具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，不构成对本发明保护范围的限定。

没有特别说明，以下“15mg/L ABA+1000mg/L CaCl₂”表示溶液中ABA和CaCl₂的浓度分别为15mg/L和1000mg/L，溶剂为水。其它类似形式含义相同。

实验例

1材料与方法

1.1试验材料

试验于2020年5月-2021年5月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所日光温室进行。试验材料为黄瓜‘中农26’，种子购于中蔬种业科技(北京)有限公司，供试试剂ABA(脱落酸)和CaCl₂，购于北京华越洋生物科技有限公司。基质为草炭和蛭石(体积比为2:1)，营养钵(尺寸为7cm×7cm×8cm)。

1.2试验设计

以‘中农26号’为试材，将黄瓜种子温汤55℃浸种30min后，室温浸泡4h，置于恒温箱中28℃催芽24h，选取发芽一致的种子播种于32孔育苗穴盘中，育苗基质为草炭和蛭石(体积比为2:1)，置于中国农业科学院蔬菜花卉研究所人工气候室中进行培养，培养条件为白天(24℃/12h)，夜间(18℃/12h)，光照强度(500±20)μmol·m^-2·s^-1，空气相对湿度为60-80％。待幼苗两叶一心时移栽至营养钵中，挑选长势一致的黄瓜幼苗进行以下实验处理。

1.2.1 ABA和CaCl₂单独喷施对黄瓜幼苗抗冷性的影响

试验采用叶面喷施的方法进行处理，ABA溶液设置3个水平，即浓度分别为15、25和35mg/L(分别设为S1、S2、S3)，CaCl₂溶液设置3个水平，即浓度分别为500、1000和1500mg/L(分别设为S4、S5、S6)，以喷施清水为对照(设为CK)。将清水、ABA溶液、CaCl₂溶液分别均匀喷施于黄瓜幼苗叶面，喷施量为3mL/株。每天早晨9点开始喷施，连续喷施3d后在日光温室内继续生长1d将其置于人工气候间进行低温胁迫处理，昼夜温度设置为(5±0.5)℃，光周期为光照12h/黑暗12h。处理72h后观察各个处理的表型，分别测定不同处理下的冷害指数、MDA含量、相对电导率、SOD酶活性和CAT酶活性。

1.2.2 ABA和CaCl₂复配组合处理对黄瓜幼苗抗冷性的影响

试验采用叶面喷施的方法进行处理，ABA和CaCl₂复配溶液共设置9个水平，即15mg/L ABA+500mg/L CaCl₂、25mg/L ABA+500mg/L CaCl₂、35mg/L ABA+500mg/L CaCl₂、15mg/L ABA+1000mg/L CaCl₂、25mg/L ABA+1000mg/L CaCl₂、35mg/L ABA+1000mg/L CaCl₂、15mg/L ABA+1500mg/L CaCl₂、25mg/L ABA+1500mg/L CaCl₂、35mg/L ABA+1500mg/L CaCl₂(分别设为T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9)，以喷施清水为对照(设为CK)。将清水和各复配溶液分别均匀喷施于黄瓜叶面，喷施量为3mL/株。每天早晨9点开始喷施，连续喷施3d后在日光温室内继续生长1d将其置于人工气候间进行低温胁迫处理，昼夜温度设置为(5±0.5)℃，光周期为光照12h/黑暗12h。处理72h后观察各个处理的表型，分别测不同处理下的冷害指数、MDA含量、相对电导率、SOD酶活性和CAT酶活性。

1.3测定指标与方法

1.3.1冷害指数的测定

对幼苗的冷害症状进行分级：0级为无受害症状；1级为叶片稍皱缩，下数第1或第2叶叶缘发黄或略失水，第3叶和新叶无受害症状；2级为叶片皱缩，下数第1叶和第2叶叶缘严重失水，第3叶叶缘发黄或略为失水，心叶无明显受害症状；3级为下数第1和第2叶中部出现脱水斑，第3叶叶缘严重失水，心叶轻微失水；4级为下数第1和第2叶中部脱水斑连接成片，叶片萎蔫，第3叶中部始显脱水斑，心叶失水较明显，但常温下心叶尚能恢复；5级为所有叶片严重失水萎蔫，幼苗再置常温下不能恢复。按下式计算冷害指数。

冷害指数＝(1×S1+2×S2+3×S3+4×S4+5×S5+0×S0)/(每个处理株数×5)

式中，S0-S5分别为0-5级的苗株数。

1.3.2相对电导率的测定

先将黄瓜叶片鲜样用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗2次，用打孔器打取圆片，取0.5g圆片，装入大试管中，加入20ml蒸馏水，抽气3次，每次20min，第一次抽气后取出摇动，室温保持3-4h，多次摇动，采用雷磁(DDSJ-318)电导率仪测定电导率S1，封口沸水浴10min，冷却(可用冷水冲泡)，平衡10min后测定S2，同时测定蒸馏水S0。

