具体实施方式

术语“羊抗鼠多克隆抗体”与羊抗鼠二抗、羊抗鼠IgG抗体可互换使用。

术语“酶”包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶。其中，辣根过氧化物酶所使用的底物为邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)，优选为四甲基联苯胺(TMB)；碱性磷酸酶所使用的底物为对-硝基苯磷酸酯(p-NPP)；β-D-半乳糖苷酶所使用的底物为4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷(4MUG)。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液为pH值7.4的PBS，其1L体积配方为：NaCl8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄0.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。羊抗鼠多克隆抗体可以商业上获得，也可以通过常规方法制备。

本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体联检测试剂盒原料的制备

1.1猪伪狂犬病病毒gD蛋白的制备及鉴定

按照CN105251000A专利制备PRVgD蛋白，用Ni亲和层析柱进行纯化后获得重组PRVgD蛋白，经SDS-PAGE鉴定于约50KDa处可见明显的蛋白条带，经分析纯度为94％；用BCA试剂盒测定蛋白含量，结果为5.6mg/ml。

1.2猪伪狂犬病病毒gE蛋白的制备及鉴定

1.2.1猪伪狂犬病病毒gE基因的扩增

在生长良好的PK15细胞上接种PRV HN1201株病毒(猪伪狂犬病病毒株为HN1201株(Pseudorabies virus，strain HN1201)，保藏号为CCTCC NO.V201311，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日，公开于CN105251000A)，收获病毒后用TAKARA公司MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.3.0试剂盒提取PRV基因组DNA。取1μl基因组DNA(gE基因组序列可参见PRV HN1201登录号：KP722022.1)作为模板，利用如下gE特异性引物：

gESF5′-GTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCG-3′

gESR5′-CGCCAGCACAAACAGCCGCCCG-3′

用HS DNA Polymerase和设计的特异性引物对gE片段进行PCR扩增，PCR反应程序为：98℃2min；98℃10s，60℃5s，72℃1min30s，30个循环；72℃10min。PCR产物命名为PRVgE。

1.2.2重组Bacmid的获取及鉴定

将高保真酶扩增获得的PCR产物PRVgE克隆至pFastBac/HBM-TOPO载体(购自Invitrogen公司)，克隆体系为：PCR产物PRVgE 4μl，盐溶液1μl，TOPO vector 1μl，共6μl。混合均匀，室温孵育5分钟，转化One ShotR Mach1TMT1R感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板，挑取单克隆鉴定gE基因的插入方向，插入方向正确的质粒送Invitrogen公司测序，鉴定gE序列的正确性，测序正确的质粒命名为pFastBac/HBM-TOPO-gE。

将pFastBac/HBM-TOPO-gE质粒转化DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen公司)，pFastBac/HBM-TOPO-gE和感受态细胞中的穿梭质粒Bacmid进行转座，用Invitrogen的PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提取获得的重组质粒，并用pUCM13Forward/Pucm13 Reverse引物鉴定gE的插入，阳性Bacmid命名为Bacmid-gE。

1.2.3转染获得重组杆状病毒

按照Invitrogen公司的Bac-to-bac HBM TOPO Secreted Expression System的说明书提供的方法进行。6孔板每孔铺8×10⁵个Sf9细胞，待细胞贴壁后按照Cellfectin II转染试剂的说明书进行转染：分别稀释8μl Cellfectin II和1μg Bacmid-gE DNA到100μlSF-900II培养基中，Vortex混匀，混合稀释后的DNA与稀释后的Cellfectin II(总体积至210μl)，混合均匀室温孵育15～30分钟，一滴滴加到细胞中。转染后72小时待出现细胞病变后，收集细胞培养上清，记为P0代重组病毒vBac-gE。P0代重组病毒vBac-gE感染Sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-gE用于重组蛋白表达。

1.2.4重组杆状病毒感染High-five细胞获得重组蛋白

将P3代重组杆状病毒vBac-gE接种High-five细胞(购自Invitrogen)。在500ml三角瓶中悬浮培养High-five细胞，至细胞密度达到7.0×10⁵cell/ml后，按照1MOI的量接种病毒，感染后72小时收取细胞培养上清。用Ni亲和层析柱纯化重组PRVgE蛋白，经SDS-PAGE鉴定于约62KDa处可见明显的蛋白条带，经分析纯度为93％；用BCA试剂盒测定蛋白含量，结果为12mg/ml。

1.3猪瘟病毒E2蛋白的制备及鉴定

按照CN105527442A专利制备猪瘟病毒E2蛋白，用Ni亲和层析柱进行纯化后获得重组CSFV E2蛋白，经分析纯度为90％；用BCA试剂盒测定蛋白含量，结果为2.5mg/ml。

