具体实施方式

下述实施例中用到的主要仪器：

FL光谱由日立F-2700荧光分光光度计(日本，东京)进行。用日本东京岛津UV-2600分光光度计获得了紫外可见吸收光谱。用Talos F200X透射电子显微镜(TEM)对Eu-CDs 的形貌和粒径进行了表征。在日本丰田公司的岛津FT IR-8400S光谱仪上测量了傅里叶变换红外光谱(FT-IR)。使用FLS980荧光分光光度计(英国，爱丁堡)测试荧光寿命。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)在450nm波长下的吸光度使用Multiskan GO 1510全波长微型平板阅读器(美国赛默菲舍尔科学公司)测量。用共聚焦荧光显微镜(德国，蔡司)观察Eu-CDs的细胞成像。此外，在Zeta电位分析仪(英国，马尔文)上测量Zeta电位。

下述实施例中用到的主要试剂：

铬黑T购自成都科隆化工有限公司(中国，四川)。六水合硝酸铕、谷胱甘肽和甲酰胺购自上海阿拉丁(中国，上海)有限公司。吡啶二羧酸(DPA)购自北京华维瑞科化工有限公司(中国，北京)。枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)购自上海鲁威科技有限公司(中国，上海)。采用Tris-HCl缓冲液(10mM)、Hepes缓冲液(10mM)、磷酸盐缓冲液(PBS)和 Mops缓冲液(10mM)控制体系的酸度。所有实验均使用从Milli-Q超纯水(18.2MΩ.cm-1) 系统中获得的超纯水。除非另有说明，否则试剂和溶剂为试剂级，使用时无需进一步纯化。

实施例1 [email protected]探针复合物的制备

(1)采用一锅溶剂热法快速制备了Eu-CDs。将六水合硝酸铕(30mg)、谷胱甘肽(330mg)和甲酰胺(4.16mL)转移到不锈钢高压釜中，在180℃下加热40分钟。产品自然冷却至室温。然后，将溶液在10000r下离心10分钟以除去大的不溶性颗粒。所得溶液经500da 膜透析72小时纯化后，于4℃保存备用。

(2)制备10mM的EBT母液。在离心管中加入150μL EBT溶液(从10mM母液中取)、 165μL Eu-CDs(0.5mg/mL)和100μL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 7.0)，制备[email protected] 探针。

实施例2 Eu-CDs的表征

将制备好的Eu-CDs放入Talos F200X透射电子显微镜(TEM)获得表征数据。Eu-CDs的形貌和微观结构如图2(a)所示，Eu-CDs分散均匀，形状规则。随机计数100个随机颗粒，Eu-CDs的直径约为3.0～7.7nm，平均直径为5.1nm。Eu-CDs中C、N、O、S和Eu的元素组成比分别为0.5328、0.1762、0.2513、0.0317和0.008(表1)。Eu-CDs的XRD图(图 2(b))显示了24°左右的宽峰，这归因于高度无序的碳原子。宽的衍射峰可能是由于类石墨纳米结构中各层之间的弱相互作用。

表1原子的相对含量

Eu-CDs的XPS表征如图1所示。图1(a)是Eu-CDs的C1s能谱，由图可知Eu-CDs 表面存在5种碳键，分别为C-C/C＝C(284.40eV),C-S(285.56eV),C-N(286.40eV),C＝N/C＝O(287.65eV)和N-C＝O(288.90eV)。图1(b)是Eu-CDs的N1s能谱，399.10、399.69和400.66 eV处的峰分别代表吡啶N、吡咯N和石墨N。图1(c)是Eu-CDs的O1s能谱，531eV和 532.02eV处的谱峰分别代表C＝O和C-OH/C-O-C。图1(d)是Eu-CDs的S 2p能谱，包含四个峰，分别位于161.7、163.12、164.36和167.8eV处，可分别归因于硫代甲酸酯、噻吩S 的2p3/2,2p1/2和氧化S。如图1(e)所示，Eu 3d3/2和Eu3d5/2的结合能分别在1164和1134.25 eV处，这表明Eu-CDs中已经成功掺杂了Eu。