计算公式：相对电导率(％)＝100×(S1-S0)/(S2-S0)

1.3.3丙二醛和抗氧酶活性的测定

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定，过氧化氢酶(CAT)的活性采用紫外分光光度法测定。

1.4数据处理

采用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 6软件处理数据和作图；SPSS17.0软件对数据进行单因素方差分析，并运用Duncan检验法对显著性差异(P＜0.05)进行多重比较。

2结果与分析

2.1 ABA和CaCl₂单独喷施对低温胁迫下黄瓜幼苗表型的影响

由图1表型可以看出，低温胁迫72h时，CK处理后黄瓜叶片(上数第二片)失水严重，边缘出现萎蔫黄化现象。与CK相比，S2和S5处理的叶片无明显的失水萎蔫现象，其他处理均出现了不同程度的萎蔫和黄化现象。

2.2 ABA和CaCl₂单独喷施对低温胁迫下黄瓜幼苗冷害指数和MDA含量的影响

冷害指数能反映黄瓜幼苗低温胁迫下的受害程度，分别使用浓度为15mg/L、25mg/L和35mg/L的ABA溶液对黄瓜幼苗叶片进行喷施处理。结果表明：当低温处理72h时，黄瓜幼苗出现不同程度的伤害。与CK相比，S1、S2和S3处理后冷害指数显著降低，分别降低了17.64％，67.64％和47.06％(P<0.05)(图2中的A)；同时，分别使用500mg/L、1000mg/L和1500mg/L的CaCl₂对黄瓜幼苗叶片进行喷施处理，结果表明：与CK相比，S4、S5和S6处理后冷害指数显著降低，分别降低了20.59％，32.35％和14.70％(P<0.05)(图2中的B)。说明外源喷施适宜浓度ABA和CaCl₂溶液可降低黄瓜幼苗的冷害指数，提高其抗低温能力。

MDA是膜脂过氧化作用的最终产物，细胞膜会因为MDA的积累受到伤害，因此MDA含量能用来表示膜脂过氧化的程度。冷害的发生机理被认为是最被认可的是“膜脂相变理论”，所以MDA常作为表征冷害程度的指标。测定低温处理72h时黄瓜叶片的MDA含量。与CK相比，S1、S2和S3处理后MDA含量显著降低，分别降低了7.68％，20.57％和12.48％(P<0.05)(图2中的C)；与CK相比，S4和S6处理后MDA含量无显著差异，S5处理MDA含量显著降低了22.99％(P<0.05)(图2中的D)。说明外源喷施适宜浓度ABA和CaCl₂溶液可以有效缓解膜脂过氧化产物的积累，从而提高黄瓜幼苗的抗冷能力。

综上，所有ABA处理中，S2处理(25mg/L)对提高黄瓜幼苗的抗低温能力效果最佳；所有CaCl₂处理中，S5处理(1000mg/L)对提高黄瓜幼苗的耐冷性效果最佳。

2.3 ABA和CaCl₂单独喷施对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片相对电导率的影响

分别使用浓度为15mg/L、25mg/L和35mg/L的ABA溶液对黄瓜幼苗叶片进行喷施处理。结果表明：当低温处理72h时，S1、S2和S3处理后黄瓜叶片相对电导率与CK相比显著降低，分别降低了22.57％，35.90％和29.43％(P<0.05)，其中以S2处理效果最佳(图3中的A)；同时，S4和S5处理后黄瓜叶片相对电导率与CK相比显著降低，分别降低了21.28％和26.58％(P<0.05)，S6处理后黄瓜叶片相对电导率与CK相比无显著差异(图3中的B)，因此以S5处理效果最佳。

综上所述，所有ABA处理中，S2处理(25mg/L)对提高黄瓜幼苗的抗低温能力效果最佳；所有CaCl₂处理中，S5处理(1000mg/L)对提高黄瓜幼苗的耐冷性效果最佳，均可以减少电解质的外渗，提高黄瓜幼苗的抗低温能力。

2.4 ABA和CaCl₂单独喷施对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

抗氧化酶可清除自由基并保护细胞膜系统，使细胞免受毒害作用。酶活性的高低可以直接反应细胞对逆境的适应性，与植物抗性成正相关。分别使用浓度为15mg/L、25mg/L和35mg/L的ABA溶液对黄瓜幼苗叶片进行喷施处理。结果表明：当低温处理72h时，与CK相比，S1、S2和S3处理后SOD酶活性显著升高，分别增加了12.61％，26.97％和17.22％(图4中的A)(P<0.05)，CAT酶活性显著升高，分别增加了23.08％，48.31％和22.47％(图4中的C)(P<0.05)；同时，分别使用500mg/L、1000mg/L和1500mg/L的CaCl₂对黄瓜幼苗叶片进行喷施处理，结果表明：与CK相比，S4和S5处理后SOD酶活性显著升高，分别增加了13.73％和20.06％(P<0.05)，S6处理后SOD酶活性无显著差异(图4中的B)；与CK相比，S4和S5处理后CAT酶活性显著升高，分别增加了27.24％和37.71％(P<0.05)，S6处理后CAT酶活性无显著差异(图4中的D)。说明外施适宜浓度ABA和CaCl₂溶液可有效地提高抗氧化酶活性，从而提高黄瓜幼苗的抗冷能力。