1.4酶标抗体的制备及鉴定

1.4.1制备

采用改良过碘酸钠法对猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7、3B6以及猪伪狂犬病病毒gE单克隆抗体11H1、猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体15A9分别进行辣根过氧化物酶(HRP)的标记。称取20mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1ml超纯水中，加入1ml新鲜配制的NaIO₄溶液(30mg NaIO₄溶于1ml超纯水)，混匀，4℃避光作用30分钟；在上述溶液中加入40μl乙二醇，4℃避光作用30分钟；按照1mg纯化的单克隆抗体加100μl上述混合液的比例，将两者混匀后，加入到透析袋中，混匀，用CB缓冲液透析6小时。整个操作需避光进行；将透析后的混合液转移至1.5ml EP管中，加入10μl新鲜配制的NaBH₄溶液(20mg NaBH₄溶于1ml超纯水)，室温作用2小时，每隔30分钟混匀一次；加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后，4℃作用15分钟。12000转/分钟离心10分钟，弃上清。将沉淀用与纯化抗体等体积的PBS与甘油的混合液(V∶V＝1∶1)吹悬。

1.4.2鉴定

外观：室温下，为红棕色液体，未见絮状物沉淀。

质量评价：用紫外分光光度计检测酶标抗体在403nm和280nm的吸光值A。按照公式计算相应的酶参数：

酶量(mg/ml)＝A_403nm×0.4×稀释倍数。

IgG量(mg/ml)＝(A_280nm-A_403nm×0.3)×0.62×稀释倍数。

克分子比值(E/P)＝酶量×4/IgG量。

标记率＝A_403nm/A_280nm。

经过吸光值检测和计算，具体结果见表1：

表1不同酶标抗体的质量评价

酶标抗体5G7、3B6、11H1效价检测：将酶标抗体5G7、3B6、11H1分别用PBS稀释后，用间接免疫荧光IFA方法测定酶标抗体的IFA效价。其中，IFA检测方法：培养贴壁PK-15细胞，按照病毒感染复数MOI为0.005～0.1剂量分别接入含PRV HN1201株、Fa株、MA株的毒种，同时设健康细胞对照孔，37℃、5％CO₂条件下培养48～72小时后，弃上清；用80％的丙酮溶液于2～8℃固定30min，PBS洗3次，病毒接种孔和细胞对照孔分别加入100μl 1︰10稀释后再2倍倍比稀释，同时用PRV阳性血清加入病毒接种孔作阳性对照，37℃作用60分钟；用PBS洗3次并扣干；加入1︰500稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃作用60分钟；用PBS洗3次并扣干；加入50μl PBS后于荧光显微镜下观察。IFA效价判定：以可观察到黄绿色荧光的接毒细胞板孔对应的抗体最大稀释度作为抗体的IFA效价。结果(见表2)：酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7、3B6标记后对不同毒株的IFA效价均为1∶3200～1∶6400，部分比标记前略有下降；酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体11H1标记后对不同毒株的IFA效价为1∶3200～1∶6400。

表2不同酶标抗体的IFA效价测定

酶标抗体15A9效价检测：将酶标抗体15A9用PBS稀释后，用间接免疫荧光IFA方法测定酶标抗体的IFA效价(将猪瘟病毒CH-1R株参考上述方法制备IFA抗原板)。结果：酶标抗体15A9的IFA效价为1∶6400～1∶25600。

实施例2猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体二联检测试剂盒的制备

2.1点样液的配制

5％甘油溶液的配制：精密称定5.00g甘油置100ml容量瓶中，加少量纯化水轻轻旋转使其溶解充分，避免产生过多气泡，再加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；

5％山梨醇溶液的配制：精密称定5.00g山梨醇置250ml烧杯中，加适量纯化水并搅拌使其完全溶解，再完全转移至100ml容量瓶中，加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；

0.05％曲拉通溶液的配制：用移液枪量取50μl曲拉通置100ml容量瓶中，加适量纯化水使其完全溶解，再加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；

DMSO溶液：直接采用DMSO试剂即可；

PBS(pH6.8)溶液配制：先配置0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液，再将两者按照49.5:51的体积比进行混合，得到pH值为6.8的磷酸盐缓冲液；

将上述溶液按照10∶15∶0.1∶50∶100的体积比混合均匀，作为点样液。

2.2二联检试剂盒的制备

猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白二联检抗体检测芯片：用2.1制备的点样液将实施例1制备的猪伪狂犬病病毒gD蛋白稀释至适当浓度，作为检测点PRVgD点样液；用点样液将实施例1制备的猪伪狂犬病病毒gE蛋白稀释至适当浓度，作为检测点PRVgE点样液；用点样液将羊抗鼠多克隆抗体分别稀释至50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，作为质控点点样液，分别点样于图1中点1、2、3，设定3个浓度，是便于根据调试结果选择对应的质控点进行数据统计分析；将2.1制备的点样液作为空白对照点点样液点样于点4。开启点样仪，设定程序和点样参数，将检测点PRVgD点样液点样于点5、检测点PRVgE点样液点样于点6、质控点点样液点样于图1中的1、2、3、空白对照点点样液点样于图1中的4点样于图1中的指定位置。将已点样的膜取出置芯片底板中部，加上盖板压紧，两边卡上固定边条，组装成猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白二联检抗体检测芯片，封装，2～8℃保存。除点1、2、3、4分别固定于检测芯片的左上角、左下角、右下角、右上角外，点5、6可以分别点样于检测芯片其他任意位置，只需与其他点的边缘相距≥700μm，而任意点与点之间的最短距离也为≥700μm。质控品点1、质控品点2、质控品点3、空白对照点样点4到检测芯片亚单元上边缘、下边缘的距离≥8mm，到检测芯片亚单元左边缘、右边缘的距离≥5mm。

