抗菌肽化合物DM80Bu20在制备抑菌牙膏中的应用
阅读说明：本技术 抗菌肽化合物DM80Bu20在制备抑菌牙膏中的应用 (Application of antibacterial peptide compound DM80Bu20 in preparation of antibacterial toothpaste ) 是由 刘润辉 褚夫江 李毅苹 耿帅峰 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供了抗菌肽化合物DM80Bu20在制备抑菌牙膏中的应用及其抑菌牙膏。本发明研究揭示了抗菌肽化合物DM80Bu20能选择性地抑制大多数口腔病原菌活性,同时对口腔益生菌无抑制作用,而且具备低溶血活性和低细胞毒性,安全性高,稳定性好,可用于制备口腔护理牙膏产品,进一步地,将化合物DM80Bu20用于制备的抑菌牙膏同样表现出选择性抑制口腔病原菌的效果,此外,通过复配特定的功效成分可实现与抗菌肽化合物DM80Bu20的协同抑菌作用,减少牙结石、牙菌斑的形成,降低牙龈出血,预防龋齿、口腔溃疡,减轻口臭等,且制备的牙膏抑菌稳定性好。(The invention provides application of an antibacterial peptide compound DM80Bu20 in preparation of antibacterial toothpaste and the antibacterial toothpaste. The research of the invention reveals that the antibacterial peptide compound DM80Bu20 can selectively inhibit the activity of most oral pathogenic bacteria, has no inhibition effect on oral probiotics, has low hemolytic activity and low cytotoxicity, high safety and good stability, and can be used for preparing oral care toothpaste products, further, the antibacterial toothpaste prepared by using the compound DM80Bu20 also has the effect of selectively inhibiting the oral pathogenic bacteria, in addition, the compound DM80Bu20 can realize the synergistic antibacterial effect with the antibacterial peptide compound DM80Bu20 by compounding specific functional components, the formation of dental calculus and dental plaque is reduced, the gingival bleeding is reduced, the dental caries and the oral ulcer are prevented, the halitosis is relieved, and the prepared toothpaste has good antibacterial stability.)
技术领域
本发明属于口腔护理技术领域。更具体地，涉及抗菌肽化合物DM80Bu20在制备抑菌牙膏中的应用。
背景技术
口腔健康是全身健康的重要组成部分，口腔疾病如龋病、牙周病等会破坏牙齿硬组织和牙齿周围支持组织，除影响咀嚼、言语、美观等功能外，还会引起社交困难和心理障碍，而造成这些口腔疾病的主要原因是牙菌斑的形成。有效的解决牙菌斑的形成是功效型口腔护理牙膏产品研究开发首要任务。随着人们对牙齿健康问题的关注，有接近50％的人认为中草药牙膏比传统的化学成分牙膏更安全，因此中草药牙膏越来越受欢迎，然而，有研究者对市场上常见的中草药牙膏对口腔常见菌的抗菌潜力进行评估发现，牙膏中的中草药成分对各种口腔细菌的抑制杀灭作用并无选择性，其对细菌作用的强弱一般依赖于药物的浓度，此外，白色念珠菌对各中草药牙膏的敏感性普遍偏低，推测长期使用这些牙膏有造成白色念珠菌感染的风险【陈宏，丁熙，and张秀华，比较五种中草药牙膏对口腔常见菌的抗菌潜力.中國微生態學雜誌，2007.19(4)：p.351-353】。另外，现有中草药牙膏中含有的抗菌活性提取物多数属于酸性牙膏基质中的不稳定成分，难以保障长时间的稳定和保持活性；而且现有的抗菌药物牙膏属于广谱抑菌活性，对病原菌和益生菌无选择特异性。