综上所述，所有ABA处理中，S2处理(25mg/L)对提高黄瓜幼苗的抗低温能力效果最佳；所有CaCl₂处理中，S5处理(1000mg/L)对提高黄瓜幼苗的耐冷性效果最佳。

2.5 ABA和CaCl₂复配组合处理对低温胁迫下黄瓜幼苗表型的影响

由图5所示，低温胁迫72h时，CK处理黄瓜幼苗叶片(上数第一片、第二片和第三片)严重萎蔫，叶片出现卷曲，部分叶片已出现黄化现象，其他处理较CK相比症状减轻，T1、T2、T4、T5和T6处理下的部分叶片边缘萎蔫卷曲，T7、T8和T9处理的叶片主要表现为叶片黄化严重，部分叶片出现萎蔫，可能是由于所施用的CaCl₂浓度较高，从而导致叶片黄化。T3处理效果最佳，叶片无明显失水萎蔫现象。

2.6 ABA和CaCl₂复配组合处理对低温胁迫下黄瓜幼苗冷害指数和MDA含量的影响

由图6可知，分别使用不同浓度的复配溶液对黄瓜叶片进行喷施处理。结果表明：低温胁迫72h时，与CK相比，各个处理冷害指数和MDA含量均显著降低，有效地缓解了低温对黄瓜幼苗的伤害。其中，与CK相比，T3处理的冷害指数和MDA含量分别显著降低了74.36％和41.70％(P<0.05)。综上所述，在9个处理中，通过冷害指数和叶片MDA含量共同分析比较，各个处理对提高黄瓜幼苗的耐冷性均取得了优于对照的效果。T3处理对提高黄瓜幼苗的耐冷性效果最好。

2.7 ABA和CaCl₂复配组合处理对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片相对电导率的影响

由图7可知，分别使用不同浓度的复配溶液对黄瓜叶片进行喷施处理。结果表明：低温胁迫72h时，与CK相比，各个处理的相对电导率均显著降低，有效地减少了电解质的外渗，一定程度上缓解了黄瓜幼苗的受害程度。与CK相比，T3处理的相对电导率显著降低了46.44％(P<0.05)，综上所述，T3处理对提高黄瓜幼苗的抗冷性效果最佳。

2.8 ABA和CaCl₂复配组合处理对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

当植物遭受低温胁迫时，活性氧大量积累会发生质膜过氧化，从而破坏细胞膜的结构。植物必须通过体内的抗氧化系统及时清除过多的活性氧，抗氧化酶有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等，对于防御活性氧伤害，维持细胞膜结构的完整性具有重要作用。由图8中的A可看出，各个处理均显著提高了黄瓜幼苗叶片的SOD酶活性，T3处理与CK和其他处理相比，显著提高了SOD酶活性(P<0.05)。与CK相比，T3处理的SOD酶活性显著提高了70.36％(P<0.05)，以清除过多的活性氧，缓解了低温对幼苗造成的伤害。同时，各个处理均提高了黄瓜幼苗叶片CAT酶活性(P<0.05)，在一定程度上保护细胞膜系统，缓解低温伤害。其中T3处理的CAT酶活性均显著高于CK和其他处理。与CK相比，T3处理的CAT酶活性显著提高了54.32％(P<0.05)(图8中的B)。综上所述，T3处理均显著提高了黄瓜幼苗叶片的抗氧化酶活性，从而提高了黄瓜幼苗的抗冷能力。

综上所述，ABA单独处理的最适浓度为25mg/L，CaCl₂单独处理的最适浓度为1000mg/L，复配组合处理的最适浓度为35mg/L ABA+500mg/L CaCl₂。低温胁迫下，复配组合处理(35mg/L ABA+500mg/L CaCl₂)对黄瓜幼苗叶片抗氧化酶活性的提高要优于单独ABA(25mg/L)或单独CaCl₂(1000mg/L)处理，复配组合处理下的冷害指数、MDA含量和相对电导率均低于单独ABA(25mg/L)或单独CaCl₂(1000mg/L)处理。

因此，单独喷施25mg/L的ABA或1000mg/L的CaCl₂均可缓解低温对黄瓜幼苗造成的伤害，但以复配组合处理(35mg/L ABA+500mg/L CaCl₂)的整体效果更优。