抗体联检试剂盒包括一个或多个猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片亚单元，由底端、上格栅、设置于其间由所述底端、上格栅夹紧的检测芯片组成独立的检测孔，所述一个检测孔对应于一个所述检测芯片亚单元，当所述抗体联检试剂盒包括多个猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片亚单元时，各个所述独立的检测芯片亚单元集成为微阵列芯片。图3显示了具有不同数量猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片亚单元的试剂盒，图3中O、P、Q分别为具有一个、三个、多个抗体检测芯片亚单元的试剂盒，其局部放大图显示了一个猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测芯片亚单元中检测芯片上的点样点。

酶标试剂：取PBS溶液、胎牛血清200ml混匀并补加PBS定容为1L作为酶标稀释液。将实施例1制备的酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7、3B6以及酶标记猪伪狂犬病病毒单克隆抗体11H1，用上述溶液按终体积0.05％V/V混匀，0.22μm过滤，无菌分装。

样品稀释液：含10％V/V胎牛血清、0.1％V/V吐温20、1％W/V BSA、0.05％～0.5％W/V Casein、1％W/V Proclin300的PBS溶液，0.22μm过滤，无菌分装。

洗涤液：含1％V/V吐温20的PBS溶液经0.22μm过滤，无菌分装。检测时用纯化水稀释20倍。

底物液：TMB(3,3′,5,5′-四甲联苯胺)溶液，商品化产品，无菌分装。

2.3检测方法建立

操作步骤如下：

(1)编号，将芯片孔按样品顺序编号。

(2)浸润，加洗涤液300μL/孔，浸润3分钟后弃液、拍干。

(3)加样，加样品稀释液50μL/孔后加待检样品50μL/孔，置恒温振荡孵育器37℃、500转/分钟温育30分钟；弃液，加洗涤液300μL/孔，浸泡30～60秒，弃液。反复洗涤5遍，最后一次拍干。

(4)加酶标试剂，加入酶标试剂100μl/孔，置恒温振荡孵育器37℃、500转/分钟温育30分钟；弃液，加洗涤液300μL/孔，浸泡30～60秒，弃液。反复洗涤5遍，最后一次拍干。

(5)显色，加入底物液100μL/孔，置37℃温育15分钟。

(6)测定，去芯片上盖后，将无尘纸置检测芯片上，轻轻按压，并于10分钟内用微孔盘芯片影像仪测定结果，导出S/N值(样品S值/质控点N值)。

试验有效性判定：质控点S值应≥6000、空白对照点S值应≤3000，否则试验无效，该判定通过内部数据处理分析系统自行完成。结果判定(该判定也通过内部一键式智能化数据处理分析系统自行完成，不需要技术人员再进行数据运算及统计分析)标准如下：

S/N比率的计算：S/N＝样品A值/阴性质控品A值(其中样品A值为样品检测灰度值；阴性质控品A值即某一质控点检测灰度值，该质控点根据该批调试时已标定的已知阴性阳性的样品的分析值与标准值符合情况优选而出。优选标准为已标定的已知阴性阳性的样品与三个质控品点1、2、3的灰度值比值计算的结果，与标准值及判定结果的吻合度最高的条件对应的质控品点)。

阳性判定S/N≤0.600时PRV gD、gE抗体为阳性；

阴性判定S/N＞0.700时PRV gD、gE抗体为阴性；

可疑0.600＜S/N≤0.700时PRV gD、gE抗体为可疑，需重新取样进行检测，若检测仍为可疑则判为阴性。

2.4猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白二联检抗体检测芯片蛋白包被量的确定

PRVgD阳性且PRVgE阴性、CSFV阴性的猪血清(简称P1)：经猪伪狂犬病病毒中和试验测定中和效价为1∶51.3；Biochek PRVgB试剂盒测定结果为阳性，S/P值2.393；经IDEXXPRVgE试剂盒测定结果为阴性，S/N值0.989；经IDEXX CSFV抗体检测试剂盒测定结果为阴性，阻断率为11％。

PRVgE阳性且PRVgD阳性、CSFV阴性的猪血清(简称P2)：经猪伪狂犬病病毒中和试验测定中和效价为1∶11.2；Biochek PRVgB试剂盒测定结果为阳性，S/P值1.152；经IDEXXPRVgE试剂盒测定结果为阳性，S/N值0.196；经IDEXX CSFV抗体检测试剂盒测定结果为阴性，阻断率为8％。