利用傅立叶变换红外光谱(FT-IR)研究了Eu-CDs的表面官能团。如图2(c)所示，约3650～3120cm^-1处的宽峰归因于O-H和N-H的拉伸振动，表面上的这些功能性亲水基团大大提高了Eu-CDs的水溶性。C＝N和C＝C的拉伸振动位于1633cm^-1处，1047cm^-1处出现的峰值可归属于氧化S键和C＝S的拉伸振动，1689和1396cm^-1处的典型峰值分别来自酰胺C＝O 和C-N振动。1315cm^-1处的峰属于C-N价键振动。另外，利用XPS对Eu-CDs的化学状态进行了研究，如图2d所示，其结果表明与FT-IR结果一致。

实施例3检测条件的优化

为了获得最佳的DPA检测参数，对酸度、温度、时间和离子强度四个因素进行了优化。

按照如下顺序进行优化实验：

优化酸度时，温度为20℃(就是室温)，时间为20分钟，不加NaCl，DPA的浓度为10μM，探针的浓度也是固定的。

优化时间时，缓冲液为Tris-HCl 7.0,温度为20℃，探针的DPA浓度不变，不加NaCl。

优化温度时，缓冲液为Tris-HCl 7.0，时间为10分钟(这个时候时间优化已经做了，就选择了10分钟)，探针的DPA浓度不变，不加NaCl。

优化Nacl浓度时，缓冲液为Tris-HCl 7.0，时间为10分钟，温度为20℃(这个时候温度优化已经做了)，探针和DPA浓度不变)

EBT与Eu-CDs形成的配合物颜色为红色或紫红色，但只有在pH为7～11的条件中，才能观察到它们明显的颜色变化。由于其颜色变化的特殊性，用Tris-HCl缓冲液、Hepes缓冲液和Mops缓冲液调控溶液的酸度。如图3(a)所示，在这些缓冲液中，当pH值低于6.8时，[email protected]和DPA的吸光度比值随pH增大略有增加，而pH值在7.2～9.0时，该比值随 pH增大而降低，在pH 6.8～7.2Tris-HCl缓冲液中吸光度比值基本稳定且在pH 7.0时最优。因此，选择在pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中检测DPA。如图3(b)所示，反应温度在15～50℃时，吸光度比值变化不大，当温度高于20℃或低于20℃时，吸光度比值略微降低，由此确定 20℃作为实验的最佳温度。对于体系稳定性的研究如图3(c)所示，吸光度比值在140分钟内基本保持不变，表明[email protected]与DPA之间的反应立即完成，且至少能够保持2小时的稳定。如图3(d)所示，随着NaCl浓度的增加，[email protected]与DPA的吸光度比值基本保持不变，说明离子强度对体系几乎没有影响。最后，确定了DPA的最佳检测条件为：pH 7.0的 Tris-HCl缓冲液、反应温度20℃、10分钟的反应时间和不添加NaCl。

实施例4 DPA检测的选择性和干扰性

在优化的条件下，将苯甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、甘氨酸、KCl、Na₂CO₃等化合物加入到反应体系中，考察了反应体系的选择性。所有受试物的最终浓度为500μM，并测定其吸光度和荧光强度。各种化合物的吸光度和荧光比如图5所示。结果表明，只有DPA的加入才能引起显著的吸光度和荧光强度的变化。重要的是，它很容易被肉眼识别(图5，插图)。结果表明，[email protected]探针对DPA的测定具有良好的选择性。

