一种改性林蛙油的生产方法
阅读说明：本技术 一种改性林蛙油的生产方法 (Production method of modified wood frog oil ) 是由 房永清 刘志文 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种改性林蛙油的生产方法,包括净水产卵、受精卵处理、冷冻干燥、油卵分离等步骤,所得林蛙油即为改性林蛙油。本发明方法是根据林蛙胚胎发育特点,在不需要外界过多干预的情况下提取出不含性激素的纯净无杂质林蛙油,所得林蛙油已不具备传统林蛙油的形态、成分含量、药性等特点,但吸水膨胀率和气味与传统林蛙油相似,蛋白质含量与胚胎发育完成前的时间成反比,多肽、寡肽、氨基酸的含量与胚胎发育完成前的时间成正比。本发明方法不损害林蛙健康,正常产卵存活,延长了林蛙的利用周期,从传统的杀蛙取油升级为养蛙取“油”,对保护中国林蛙这一宝贵的种质资源,有序开发,合理利用,造福社会都具有重要意义。(The invention provides a production method of modified wood frog oil, which comprises the steps of water purification and egg laying, fertilized egg treatment, freeze drying, oil and egg separation and the like, and the obtained wood frog oil is the modified wood frog oil. The method is characterized in that pure forest frog oil without sex hormones is extracted without excessive external intervention according to the characteristics of the development of the embryo of the forest frog, the obtained forest frog oil does not have the characteristics of the form, the component content, the drug property and the like of the traditional forest frog oil, but the water absorption swelling rate and the smell are similar to the traditional forest frog oil, the protein content is inversely proportional to the time before the development of the embryo is finished, and the contents of polypeptide, oligopeptide and amino acid are proportional to the time before the development of the embryo is finished. The method does not damage the health of the wood frogs, enables the wood frogs to normally lay eggs and survive, prolongs the utilization period of the wood frogs, upgrades the traditional oil taking by killing the wood frogs into the oil taking by raising the wood frogs, and has important significance for protecting the valuable germplasm resource of the Chinese wood frogs, developing in order, reasonably utilizing and benefiting the society.)
技术领域
本发明涉及一种林蛙油的生产方法，特别涉及一种改性林蛙油的生产方法。
背景技术