PRVgD阴性、PRVgE阴性、CSFV阳性的猪血清(简称P3)：经猪伪狂犬病病毒中和试验测定中和效价为＜1∶2；Biochek PRVgB试剂盒测定结果为阴性，S/P值0.126；经IDEXXPRVgE试剂盒测定结果为阴性，S/N值0.912；经IDEXX CSFV抗体检测试剂盒测定结果为阳性，阻断率为74％。

PRVgD阴性且PRVgE阴性、CSFV阴性的猪血清(简称N)：经猪伪狂犬病病毒中和试验测定中和效价＜1∶2；Biochek PRVgB试剂盒测定结果为阴性，S/P值0.191；经IDEXX PRVgE试剂盒测定结果为阴性，S/N值0.958；经IDEXX CSFV抗体检测试剂盒测定结果为阴性，阻断率为3％。

用上述血清选择猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白二联检抗体检测芯片蛋白抗原包被量，因本方法原理为酶联免疫阻断法，因而通过计算N/P值，并选择N/P值最大时对应的蛋白抗原包被条件，做为筛选最适蛋白抗原固相条件，详情如下：

2.4.1猪伪狂犬病病毒gD蛋白包被量的选择

按照实施例2.1所示将实施例1猪伪狂犬病病毒gD蛋白用点样液稀释至适当浓度，点样体积为20nl，使得点样于膜上的PRVgD蛋白的终含量分别如表3所示，其它均不变。用P1、N血清按照实施例2.2的方法进行检测，结果(见表3)：PRVgE包被量不变的情况下检测均为阴性(表3未体现)；N/P1在PRVgD包被量偏低时数值小，而在PRVgD包被量达到0.25ng/点以上时，数据明显提升，而N/P1值的大小对应该方法分辨阴性、阳性能力的高低，数据越大，则检测条件越适宜；当PRVgD蛋白的包被量为0.05～10ng/点时N/P1值为2.28～3.07均可满足检测，但当包被量为0.25～8ng/点时N/P1值略优(为3.27～3.74)，包被量为4.0ng/点时N/P1值为最优(为3.74)。

表3猪伪狂犬病病毒gD蛋白包被量优化结果

2.4.2猪伪狂犬病病毒gE蛋白包被量的选择

按照实施例2.1所示将实施例1猪伪狂犬病病毒gE蛋白用点样液稀释至适当浓度，点样体积为20nl，使得点样于膜上的PRVgE蛋白的终含量分别如表4所示，其它均不变。用P2、N血清按照实施例2.2的方法进行检测，结果(见表4)：N/P2值在PRVgD包被量不变的情况下检测结果无显著差异(表4未体现)；N/P2在PRVgE包被量偏低时数值小，而在PRVgE包被量达到0.1ng/点以上时，数据明显提升，而N/P2值的大小对应该方法分辨阴性、阳性能力的高低，数据越大，则检测条件越适宜。当PRVgE蛋白的包被量为0.02～8ng/点时N/P2值为1.98～2.18可满足检测，但当包被量为0.1～4ng/点时N/P2值略优(为3.50～4.56)，包被量为1.0ng/点时N/P2值为最优(为5.90)。

表4猪伪狂犬病病毒gE蛋白包被量优化结果

2.4.3猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白包被量的验证

为验证PRVgD、gE蛋白在检测自个对应抗体时是否存在交叉反应，选取背景清晰的且经商品化试剂盒检测的样品对猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白包被量进一步验证。根据上述试验结果，将猪伪狂犬病病毒gD蛋白按4ng/点、2ng/点及猪伪狂犬病病毒gE蛋白按2ng/点、1ng/点正交点样，以制备蛋白抗原板1～4(详见表5)。并对猪伪狂犬病活疫苗(Bartha株)免疫后血清3份、猪伪狂犬病病毒Fa株攻毒后PRVgDgE抗体均为阳性血清3份、猪伪狂犬病病毒HN1201株攻毒后PRVgDgE抗体均为阳性血清3份、特异性血清7份(包括PCV2阳性血清1份、CSFV阳性血清1份、PPV阳性血清1份、PRRSV阳性血清1份、健康猪血清1份、PRVgDgE阴性血清2份)，共16份分别检测，结果与标准符合为16/16即符合率为100％时对应的包被量为最佳包被量。结果(见表5)：蛋白抗原板1～4制备的试剂盒检测16份样品与商品化试剂盒或中和试验方法的结果一致，符合率均为100％。

表5不同类型蛋白抗原不同包被量制备试剂盒的评价结果

2.5酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体的选择

用试剂盒2制备的猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白二联检抗体检测芯片，再按照实施例2.1所示将实施例1酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5G7或3B6或5G7+3B6(见表6)稀释1∶500，与酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体11H1 1∶1000稀释液等体积混合。用P1、N血清按照实施例2.2的方法进行检测，结果(见表6)：3种酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体工作液相比以3B6检测的N/P1结果为最优，表明单克隆抗体3B6识别猪伪狂犬病病毒gD蛋白的表位与5G7识别的表位相比更有优势。后续试验将酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体、酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体11H1的1∶2000稀释混合液为酶标试剂。