为了进一步考察该方法的抗干扰能力，向体系中添加氨基酸(甘氨酸和组氨酸)和金属离子(Ca²⁺,Ba²⁺,Mg²⁺,Hg²⁺,Cr⁶⁺,K⁺,Ag⁺,ClO^-,Na⁺,KI,CO₃ ^2-,HCO₃ ^-,Cr³⁺,SO₄ ^2-,SCN^-,Zn²⁺,Al³⁺,Cu²⁺)，研究以上共存物质对体系吸光度比的影响。所有终浓度为100μM的共存物质(除Al³⁺和Cu²⁺为3.0μM外)，如图4所示，这些共存物质对DPA的测定均无显著影响。虽然体系对Al³⁺和Cu²⁺的耐受程度较低，但在实际样品中这两种离子含量较低，且用超纯水稀释可忽略干扰。因此，本申请建立的DPA检测方法的抗干扰能力良好。

实施例5机理研究

为了探讨[email protected]对DPA的传感机理，研究EBT、Eu-CDs、DPA、[email protected] 和[email protected]对DPA的紫外-可见吸收光谱(图6(a))。EBT溶液在pH7.0 Tris HCl缓冲液中呈蓝色(图6(a)，插图)。加入Eu-CDs后，溶液颜色立即由蓝色变为洋红色(图6(a)，插图)，535nm处出现新的吸收峰。加入DPA后，溶液颜色立即从洋红色变为紫色变为蓝色(图 6(a)，插图)，吸收峰位置伴随着大约90nm(从535nm到625nm)的红移。这是由于DPA 对Eu(III)的结合能力强于EBT。当Eu-CDs加入EBT溶液中时，EBT能与Eu(III)螯合形成[email protected]，颜色由蓝色变为洋红色，535nm吸收峰的强度逐渐增大，625nm吸收峰的强度逐渐减弱。535nm吸收峰可归因于[email protected]，625nm吸收峰归因于体系释放出EBT。加入DPA后，DPA可以取代[email protected]中的EBT，形成[email protected]，EBT 被释放到溶液中，颜色由洋红色变为紫色，并恢复625nm吸收峰，同时535nm吸收峰强度减小。结果表明，该传感机制是DPA对EBT的配体置换机制。FT-IR研究结果也很明显(图 11)。这种显著的颜色变化可用于DPA的肉眼检测。

为了进一步探究其荧光传感机理，本发明研究了Eu-CDs、EBT、[email protected]和 [email protected]+DPA的荧光光谱(图6(b))。在270nm的激发下，[email protected]在445nm处呈现蓝色荧光，DPA可以使[email protected]的蓝色荧光猝灭，同时可以观察到Eu-CDs的红色荧光(图6(b))。随着DPA浓度的增加，蓝色荧光强度被逐渐猝灭，红色荧光强度相应增加 (图6(a))。并且光致发光颜色从蓝色变为红色，在紫外线灯下可以显著地区分(图6(b)，插图)。因此，设计了一种高效的DPA比色荧光传感器。DPA是一种三齿配体，具有良好的“天线效应”。一般来说，Eu可以在593和615nm处配位产生红色荧光信号。因此，Eu-CDs中的Eu是一个隐性信号。当加入DPA时，由于DPA与Eu(III)的配位作用，形成[email protected]，溶液在593和615nm处发出强烈的红色荧光，可归属于5D₀→7F_J(J＝1-4)跃迁。在615nm 处观察到最大荧光信号，这可归因于5D₀→7F₂跃迁。

为了更好地理解[email protected]与DPA之间的相互作用，本发明测量了[email protected]和[email protected]+DPA的荧光寿命。如图6(c)和6(d)所示，结果与单指数衰减曲线一致。当加入70μM的DPA时，445nm的荧光寿命略有下降(从3.845ns降至3.563ns)。同时，从图6(a)可以看出，加入DPA后，[email protected]的紫外吸收曲线也发生了显著变化，表明DPA和[email protected]形成了弱的或非发光基态络合物，导致体系荧光猝灭。因此，加入DPA 后的“开-关”变化为静态猝灭过程。同时，615nm的荧光寿命从1.147ns降低到1.045ns。这一结果与水分子的O-H振动使Eu(III)非辐射失活而使Eu(III)荧光寿命略有降低的情况相一致。荧光寿命的轻微下降表明DPA向Eu(III)的吸收能量转移效率不高。结果证明， DPA对Eu的检测机制为AETE效应(III)。