抗菌肽(antibacterial peptides)广泛分布于自然界中，是宿主产生的一类抵抗病原体感染的小分子多肽，也是生物天然免疫系统中的一个重要组成部分，现阶段也作为一类具有发展潜力的新型抗菌药物成分，专利CN201910047525.3公开了一种含益生菌和抗菌肽的口腔组合物，能改善口腔炎症问题，具有抗菌消炎、止痛消肿的作用，可见抗菌肽在治疗口腔疾病方面具有重要的应用价值。因此，亟需找到更多新型的抗菌肽活性物质，克服传统中草药牙膏对多种口腔病原菌和益生菌无选择性抑制的缺点，为口腔抑菌牙膏产品的开发提供物质基础。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种新型抗菌肽化合物DM80Bu20在抑制口腔有害菌中的应用及其制备的抑菌牙膏，本发明揭示了抗菌肽化合物DM80Bu20能选择性地抑制大多数口腔病原菌活性，同时对口腔益生菌无抑制作用，而且具备低溶血活性和低细胞毒性，安全性高，稳定性好；进一步地，将化合物DM80Bu20用于制备复配特定功效成分的复方牙膏，得到的抑菌牙膏产品抑菌稳定性好。
本发明的首要目的是提供抗菌肽化合物DM80Bu20在抑制口腔有害菌中的应用。
本发明的另一目的是提供抗菌肽化合物DM80Bu20在制备抑菌牙膏中的应用。
本发明的再一目的是提供一种包含抗菌肽化合物DM80Bu20的抑菌牙膏。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了抗菌肽化合物DM80Bu20在抑制口腔有害菌中的应用。
所述抗菌肽化合物DM80Bu20的结构式为：
优选地，所述口腔有害菌包含白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌中的一种或多种菌。
其中，白色念珠菌会导致念珠菌性口炎(雪口病、抗生素口炎、义齿性口炎、念珠菌性白斑)、念珠菌性唇炎、念珠菌口角炎、正中菱形舌炎、白斑、扁平苔藓、红斑狼疮等癌前病变或状态，由于部分幽门螺旋杆菌是潜伏在白色念珠菌中，所以重点开发对白色念珠菌有效的活性化合物，也能间接预防、阻断幽门螺旋杆菌在口腔微生物环境中的潜伏。金黄色葡萄球菌和MRSA是颌面部疖痈、疏松结缔组织炎、口腔颌面部伤口感染、婴幼儿口角炎，牙周炎、牙髓根尖周混合感染的致病菌。变异链球菌是龋病的主要病原菌，并可以导致菌血症、心内膜炎等继发性感染。牙龈卟啉单胞菌是牙周病主要相关致病菌。血链球菌是较早定植在口腔内的细菌之一，口腔的常驻菌，通过产生过氧化氢和血链素拮抗龋病及牙周病的可疑致病菌，是一类口腔有益菌。
化合物DM80Bu20化合物是一种模拟天然多肽的氨基酸聚合物，为天然抗菌剂的宿主防御肽(HDP)的模拟物，其抗菌机理与HDP类似，作用靶点为细菌细胞膜，通过破坏细胞膜的完整性达到杀菌的目的。本发明通过对化合物DM80Bu20进行口腔菌抑菌活性实验，结果显示该抗菌肽化合物DM80Bu20对白色念珠菌，金黄色葡萄球菌、MRSA、变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌具有良好的抑菌活性，MIC值为12.5～25g/mL；对益生菌血链球菌在测试浓度下无抑制活性，MIC值大于200μg/mL；表明该化合物能选择性地抑制大多数口腔病原菌，同时对口腔益生菌无抑制作用。此外，对抗菌肽化合物DM80Bu20进行溶血实验和细胞毒性试验，结果显示化合物DM80Bu20具有低溶血活性和低细胞毒性，安全性良好。
此外，进一步采用化合物DM80Bu20开发的牙膏对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、MRSA(甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌)、变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、大肠杆菌的抑菌率达到了90％～100％；而对血链球菌抑菌率低于10％，表明本发明的抑菌牙膏能很好地抑制口腔有害细菌，而对有益菌没有伤害，可有效平衡菌群。此外，将本发明的抑菌牙膏在45℃下放置30天和90天后，随着储存周期的延长，抑菌效果相对降低，但整体仍具有很好的抑菌效果，表明本发明牙膏抑菌效果稳定，利于长期储存。本发明的抑菌牙膏通过外源补充口腔有害菌防御成分，能抑制细菌的产生和牙结石的形成，减少牙菌斑、降低牙龈出血，持久抑菌。
因此，上述抗菌肽化合物DM80Bu20在制备抑菌牙膏中的应用，以及一种包含所述抗菌肽化合物DM80Bu20的抑菌牙膏都在本发明的保护范围内。所述牙膏以抗菌肽化合物DM80Bu20作为主要抑菌活性成分，辅以其他辅料制备而成。