林蛙油是我国传统的药品和保健食品，具有抗疲劳、调节人体内分泌等多种药效和保健作用(高峰等，2005)。林蛙油的主要成分是蛋白质，20世纪30年代就有日本学者对其进行成分分析，发现蛋白质含量占林蛙油总量的50％以上。林蛙油中氨基酸种类齐全，含量丰富。同时含有多种不饱和脂肪酸与酯类物质，维生素和微量元素的含量也很丰富(韩铁锁等，2008)。
林蛙油最为知名的药效为“滋阴”，也就是指对女性有特别的滋补效果。国内众多学者也因此对林蛙油中的性类固醇激素含量进行了检测，主要检测到雌二醇、睾酮，孕酮，促绒毛膜性腺激素，维生素Va及胆固醇等(王丽丽，2009)。不同的研究中检测到的性激素成分数值不尽相同，可能与检测方法和取样不同有关。林蛙油中雌二醇浓度有报道为25.03ng/g(胡鑫等，2003)，291.81pg/g(刘奇林等，1999)，
近年来，随着对林蛙油功效研究的进展，认为与生殖密切相关因子为性激素，林蛙油中的性激素含量也一直备受关注。性激素是通过相应受体发挥作用，对某些受体具有靶向亲和作用，表现为对某些已存在的肿瘤细胞的激励、亲和作用，造成肿瘤增生速度加快的现象，这也限制了林蛙油的食用和推广，对其产品开发应用产生了直接影响。
同时，现有的林蛙取油方式为杀蛙取油，每只林蛙至少需要培育3年方能进行捕杀取油，无法重复，不具有可持续性。
因此，需要发明一种改性林蛙油的生产方法，从传统的杀蛙取油升级为养蛙取“油”，在不对林蛙造成损伤的前提下，自然抱对产卵，每年可重复生产改性林蛙油。所谓改性林蛙油即是不具备传统林蛙油的形态、成分比例、药性特点的林蛙油衍生物，在无性激素(或含量极低未检出)的情况下，传承林蛙油以蛋白质为主要成分，拓展多肽、寡肽、氨基酸的含量，使其应用更安全、营养更全价，男女老少皆宜使用。使其产品在食品、药品、保健品、化妆品等领域能够拓展更为广阔的空间，从而对保护中国林蛙这一宝贵的种质资源、有序开发、合理利用、造福社会产生重要意义。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供一种改性林蛙油的生产方法，包括以下步骤：
(1)净水产卵：
每年4-5月份，于林蛙出蛰后进入繁殖前期捕捉，雌雄分离进入各自暂储池内预温，池水温度15-20℃，待雌蛙进入跌卵期后取出，雌雄按比例混合进入净水池抱对产卵；
(2)受精卵处理：
当卵排出雌蛙体外后，计时10-15分钟(受精率＞98％)捞出清洗后，置于20-24℃发育板上8-9小时，使受精卵发育至囊胚期结束后，迅速进入－18℃冰柜冷冻保存；
(3)冷冻干燥：
将冷冻蛙胚放入冷冻干燥机干燥，冻干参数为：预冻温度-18℃～-25℃，物料厚度1.0-1.5cm，真空度50～85Pa，干燥时间24-30小时，使干燥后的蛙胚含水率＜8％；
(4)油、卵分离：
将干燥品通过纱袋分离或过筛分离或风选分离或比重法净水分离的方法使林蛙卵、油分离，去除林蛙卵所得林蛙油即为改性林蛙油，再根据改性林蛙油的用途，进行性状处理。
步骤(1)净水产卵过程中，雌雄林蛙数量比为1:1.5。
步骤(4)油、卵分离过程中，所述的纱袋分离方法为：将蛙胚干燥品置于纱袋中揉搓，以不揉碎卵粒达到卵、油完全分离为标准，林蛙油呈碎片状析出纱袋，卵粒留在袋中，所得林蛙油即为改性林蛙油；纱袋孔径小于干燥卵粒直径，纱袋孔径规格优选为40目。如果孔径目数大于40目，孔径过小，则林蛙油无法充分析出，回收率低；如果孔径目数小于40目，孔径过大，则卵粒容易漏出混入林蛙油中，影响林蛙油纯度。
步骤(4)油、卵分离过程中，所述的过筛分离方法为：将蛙胚干燥品在密闭容器内揉搓，以不揉碎卵粒达到卵、油完全分离为标准，倒岀过40目筛网进行筛分，林蛙油筛出，卵粒留在筛网中，所得林蛙油即为改性林蛙油。
步骤(4)油、卵分离过程中，所述的风选分离方法为：将蛙胚干燥品在密闭容器内揉搓，以不揉碎卵粒达到卵、油完全分离为标准，倒岀利用风机进行风选分离，去除卵粒所得林蛙油即为改性林蛙油。
步骤(4)油、卵分离过程中，所述的比重法净水分离方法为：将蛙胚干燥品在密闭容器内揉搓，以不揉碎卵粒达到卵、油完全分离为标准，倒入装有净水的容器内，水量适中，利用比重法使卵、油自动分离，卵沉入水底，油浮在上层，在30秒内使用100目筛网迅速捞出上层浮油即为改性林蛙油。
本发明的原理：