实施例6分析参数

在最佳条件下，记录不同浓度DPA在水溶液中的吸收光谱，如图7(a)所示，发现随着 DPA浓度的增加，[email protected]络合物在625nm处的吸收强度增大，在535nm处的吸收强度减小。图7(b)显示，A₆₂₅/A₅₃₅与DPA浓度在0.1至12.0μM之间的对应关系。回归方程为 A₆₂₅/A₅₃₅＝2.297-1.818exp(-0.07233c_DPA)(μM)，相关系数R²为0.9984。检出限(LOD)为 10.64nM(3σ)，远低于炭疽芽孢杆菌孢子的感染剂量(60μM)。此外，在添加1.0μM DPA (图7(c))后，无需任何特殊仪器，肉眼可以很容易地观察到视觉颜色的变化，这比之前报道的文献低一个数量级以上。

与吸收光谱类似，[email protected]的荧光强度在616nm处增大，在445nm处随着DPA 浓度从0.5-200.0μM的增加而减小，如图8(a)所示，当DPA为12.0μM时，用254nm的紫外灯用肉眼可以清楚地分辨出颜色的变化，如图8(b)所示荧光比率(F₆₁₆/F₄₄₅)与DPA浓度的关系。线性方程为F₆₁₆/F₄₄₅＝4.788-4.782exp(-0.01774c_DPA)(μM)，相关系数R²为0.9902。计算LOD为50nM。在254nm紫外灯激发下，随着DPA浓度的增加，荧光颜色由蓝变为紫色，最后变为红色，这与CIE坐标图一致(图10)。因此，可以用紫外灯对DPA进行裸眼检测。

为了证明该方法的优点，将其与其他报告的方法(具体见参考文献)进行了比较，如表 2所示。这种方法的LOD具有很大的优势。更重要的是，该方法可用于低浓度DPA(1.0μM) 的裸眼检测，而无需使用任何仪器，这是目前已知的裸眼DPA最低检测浓度。因此，它将有望成为DPA肉眼检测的一个有价值的工具。

表2不同DPA检测方法的比较

*裸眼LOD是指在没有任何仪器的情况下，肉眼可以识别的最低DPA浓度。

实施例7实际样本检测

(1)细菌孢子中DPA的检测

为了证明该方法的潜在应用价值，将其用于细菌孢子中DPA的定量评价。如图9和图 12所示，随着孢子溶液体积的增加(对应于DPA浓度)，吸光度和荧光强度立即改变。根据文献，枯草芽孢杆菌的每个孢子含有3.65×10^-16mol的DPA。因此，可以间接地量化未知悬浮液中孢子的数量。A₆₂₅/A₅₃₅的吸收强度比随着孢子溶液体积从0μL增加到250μL呈线性增加(图9(b))。LOD为1.18μL(相当于3.4×10⁷个枯草芽孢杆菌孢子)。F₆₁₅/F₄₄₅的荧光强度比随着孢子溶液体积从0增加到675μL呈线性增加。LOD为0.096μL(相当于2.5×10⁷个枯草芽孢杆菌孢子)。上述结果表明，该方法可用于实际样品的分析。

(2)尿样中DPA的检测

为了进一步验证该方法的实用性，还选择了尿液作为DPA检测的实际样本。标准加入法测定结果见表3，回收率为98.89％～106.02％，相对标准偏差(RSD)小于2.35％。实验结果表明，该方法具有良好的灵敏度和准确性，这保证了在实际样品中检测DPA的实用性和可靠性。

表3实际样品中DPA的测定

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