作为一种优选地可实施方法，所述抑菌牙膏由以下重量份的组分组成：抗菌肽化合物DM80Bu20 0.001～0.1份、保湿剂30～45份、摩擦剂20～25份、粘合剂0.5～2份、发泡剂0.5～3份、香精0.5～1.5份、甜味剂0.1～0.5份、螯合剂1～3份、防腐剂0.1～2份、去离子水20～35份。
进一步地，所述牙膏还包含溶菌酶、乳铁蛋白、益生菌、再生硅、低聚果糖中的一种或多种成分。其中，溶菌酶抑制口腔致病菌，平衡口腔菌群；乳铁蛋白可增强粘膜免疫，减少幽门螺旋杆菌的感染；益生菌起到平衡口腔菌群，抑制致病菌的作用；再生硅可起到修复龋损的作用，提高牙齿硬度，保护牙釉质；低聚果糖主要促进益生菌增殖，平衡口腔菌群。本发明研究表明，对化合物DM80Bu20复配溶菌酶、乳铁蛋白、益生菌、再生硅和低聚果糖后，可协同增强对口腔有害菌的抑菌效果，能更好抑制细菌的产生和牙结石的形成，减少牙菌斑、降低牙龈出血，持久抑菌。
优选地，所述牙膏中，溶菌酶、乳铁蛋白、益生菌、再生硅、低聚果糖中的一种或多种成分的总份数为0.5～2份。
优选地，所述保湿剂包含山梨醇、丙二醇、甘油和聚乙醇中的一种或几种。
优选地，所述摩擦剂包含二氧化硅、水合硅石、氢氧化铝、碳酸氢钙、羟基磷灰石或磷酸氢钙中的一种或几种。
优选地，所述粘合剂包含羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、卡拉胶、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮或黄原胶中的一种或几种。
优选地，所述发泡剂包含月桂醇硫酸酯钠、月桂酰肌氨酸钠、月桂酰谷氨酸钠、脂肪酰胺丙基甲基甜菜碱、椰油酰胺丙基甲基甜菜碱、椰油酰谷氨酸钠、聚氧乙烯氢化蓖麻油40中的一种或几种。
优选地，所述香精包含薄荷香精。
优选地，所述甜味剂包含糖精钠、阿斯巴甜、甜菊糖中的一种或几种。
优选地，所述螯合剂包含焦磷酸盐、磷酸盐、EDTA二钠中的一种或几种。
优选地，所述防腐剂包含山梨酸钾、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯中的一种或几种。
优选地，所述益生菌包含副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌中的一种或多种菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了抗菌肽化合物DM80Bu20用于抑制口腔有害菌的新应用，该抗菌肽化合物DM80Bu20对白色念珠菌，金黄色葡萄球菌、MRSA、变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌具有良好的抑菌活性，MIC值为12.5～25g/mL，对益生菌血链球菌在测试浓度下无抑制活性，MIC值大于200μg/mL，其具有特异性选择抑菌效果，且安全无毒性，可用于制备各类口腔护理产品中。
(2)本发明将抗菌肽化合物DM80Bu20与其他功效成分(溶菌酶、乳铁蛋白、益生菌、再生硅、低聚果糖)复配制备抑菌牙膏，各成分协同抑制口腔有害菌，保护了有益菌，有效维持口腔菌群平衡，减少牙结石、牙菌斑的形成，降低牙龈出血，且制备的牙膏抑菌效果稳定，利于长期储存。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
本发明所述化合物DM80Bu20为白色粉末状，含有与天然宿主防御肽(Hostdefensepeptides，HDP)类似的结构骨架，其区别在于结构中引入非天然氨基酸，从而增加了化合物的稳定性，其结构式如下所示：
受试菌株：
白色念珠菌Candida albicans ATCC SC5314；
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538；
甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌Methicillin-resistant Staphylococcusaureus18908；
变异链球菌Streptococcus mutans ATCC UA159；
牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis ATCC 33277；
血链球菌Streptococcus sanguis ATCC 10556。
实施例1 DM80Bu20体外抑菌活性实验
1、实验方法
(1)菌株培养
将白色念珠菌Candida albicans ATCC SC5314在RPMI 1640培养基中，37℃，湿度为80％，5％CO2的条件下孵育；
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538在TSB培养基中，37℃，5％CO2的条件下孵育；
甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌Methicillin-resistant Staphylococcusaureus18908在TSB培养基中，37℃，5％CO2的条件下孵育；
牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis ATCC 33277在BHI培养基中加入氯化血红素(haemin，5μg/mL)与维生素K(menadione，1μg/mL)，37℃，严格厌氧条件下培养；
变异链球菌Streptococcus mutans Clarke Streptococcus mutansClarkeStreptococcus mutans ATCC UA159在培养基Brain Heart Infusion Agar/Broth中，37℃，5％CO2条件下培养；
血链球菌Streptococcus sanguis ATCC 10556，在培养基Brain HeartInfusionAgar/Broth中，37℃，5％CO2条件下培养。
(2)化合物准备
将化合物DM80Bu20粉末溶于DMSO中，调至浓度为10mg/mL，于冰箱中贮存待用。
(3)测定最小抑菌浓度(MIC)
以临床和实验室标准化协会(CLSI)规定为参照，实施微量肉汤二倍稀释法来测定化合物对不同微生物的最小抑菌浓度(MIC)。该方法为临床及实验室标准化协会(CLSI)公认有效方法，使用范围广而普遍，能够在短时间内快速实现对药物相互作用效果的检测，并可以通过对实验数据进一步分析得出可靠结论，结果稳定，可重复性高。
对白色念珠菌ATCC SC5314，使用生理盐水将受试菌株调至浓度为0.5-2.5×106CFU mL-1，此后，在RPMI 1640培养基中将菌悬液稀释至0.5-2.5×104CFU mL-1制备为待测菌液。取200μL待测菌液加入平底96孔板第一孔，此后每孔加入100μL待测菌液。向第一孔中加入2μL待测化合物储备液(100μg/mL)，于第一孔内吹打混匀，取均一悬液100μL，加入第二孔，吹打混匀，重复至最后一孔，弃去多余菌液。将96孔板于37℃条件下孵育24小时，MIC定义为肉眼观测能够抑制细菌生长的最小药物浓度。该实验进行三组重复，并选取益康唑作为阳性对照。
对金黄色葡萄球菌ATCC 6538与甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌18908，使用MH培养基将受试菌株调至浓度为0.5-2.5×105CFU mL-1，制备为待测菌液。取200μL待测菌液加入平底96孔板第一孔，此后每孔加入100μL待测菌液。向第一孔中加入2μL待测化合物储备液(100μg/mL)，于第一孔内吹打混匀，取均一悬液100μL，加入第二孔，吹打混匀，重复至最后一孔，弃去多余菌液。将96孔板于37℃，5％CO2条件下孵育24小时，MIC定义为肉眼观测能够抑制细菌生长的最小药物浓度。该实验进行三组重复，并选取万古霉素作为阳性对照。
对变异链球菌ATCC UA159与血链球菌ATCC 10556，使用BHI培养基将受试菌株调至浓度为0.5-2.5×106CFU mL-1，制备为待测菌液。取200μL待测菌液加入平底96孔板第一孔，此后每孔加入100μL待测菌液。向第一孔中加入2μL待测化合物储备液(100μg/mL)，于第一孔内吹打混匀，取均一悬液100μL，加入第二孔，吹打混匀，重复至最后一孔，弃去多余菌液。将96孔板于37℃，5％CO2条件下孵育24小时，MIC定义为肉眼观测能够抑制细菌生长的最小药物浓度。该实验进行三组重复，并选取万古霉素作为阳性对照。
对牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277，使用BHI培养基中加入氯化血红素(5μg/mL)与维生素K(1μg/mL)，将受试菌株调至浓度为0.5-2.5×106CFU mL-1，制备为待测菌液。取200μL待测菌液加入平底96孔板第一孔，此后每孔加入100μL待测菌液。向第一孔中加入2μL待测化合物储备液(100μg/mL)，于第一孔内吹打混匀，取均一悬液100μL，加入第二孔，吹打混匀，重复至最后一孔，弃去多余菌液。将96孔板于37℃，严格厌氧条件下孵育24小时，MIC定义为肉眼观测能够抑制细菌生长的最小药物浓度。该实验进行三组重复，并选取氯己定作为阳性对照。
2、抑菌实验结果
表1