表6酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体选择的结果

2.6样品稀释液的选择

将蛋白抗原板2、酶标试剂，连同表7配制样品稀释液，对N、P1、P2阳性进行检测，结果(见表7)：5种样品处理液处理样品后，相比而言样品处理液5处理样品后检测N/P1及N/P2的数值均最大，效果最佳。

表7不同样品稀释液的检测结果

为评价样品稀释液中Casein的含量，将其他成分保持不变，Casein含量调整为0.01％、0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、1.0％W/V以制备试剂盒并进行检测，结果：当样品处理液中所含Casein为0.01％时制备的试剂盒检测PRVgD抗体的灵敏度下降10～50倍；当样品处理液中所含Casein为1.0％时制备的试剂盒检测PRVgE抗体的灵敏度下降20倍；而当样品处理液中Casein含量为0.05％、0.25％、0.5％时制备的试剂盒检测灵敏度与样品稀释液5的结果相当，故而将样品稀释液中Casein的含量设定为0.05％～0.5％W/V。

2.7质控点

本发明试剂盒采用阻断法进行检测，阻断法是用优势表位对应抗体标记物进行阻断抗原抗体的反应，通过阻断的效应来评价待检抗体水平的高低。本发明采用单个检测孔中羊抗鼠多克隆抗体适宜浓度与单抗标记物的特异性反应，从而获得单个孔内反应的结果。

通过对羊抗鼠IgG不同浓度的大量筛选，筛选最适质控点点样量，以匹配猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测结果。为便于描述，挑选猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体分别为阳性和阴性的样品进行检测，这些样品经商品化试剂盒、中和试验共同确证抗体的阴阳性，通过计算各条件下检测点/质控点的比值(即S/N值)，对上述阳性和阴性的样品进行判定，筛选结果正确的条件方可作为最适条件的选择。同时分别计算猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体分别为阴性样品S/N值和阳性样品S/N值的比值(即N/P值)，筛选数值最大的条件作为最适条件。在同时满足上述两条件结果上选择最适质控点的点样量。检测结果(见表8)：试剂盒检测PRVgD抗体时羊抗鼠多克隆抗体为0.25～4ng/点时检测结果与检测标准吻合，检测PRVgE抗体时羊抗鼠多克隆抗体为0.5～4ng/点时检测结果与检测标准吻合。试剂盒检测PRVgD抗体时羊抗鼠多克隆抗体为1～4ng/点时计算N/P值结果为12.0～12.5，数值最大；检测PRVgE抗体时羊抗鼠多克隆抗体为1～4ng/点时计算N/P值结果为10.8～10.9，数值最大。即当羊抗鼠多克隆抗体为1～4ng/点时，匹配猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体检测结果最佳。

根据检测结果的匹配度，最终选择羊抗鼠多克隆抗体的最适条件为1～4ng/点，考虑更好的控制质控条件，避免点样量批间差异，特选择用1ng/点、2ng/点、4ng/点分别点样以作为质控点的点样量，并从中选取最佳质控点用于试剂盒最终判定方法的确认。

表8不同羊抗鼠多克隆抗体包被量的比较

注：阳性判定S/N≤0.600时PRV gD、gE抗体为阳性；阴性判定S/N＞0.700时PRVgD、gE抗体为阴性；可疑0.600＜S/N≤0.700时PRV gD、gE抗体为可疑，需重新取样进行检测，若检测仍为可疑则判为阴性。阻断法中N/P值越大越能准确区分阴性阳性、阳性样品。

为便于后续评价，将蛋白抗原板2(PRVgD蛋白4ng/点、PRVgE蛋白1ng/点)、酶标试剂(酶标记猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体、酶标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体11H1的终体积均为1∶2000稀释的混合液)、样品稀释液5(含10％V/V胎牛血清、0.1％V/V吐温20、1％W/V BSA、0.1％W/V Casein、1％W/V Proclin300的PBS溶液)连同底物液、洗涤液制备试剂盒A以进行后续检测。

实施例3猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体、猪瘟病毒E2蛋白抗体三联检测试剂盒的制备

3.1猪瘟病毒E2蛋白包被量的选择

按照实施例2.1所示将实施例1猪瘟病毒E2蛋白用点样液稀释至适当浓度，点样体积为20nl，使得点样于膜上的猪瘟病毒E2蛋白的终含量分别如表3所示，其它均不变。用P3、N血清按照实施例2.2的方法进行检测，结果(见表9)：PRVgD、PRVgE包被量不变的情况下检测均为阴性(表9未体现)；N/P3在CSFV E2包被量偏低时数值小，而在CSFV E2包被量达到0.4ng/点以上时，数据明显提升，而N/P3值的大小对应该方法分辨阴性、阳性能力的高低，数据越大，则检测条件越适宜；当CSFV E2蛋白的包被量为0.05～12.8ng/点时N/P3值为2.59～2.70均可满足检测，但当包被量为0.2～6.4ng/点时N/P3值略优(为3.13～3.68)，包被量为6.4ng/点时N/P3值为最优(为3.74)。

