留的血细胞，减少非特异性染色和血管内免疫细胞对染色结果的干扰。
(2)本发明利用triton的渗透作用对整块组织进行全量染色，最大程度获取目的细胞并通过共聚焦多层扫描，实现细胞立体化观察，避免计数不准确和观察不确切的缺陷，克服传统免疫荧光染色无法对分布稀疏和胞体较大的细胞有效观察和计数的问题。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点会变得更显著：
图1是(a)传统的切片组织免疫荧光染色：可计数神经元稀少无法比较；(b)本发明：多层叠加后神经元可计数。
图2是(a)传统的切片组织免疫荧光染色：巨噬细胞形态不完整，非特异性染色强；(b)本发明：巨噬细胞足突样形态。
图3是实验小鼠心脏灌注获取全量组织的过程图片，其中：(1)固定；(2)解剖；(3)指示左心耳；(4)左心室灌注；(5)灌注成功后肝脏发白；(6)灌注固定液时翘尾巴。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中以食管肠肌层神经元和巨噬细胞为例进行说明。
实施例1
本实施例对实验小鼠进行心脏灌注后获取全量组织(如图3所示)，步骤如下：
1、灌注
小鼠用他莫昔芬给药后第7天，腹腔注射剂量为20mg/kg的阿佛丁麻醉，起效后迅速将小鼠四肢固定，逐层打开腹腔，从胸骨角后打开膈肌，进入胸腔，向两侧打开胸腔，充分分离后用血管钳夹住胸骨角向上翻起，暴露心脏。用头皮针插入心尖，右手固定头皮针防止滑脱，左手用眼科剪剪开右心耳。头皮针接20ml注射器，缓慢推注20ml生理盐水，此时可见肝脏颜色逐渐由红转白，提示灌注有效。生理盐水灌注后继续灌注10ml 4％的多聚甲醛，此时可见小鼠尾巴僵直翘起，提示固定有效。
2、取材
灌注固定结束后，沿着胃找到食管，充分分离食管，分别在食管中段和胃底剪断食管和胃。用生理盐水清洗食管和胃内容物，纵向剪开管腔，用大头针固定头端和尾端，从一端分离肌层和黏膜层，肌层柔软，黏膜层较韧，找到组织间隙后沿纵轴将肌层从黏膜层撕下来，得到的肌肉组织迅速放进4％甲醛固定液中固定。
实施例2
对实施例1获得的全量组织进行免疫荧光染色，步骤如下：
1)4％甲醛固定液固定过夜，用含0.5％triton的PBS溶液清洗3遍，每次30min；
2)用含10％BSA和0.5％triton的封闭液室温封闭2小时；
3)用含0.5％triton的PBS溶液清洗3遍，每次30min；
4)用含5％BSA和0.5％triton的PBS溶液稀释anti-mouse HuC/D和anti-mouseF4/80，稀释比例为1：400，4度冰箱孵育一抗过夜。
5)用含0.5％triton的PBS溶液清洗3遍，每次30min；
6)用含2.5％BSA和0.5％triton的PBS溶液稀释抗山羊二抗-488和抗大鼠-Cy3，稀释比例为1：300。室温避光孵育2小时。
7)用含0.5％triton的PBS溶液清洗3遍，每次30min；
8)用DAPI即用染液，室温避光孵育20min；
9)用含0.5％triton的PBS溶液清洗3遍，每次30min；
将组织取出平铺展开于载玻片上，使肌肉平行于载玻片平面，晾干水分，滴加抗淬灭封片剂，封片后避光保存。
对上述制作好的全量荧光染色组织片进行共聚焦多层扫描并融合，步骤为：打开染色所用二抗对应的激光，包括488、DAPI和Cy3。首先目镜观察组织片，检查染色情况，并在488激光条件下粗调焦距至神经元所在的位置和层面。用10倍镜预览模式观察，此时细调层面至神经元和巨噬细胞均高密度分布的层面，以此层面为中心，向上10um设为上界，向下10um设为下界，每隔1um扫描一次，扫描后融合图像，计数神经元数量和巨噬细胞数量，结果如图1和图2所示。
综上所述，本发明对于动物横截面较小的组织，需要对分布稀疏和胞体较大的细胞进行组织学研究时具有优于传统切片染色的优势，例如对消化道肠神经元、免疫细胞等研究具有使用价值。
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