表1为化合物DM80Bu20对口腔菌的抑菌结果，从表中的结果可以看出，化合物DM80Bu20对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、MRSA、变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌具有显著的抑菌作用，MIC值在12.5-25μg/mL之间；对益生菌血链球菌在测试浓度下无抑制活性，MIC值大于200μg/mL；此外，由于部分幽门螺旋杆菌是潜伏在白色念珠菌中，所以重点开发对白色念珠菌有效的活性化合物，也能间接预防、阻断幽门螺旋杆菌在口腔微生物环境中的潜伏。
实施例2化合物DM80Bu20溶血活性实验
1、实验方法
新鲜人血用Tris缓冲液(TBS)洗涤3次，采集的人红细胞(hRBCs)用TBS稀释至5％(v/v)。在96孔板上，用二倍梯度稀释法将化合物DM80Bu20稀释至3.13-400μg/mL。将等体积的hRBCs悬浮液和化合物DM80Bu20溶液混合后，在37℃下培养1小时。以TBS为空白对照，以Triton X-100(TBS)3.2μg/ml和hRBCs等体积混合溶液为阳性对照。离心后，将每孔上清液80μl转移到另一个96孔板上，用酶标仪读取96孔板中待测溶液在405nm处的OD值，通过下式来计算溶血百分比：
2、实验结果
DM80Bu20的溶血活性(HC50)为200μg/mL，表明化合物DM80Bu20具有低溶血性。
实施例3化合物DM80Bu20的细胞毒性活性实验
1、实验方法
用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，细胞密度为1×106CFU/mL，并以每孔1×104个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL。在37℃下培养细胞24小时。去除旧培养基后，加入含有不同浓度的化合物DM80Bu20的培养基，每个浓度设置三个复孔。在37℃下培养细胞24小时后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL，PBS配制)10μL，继续孵育4小时，终止培养。小心吸掉孔内培养上清液，每孔加150μL DMSO，在摇床震荡10分钟，使结晶物充分溶解。在同一块96孔板上，包括了不加任何化合物DM80Bu20处理的细胞作为对照组，以及不接种细胞只加DMSO的空白组。用酶标仪读取96孔板中待测溶液在570nm处的OD值，每个孔的细胞存活率下式计算：
2、实验结果
结果得到化合物DM80Bu20的细胞毒性(IC50)为100μg/mL。
实施例4急性眼刺激试验
1、材料和方法
1.1受试物：采用无菌水配制0.1％化合物DM80Bu20水溶液，无色透明液体，实验时取受试原型供试。
1.2实验动物和饲养环境
实验动物：普通级新西兰白色家兔3只，体重1.80-2.20kg，由广州市花都区花东信华实验动物养殖场提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2019-0023，质量合格证号：No.44007600007472，实验前动物至少检疫3天，合格后备用。
饲养环境：动物购进后在广州质量监督检测研究院普通区动物房单笼饲养，温度：18-26℃，相对湿度：40％-70％，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2018-0137。
饲料：由北京科澳协力饲料有限公司提供，饲料生产许可证号：SCXK(京)2019-0003，饲料合格证：1112622000019812。
1.3试验方法
1.3.1在试验开始前24h对实验家兔的两只眼睛进行检查(包括使用荧光素钠)，检查合格的家兔用于试验。
1.3.2轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼睑，将受试物0.1ml滴入结膜囊中，使上、下眼睑被动闭合1s，以防收拾屋丢失。另一侧眼睛不做处理作自身对照。滴入受试物后24h内不冲洗眼睛。
1.3.3在滴入受试物1h、24h、48h和72h对动物眼睛进行检查。在24h观察和记录结束后，对所有动物眼睛用荧光素钠作进一步检查。在每次检查中均按《化妆品安全技术》(2015年版)急性眼刺激性/腐蚀性试验-眼损害的评分标准记录眼刺激反应的积分。以给受试物后动物角膜、虹膜或结膜各自在24h、48h或72h观察时点的刺激反应的最高积分均值和恢复时间评价，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)急性眼刺激性/腐蚀性试验-眼刺激反应分级判定受试物对眼的刺激强度。
2、实验结果
表3化合物DM80Bu20对家兔急性眼刺激试验结果
从表3可以看到，化合物DM80Bu20对家兔急性眼刺激实验的结果都显示为无刺激性。
实施例5急性皮肤刺激试验
1、材料和方法
1.1受试物：采用无菌水配制0.1％化合物DM80Bu20水溶液，无色透明液体，以受试物原型供试。
1.2实验动物和饲养环境