表9猪瘟病毒E2蛋白包被量优化结果

3.2三联检测试剂盒的制备

在实施例2.2猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白二联检抗体检测芯片上增加猪瘟病毒E2蛋白，即用点样液将实施例1制备的猪瘟病毒E2蛋白稀释至适当浓度，作为检测点猪瘟病毒E2蛋白点样液(点样于图2中的7)。按实施例2.2所述制备成三联检抗体检测芯片(点样模式见图2)。同样，三联检测试剂盒也可按图3的不同方式进行组装。

在实施例2.2酶标试剂中增加酶标记猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体15A9：将实施例1制备的酶标抗体3B6、酶标抗体11H1、酶标抗体15A9用酶标稀释液按终体积0.05％V/V混匀，0.22μm过滤，无菌分装。

在上述判定方法的基础上增加猪瘟抗体的判定方法，猪瘟的判定方法如下：

PI＝(1-样品A值/阴性质控品A值)×100％。

PI≥40％判定为CSFV抗体阳性；

30％＜PI＜40％判定为CSFV抗体可疑；

PI≤30％判定为CSFV抗体阴性。

为便于后续评价，将蛋白抗原板(PRVgD蛋白、PRVgE蛋白、CSFV E2蛋白包被依次为4.0ng/点、1.0ng/点、6.4ng/点)、酶标试剂、样品稀释液5连同底物液、洗涤液制备试剂盒B以进行后续检测。

实施例4联检试剂盒的应用

4.1敏感性

4.1.1猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白抗体

将21日龄PRV抗原抗体均阴性的105头仔猪随机分成10组，5头/组。

第1组颈部肌肉免疫猪伪狂犬活疫苗(Bartha株)，1ml(含10^6.0TCID₅₀/ml)；第2组颈部肌肉免疫猪伪狂犬活疫苗(Bartha株)，1ml(含10^5.0TCID₅₀/ml)；第3组颈部肌肉免疫猪伪狂犬活疫苗(Bartha株)，1ml(含10^4.0TCID₅₀/ml)；第4组颈部肌肉免疫猪伪狂犬活疫苗(Bartha株)，1ml(含10^3.0TCID₅₀/ml)；第5组不免疫、不攻毒作为对照组。第1～5组免疫后0周、1周、2周、3周、4周、5周、6周、2月、3月、4月。

第6组颈部肌肉免疫猪伪狂犬活疫苗(Bartha株)，1ml(含10^5.0TCID₅₀/ml)，免疫后28天用HN1201株疫苗滴鼻1ml(含10^7.0TCID₅₀/ml)攻毒；第7组不免疫只攻毒，仔猪日龄49天时用HN1201株滴鼻1ml(含10^6.0TCID₅₀/ml)攻毒；第8组不免疫只攻毒，仔猪日龄49天时用Fa株滴鼻1ml(含10^6.0TCID₅₀/ml)攻毒。第6组免疫后0周、1周、2周、3周、4周(即攻毒后0天)及第6、7、8组攻毒后第0天、3天、5天、6天、7天、9天、11天、14天采血。同时，为进行比较同期采集第5组猪只的血。

第9组用商品化猪伪狂犬病疫苗(鄂A株)免疫；第10组用猪伪狂犬病疫苗(HB-98株)免疫；第11组颈部肌肉免疫猪伪狂犬病病毒疫苗(HN1201株)。第9～11组免疫后35天采血。

以上血清均用试剂盒A、试剂盒B进行检测，并用商品化Biochek猪伪狂犬gB抗体检测试剂盒检测抗体免疫效果，用商品化IDEXX猪伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒检测攻毒抗体结果，参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定中和抗体。

从检测结果可知，对第1～5组不同猪伪狂犬病病毒疫苗免疫样品进行检测，结果(见表10)：试剂盒A、试剂盒B检测PRVgD抗体检测结果与BioChek商品化试剂盒基本一致，均优于病毒中和试验，符合PRVgD抗体增长的发展趋势；试剂盒A、试剂盒B检测PRVgE抗体检测结果与IDEXX PRVgE抗体检测试剂盒一致，均为阴性。

表10不同剂量的猪伪狂犬病病毒疫苗免疫样品检测结果汇总

用猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体3B6作为待检抗体，用试剂盒A重复检测多次(作为y)，根据检测结果拟合方程，分为3段且每段可对应一个方程(见表11)，该检测结果与背景结果趋势一致。为进一步验证，将以上样品的检测结果换算为抗体滴度值(作为x)，发现结果与表10吻合，表明试剂盒A、试剂盒B可通过抗体水平以数值高低体现以实现PRVgD抗体内置标曲半定量检测，便于临床分析，更利于临床应用。