实验动物：普通级新西兰白色雌家兔4只，体重1.80kg-2.20kg，由广州市花都区东信华实验动物养殖场提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2019-0023，质量合格证号：No.44007600007434，试验前动物至少检疫3天，合格后备用。
饲养环境：动物购进后在广州质量监督检测研究院普通区动物房单笼饲养，温度：18℃-26℃，相对湿度：40％-70％，实验动物使用许可证号：SYXH(粤)2018-0137。
饲料：由北京科澳协力饲料有限公司提供，实验动物饲料生产许可证号：SCXK(京)2019-0003，质量合格证号：1112622000019812。
1.3试验方法
1.3.1于试验前24h将实验动物背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围各为3cm×3cm。
1.3.2取受试物0.5ml涂抹在一侧皮肤上，涂抹面积2.5cm×2.5cm，然后用二层纱布(2.5cm×2.5cm)和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤不做处理作为对照。采用封闭试验，敷用时间为4h。试验结束后用温水清除残留受试物。
1.3.3于清除受试物1h、24h、48h、和72h观察涂抹部位皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015版)皮肤刺激性/腐蚀性试验-进行皮肤反应评分，以受试物动物积分的平均值进行综合评价，根据24h、48h和72h各观察时点最高积分均值，按《化妆品安全技术规范》(2015版)皮肤刺激性/腐蚀性试验-判定皮肤刺激强度。试验中观察是否有皮肤刺激性以外的其它症状。
2、试验结果
表4化合物DM80Bu20对家兔急性皮肤刺激性试验结果
表4结果显示，该抗菌肽化合物DM80Bu20对家兔皮肤无刺激性。
实施例6化合物DM80Bu20急性经口毒性试验
1、材料和方法
1.1受试物
试验组：采用无菌水配制0.1％化合物DM80Bu20水溶液，无色透明液体，以受试物原型供试。
1.2动物和饲养环境
配制方法：称取样品5.00g，用纯水配制至10.0mL，备用。
SPF级KM小鼠10只，体重18g～22g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002，质量合格证号：No.44007200074743。饲料由广东省医学实验动物中心提供。动物购进后在广州质量监督检测研究院动物房检疫合格后使用，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2018-0137，动物房。温度：20℃～26℃，相对湿度：40％～70％。
1.3试验方法
本试验采用一次最大限度试验，只设5000mg/kg体重一个剂量组，即取经检疫合格小鼠10只，雌雄各半。实验前动物禁食过夜，不限制饮水。空腹灌胃1次，灌胃容量为10.0mL/kg体重，染毒后继续禁食3h～4h，观察并记录动物的中毒表现、死亡数和死亡时间，观察期为14d，试验结束时未死亡动物称重。按急性经口毒性试验评价规定判断毒性分级。
2、试验结果
染毒后，在观察期内未发现小鼠有中毒表现及死亡，实验结束后对存活动物解剖，肉眼未见异常。详见表5。
表5受试物对小鼠急性经口毒性试验结果
结果表明，化合物DM80Bu20对雌、雄性KM小鼠急性经口毒性LD50＞5000mg/kg体重，属实际无毒级。
实施例7抗菌牙膏的制备
(1)本实施例提供了一系列包含化合物DM80Bu20的牙膏，具体配方见表6。
表6
其中，牙膏4、5、7、8中的益生菌分别为副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、唾液乳杆菌。
(2)牙膏制备方法
公司目前生产工艺采取一步制膏法完成牙膏膏体制备：
S1将保湿剂、发泡剂(液态)、甜味剂、螯合剂、防腐剂与水混合，搅拌5～15分钟；
S2再将摩擦剂、粘合剂、发泡剂(固态)与上述S1制备的水溶液混合，保持真空度在-0.090Mpa～-0.096Mpa，搅拌20～50分钟；
S3再加入香精、活性成分，保持真空度在-0.090Mpa～-0.096Mpa，搅拌10～50分钟，即制得牙膏1～9。
实施例8牙膏的抑菌性能测试
1、实验方法
按照QB 2738-2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》中7.3作为检测依据，对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、MRSA(甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌)、变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、大肠杆菌、血链球菌等的抑制率为考察指标，将实施例7制备的牙膏1～9常温放置24h后，才做抑菌测试。测定结果如表7所示。