表11 PRVgD抗体内置标曲对应的方程及判定结果

对第5～7组三组猪伪狂犬病病毒攻毒系列样品进行PRVgDgE抗体检测，结果(见表12)：试剂盒A、试剂盒B检测不同类型毒株(经典株、变异株)攻毒的结果一致，且均比PRVgE抗体IDEXX商品化试剂盒检出时间早、敏感性均高，均优于病毒中和试验的结果，符合抗体增长的发展趋势；且试剂盒A、试剂盒B操作简单，反应时间短，更利于该病毒的净化，更好地把控猪群的健康状况。同时对其PRVgD抗体进行检测，结果试剂盒A、试剂盒B与BioChek试剂盒、中和试验结果均一致，检测结果确切。

表12不同方法检测猪伪狂犬病病毒攻毒系列样品的结果汇总

用不同方法检测第1、2、6、7组4组的血清以比较PRVgDgE两种抗体水平的差异，结果(见表13)：第1、2组为疫苗免疫组，试剂盒A、试剂盒B检测PRVgE抗体均为阴性、PRVgD抗体时第1、2组S/N值明显下降也就是说PRVgD抗体呈现明显增长的趋势、抗体水平逐渐提升，与商品化试剂盒、中试试验检测结果趋势一致。第6组为免疫攻毒组，第7组为攻毒对照组，与第1、2组相比，攻毒前试剂盒A、试剂盒B及商品化试剂盒、中和试验方法检测各组PRVgE抗体均为阴性，检测第6组PRVgD抗体趋势均与第1、2组一致、第7组因未免疫故抗体水平低。

攻毒后，试剂盒A、试剂盒B检测第6、7组PRVgD抗体快速上升且升至很高的滴度(攻毒后1周即可高达4.0)、攻毒后2周PRVgD抗体依然维持较高的滴度(高达3.5以上)，与商品化试剂盒、中和试验的检测趋势相当；试剂盒A、试剂盒B检测第6、7组攻毒后1周PRVgE抗体明显上升且检出为阳性，攻毒后2周PRVgE抗体进一步明显上升，而商品化IDEXX试剂盒检测攻毒后1周PRVgE抗体虽明显上升但仍为阴性或可疑(有开始转阳迹象)、攻毒后2周PRVgE抗体转为阳性，中和试验检测攻毒后1周PRV抗体为阴性、2周方转为阳性。另外，第6、7组攻毒后的PRVgD抗体明显高于第1、2组免疫后的PRVgD抗体水平及第6组免疫后攻毒前的PRVgD抗体水平。通过这些数据以及我们临床试验检测情况，若用商品化BioChek PRVgB试剂盒检测PRV抗体为阳性，并不能直接判断该猪只或猪群是否感染猪伪狂犬病野毒，进一步还需要使用商品化IDEXX PRVgE试剂盒或中和试验进行确证。而试剂盒A一次检测即可鉴别诊断猪只或猪群PRV免疫或感染情况以及猪只或猪群的感染进程，即通过PRVgD抗体高低及PRVgE抗体高低即可综合判断猪只或猪群是健康状态还是感染早期、中期或晚期，从而指导临床制定免疫策略及净化措施。

表13不同方法猪伪狂犬病病毒免疫及攻毒系列样品检测结果汇总

注：BioChek PRVgB试剂盒判定标准S/P≥0.5为阳性、S/P＜0.5为阴性；IDEXXPRVgE试剂盒判定标准S/N≤0.6为阳性、S/N＞0.7为阴性、0.6＜S/N＜≤0.7为可疑；病毒中和试验判定标准≥1∶2为阳性、＜1∶2为阴性。

对第2组及第9～11组4种商品化猪伪狂犬病病毒疫苗免疫的21日龄仔猪免疫后28天、35天的血清样品进行检测，结果：试剂盒A、试剂盒B检测PRVgD抗体与商品化BioChekPRVgB试剂盒、中和试验检测28天、35天结果一致，均为阳性，符合抗体增长的趋势；检测PRVgE抗体均为阴性，猪群健康。

4.1.2猪瘟病毒抗体

将2份猪瘟病毒抗体阳性血清(经猪瘟中和免疫荧光试验操作规程(SN/T 1379.3-2006)测定中和效价均为1：5120)分别在稀释10倍后以2倍倍比稀释，分别用试剂盒B及商品化IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒进行检测。

从检测结果可知，对2组梯度稀释阳性样品进行检测，结果(见表14)：试剂盒B检测猪瘟病毒抗体检测结果与IDEXX商品化试剂盒一致，2份血清样品10倍-160倍稀释检测猪瘟病毒抗体均为阳性，320倍-640倍稀释检测猪瘟病毒抗体均为阴性。表明试剂盒B检测阳性样品敏感性与商品化试剂盒相当，符合情况较好。

表14不同方法猪瘟病毒抗体阳性血清梯度稀释样品检测结果汇总

4.2特异性

将猪伪狂犬病病毒抗体阴性血清5份、猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清1份、猪细小病毒(PPV)阳性血清1份、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清1份、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清1份、猪乙型脑炎病毒(JEV)阳性血清1份、副猪嗜血杆菌(HPs)阳性血清1份、猪萎缩性鼻炎(Bb)阳性血清1份、大肠杆菌(BL21)阳性血清1份、猪肺炎支原体(Mhp)阳性血清1份、猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性血清1份、猪传染性胃肠炎(TGEV)阳性血清1份、猪轮状病毒(PRoV)阳性血清1份，分别用实施例2制备的试剂盒A、试剂盒B及中和试验、商品化试剂盒BioChek PRVgB抗体试剂盒及IDEXX PRVgE抗体ELISA检测试剂盒进行检测，结果：三种试剂盒检测均为阴性，表明试剂盒A均与其它病毒的阳性血清无交叉反应，试剂盒B除与猪瘟病毒阳性血清反应外与其它病毒的阳性血清无交叉反应，特异性均良好。

4.3临床应用

4.3.1收集河南、山西、江西、辽宁、山东、浙江、四川的32个省市、76个猪场，共计2099份样品。用试剂盒A、试剂盒B分别进行检测，同时用BioChek PRVgB抗体检测试剂盒、IDEXX PRVgE抗体检测试剂盒、IDEXX CSFV抗体检测试剂盒进行复核。结果(见表15)：试剂盒A、试剂盒B检测PRVgD抗体的结果与BioChek试剂盒的符合率为96.82％(1429/1476)，检测PRVgE抗体的结果与IDEXX试剂盒的符合率为98.22％(1929/1964)。试剂盒B检测CSFV抗体的结果与IDEXX试剂盒的符合率为97.63％(1851/1896)。

表15A临床试验结果

表15B临床试验结果

4.3.2选择免疫背景清晰(暂未免疫猪瘟疫苗)的某种猪场、某仔猪场，采集免疫猪伪狂犬活疫苗28天后血清，包括种公猪、种母猪、仔猪。检测结果及分析结果(见表16)：试剂盒B检测CSFV抗体均为阴性(表16未显示)，试剂盒A与试剂盒B检测PRVgD抗体、PRVgE抗体结果一致，试剂盒A、B检测PRVgD抗体、PRVgE抗体结果与商品化试剂盒、病毒中和试验结果吻合，特别地，免疫效果良好的猪只PRVgD抗体高且PRVgE抗体阴性，淘汰的猪只PRVgD抗体、PRVgE抗体均较高为阳性，需PRV疫苗免疫的猪只PRVgD抗体、PRVgE抗体均为阴性。表明用试剂盒A、B可有效对猪伪狂犬病疫苗免疫效果评价及野毒感染与否进行有效判定，更有利于临床通过一次检测即可实现随时掌控猪群健康状况。

表16猪场检测结果及分析

注：BioChek PRVgB试剂盒判定标准S/P≥0.5为阳性、S/P＜0.5为阴性；IDEXXPRVgE试剂盒判定标准S/N≤0.6为阳性、S/N＞0.7为阴性、0.6＜S/N＜≤0.7为可疑；病毒中和试验判定标准≥1∶2为阳性、＜1∶2为阴性。

将上述11#～20#仔猪均进行攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株10^6.0TCID₅₀/头，攻毒后观察临床症状，结果见表17。并将13#、16#仔猪进行PCR鉴定，结果显示均为猪伪狂犬病病毒野毒株感染。其中13#仔猪经试剂盒A、B发现PRVgD抗体为可疑、PRVgE抗体为阳性，而商品化Biochek PRVgB抗体检测为阴性、IDEXX PRVgE抗体为阴性、中和抗体为阳性，表明试剂盒A、B灵敏度高于商品化试剂盒，可更早发现是否感染野毒。

表17猪场检测结果及分析

结合表16、表17的数据分析发现：试剂盒A、试剂盒B同时检测PRVgD抗体、PRVgE抗体可监控种猪、仔猪的健康状况，便于准确制定免疫程序或净化措施；进一步通过仔猪攻毒试验及PCR检测结果印证试剂盒A检测结果准确，可精准指导临床采取相应的措施。

综上所述，本发明制备的试剂盒可同时检测PRVgD抗体、PRVgE抗体甚至猪瘟病毒抗体，结果准确可靠，可用于检测猪群中猪伪狂犬病病毒感染状态、评估猪群中猪伪狂犬病病毒疫苗免疫效果及鉴别新引种猪猪伪狂犬病病毒感染情况。

本发明制备的试剂盒检测PRVgD抗体的结果比病毒中和试验结果的符合率高，适用于猪伪狂犬病病毒不同毒株制备的疫苗免疫效果和免疫程序科学性的评估，特别是通过抗体水平以数值高低体现并实现PRVgD抗体内置标曲半定量检测，便于临床分析，更利于临床应用；检测PRVgE抗体的敏感性高，适用于野毒(经典株和变异株)感染的早期预警，易于伪狂犬病早期的净化。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。