2、实验结果
表7牙膏1～9常温放置24h后的抑菌率(％)
从表7可以看出，本发明制备的包含抗菌肽化合物DM80Bu20的牙膏对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、MRSA(甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌)、变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、大肠杆菌的抑菌率都达到了90％以上，其中牙膏2和3对各口腔有害菌的抑菌率达到了99-100％；牙膏4-9中除了抗菌肽化合物DM80Bu20，还加入了其他功效成分(溶菌酶、乳铁蛋白、益生菌、再生硅、低聚果糖)复配，其抑菌效果都得到了提升，表明溶菌酶、乳铁蛋白、益生菌、再生硅、低聚果糖的复配可有效提高其抑菌效果，因此，基于抗菌肽化合物DM80Bu20昂贵的成本，可以采用复配其他有效成分以提升其抑菌效果。
另外，各配方牙膏对血链球菌抑菌率低于5％，这主要是由于牙膏中其他辅料成分具有一定的抑菌作用。总体而言，本发明的抑菌牙膏能很好地抑制口腔有害细菌，而对有益菌没有伤害，可有效平衡菌群。
实施例9牙膏的抑菌稳定性测试
1、实验方法
参照QB 2738-2012日化产品抗菌抑菌效果的评价方法，测定实施例7制备的牙膏1～9对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、MREA、变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌、大肠杆菌、血链球菌的抑制作用。将牙膏1～9在45℃下放置30天和90天后，分别做牙膏抑菌测试。测定结果如表8所示。
2、实验结果
表8牙膏1～9分别于45℃下放置30天和90天后抑菌率(％)
从表8的结果可以看出，各配方牙膏在45℃下放置30天和90天后，随着储存周期的延长，抑菌效果相对降低，但整体仍具有很好的抑菌效果，表明本发明牙膏的抑菌效果稳定，利于长期储存。
实施例10牙膏使用效果(色斑指数测定)
1.试验方法
(1)受试人群和分组
经体检指标全部正常的80名受试人；受试人口内有12颗天然前牙，且无大面积的充填或冠等修复体；牙齿有外源性色斑存在。
将其随机分成试验组1、试验组2、试验组3和试验组4，每组20人，男女各半；其中试验组1使用的样品为牙膏1，试验组2使用的样品为牙膏3，试验组3使用的样品为牙膏4，试验组4使用样品为牙膏6。
(2)刷牙方式
受试者统一发放牙膏及牙刷，按BASS刷牙法，每日早晚各刷牙1次，共2次，每次1min。
(3)实验步骤
受试者使用前进行色斑指数检测(基线)，连续使用3个月后再进行色斑指数检测，比较使用牙膏1、牙膏3、牙膏4、牙膏6前后受试者的色斑指数变化。
色斑指数计分法，具体计分规则如下：
0分——无色斑存在；
1分——有色斑，色斑大小不超过牙面的1/3，程度为轻度色斑(黄色或黄褐色)；
2分——有色斑，色斑大小超过牙面1/3，不超过牙面2/3，程度为中度色斑(中等程度棕色)；
3分——有色斑，色斑大小超过牙面的2/3，程度为重度色斑(深棕或黑色)。
检查牙位为下颌前牙的唇、舌面及上颌前牙的唇面。每个牙面色斑指数计数分为该牙面的色斑面积计分和色斑程度计分的乘积。每个受试者的色斑指数计分为各牙面色斑指数计分的平均值，即：
色斑指数＝∑(面积计分程度计分)/总的检查牙面数
2.试验结果
表9
注：色斑指数降低率＝(使用前色斑指数平均值-使用后色斑指数平均值)/使用前色斑指数平均值×100％。
从表9中的结果可以看出：本发明的牙膏对牙齿色斑均具有减轻作用，随着DM80Bu20的含量的增加，其祛除色斑效果也提升；此外，牙膏4和6相比于牙膏1，其对受试者色斑指数降低率更高，表明本发明的牙膏中加入溶菌酶、乳铁蛋白、益生菌、再生硅、低聚果糖后，可有效提升祛除外源性色斑的效果，因此可通过加入其它活性成分，在降低DM80Bu20的使用成本的同时实现良好的祛除牙面色斑的效果，其中牙膏6的色斑指数降低率最高，表明加入溶菌酶与DM80Bu20复配后的效果最好。
此外，受试者使用上述牙膏后对于牙结石、牙龈出血、口腔溃疡、口臭等情况都得到了有效的改善，其中牙膏4和6相比与牙膏1的实验组，其改善情况更明显。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
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