在常规的林蛙取油时期(10-12月份)，正是林蛙怀卵储能时期，此时期雌雄林蛙体内的性激素含量逐渐升高，至冬眠期性激素水平稳定，当林蛙进入繁殖准备期，雌、雄蛙体内性激素水平达到峰值。林蛙油包被在卵细胞表面，当卵团脱离母体受精变成独立个体后，性激素已完成了其历史使命，在酶的作用下逐渐分解殆尽；同时，蛋白分解酶开始工作，对林蛙油蛋白质进行降解，其降解速率与胚胎发育时期相对应，以多肽、寡肽、氨基酸的形式，为初生蝌蚪备好了开口饵料。本发明研究发现当受精卵在20-24℃条件下发育8-9小时，胚胎发育进入囊胚期，此时的胚胎干燥品已检测不到雌激素的存在，并且此时林蛙油的蛋白质、多肽、寡肽、氨基酸等营养成分种类最为丰富，含量最高，已达到无性激素、高肽低蛋白的特征要求，这对于林蛙油新产品的研发具有重要意义。当卵排出雌蛙体外后，雄蛙即射精于卵团之上，并用后肢搅拌卵团，使卵充分受精。卵团在水中受精8分钟后的孵化结果证明，其孵化率＞98％。因此，受精时间控制在10-15分钟内能保证蛙卵已充分受精，且此时林蛙油吸水量相对较少，有利于冷冻干燥和油、卵分离操作，提高改性林蛙油收集率。
本发明的有益效果：
本发明方法根据林蛙胚胎发育特点，在遵循林蛙自然生态规律的前提下，不需要外界过多干预，提取出不含雌激素的高肽、低蛋白、纯净无杂质林蛙油。所得林蛙油已不具备传统林蛙油的形态、成分含量、药性，但吸水膨胀率和气味与传统林蛙油相似，蛋白质含量与胚胎发育完成前的时间成反比，同时多肽、寡肽、氨基酸的含量与胚胎发育完成前的时间成正比。多肽、寡肽、氨基酸含量高，且不含性激素，利于消化吸收，适用于绝大多数人群，老少皆宜。
本发明方法遵循林蛙自然生态规律，自然抱对产卵，不损害林蛙健康，延长了林蛙的利用周期，保证了林蛙的持续利用，对林蛙产业的可持续发展和生态保护都具有重要意义。
附图说明
图1为本发明雌二醇对照品HPLC色谱图；
图2为本发明林蛙油HPLC色谱图；
图3为本发明林蛙卵HPLC色谱图；
图4为本发明林蛙胚HPLC色谱图；
其中，横轴代表时间，纵轴代表紫外吸收值。
具体实施方式
实施例一：
本发明提供一种改性林蛙油的生产方法，包括以下步骤：
(1)净水产卵：
在中国长白山地区每年4-5月份，于林蛙出蛰后进入繁殖前期捕捉，雌、雄分别进入各自暂储池内预温，池水温度15-20℃，待雌蛙进入跌卵期后取出，按雌雄数量比1:1.5比例混合进入净水池抱对产卵；
(2)受精卵处理：
当抱对雌蛙排出卵团后，计时10分钟捞出、清洗，置于20℃发育板上9小时，使受精卵发育至囊胚期结束后，迅速进入－18℃冰柜冷冻保存；
(3)冷冻干燥：
将冷冻蛙胚放入冷冻干燥机干燥，冻干参数为：预冻温度-18℃，物料厚度1.0-1.5cm，真空度50～85Pa，干燥时间28小时，干燥后的蛙胚含水率＜8％；
(4)油、卵分离：
将干燥品置于孔径规格为40目纱袋中揉搓，以不揉碎卵粒达到卵、油完全分离为标准，林蛙油呈碎片状析出纱袋，卵粒留在袋中，分离率达96％，所得林蛙油即为改性林蛙油。
实施例二：
本发明提供一种改性林蛙油的生产方法，包括以下步骤：
(1)净水产卵：
在中国长白山地区每年4-5月份，于林蛙出蛰后进入繁殖前期捕捉，雌、雄分别进入各自暂储池内预温，池水温度15-20℃，待雌蛙进入跌卵期后取出，按雌雄数量比1:1.5比例混合进入净水池抱对产卵；
(2)受精卵处理：
当卵排出雌蛙体外后，计时12分钟捞出清洗后，置于22℃发育板上8.5小时，使受精卵发育至囊胚期结束后，迅速进入－18℃冰柜冷冻保存；
(3)冷冻干燥：
将冷冻蛙胚放入冷冻干燥机干燥，冻干参数为：预冻温度-20℃，物料厚度1.0-1.5cm，真空度50～85Pa，干燥时间26小时，干燥后的蛙胚含水率＜8％；
(4)油、卵分离：
将干燥品置于孔径规格为40目纱袋中揉搓，以不揉碎卵粒达到卵、油完全分离为标准，林蛙油呈碎片状析出纱袋，卵粒留在袋中，分离率达95％；所得林蛙油即为改性林蛙油。
实施例三：
本发明提供一种改性林蛙油的生产方法，包括以下步骤：
(1)净水产卵：
在中国长白山地区每年4-5月份，于林蛙出蛰后进入繁殖前期捕捉，雌、雄分别进入各自暂储池内预温，池水温度15-20℃，待雌蛙进入跌卵期后取出，按雌雄数量比1:1.5比例混合进入净水池抱对产卵；
(2)受精卵处理：
当卵排出雌蛙体外后，计时15分钟捞出清洗后，置于24℃发育板上8小时，使受精卵发育至囊胚期结束后，迅速进入－18℃冰柜冷冻保存；
(3)冷冻干燥：
将冷冻蛙胚放入冷冻干燥机干燥，冻干参数为：预冻温度-24℃，物料厚度1.0-1.5cm，真空度50～85Pa，干燥时间30小时，干燥后的蛙胚含水率＜8％；
(4)油、卵分离：
将干燥品在密闭容器内揉搓，以不揉碎卵粒达到卵、油完全分离为标准，倒入装有净水的容器内，利用比重法使卵、油自动分离，卵沉入水底，油浮在上层，在30秒内用100目筛网迅速捞出上层浮油即为改性林蛙油，分离率＞98％。
对实施例一至三所得改性林蛙油进行成分检测分析，改性林蛙油中不含雌二醇等性激素，其他成分与未改性林蛙油成分种类相似。
本发明对未改性的林蛙油微粉、林蛙卵微粉和林蛙胚微粉中雌二醇进行测定分析，对比分析未改性的林蛙油、林蛙卵和林蛙胚中雌二醇的含量结果如下：
一、试验材料
1.试验样品：
林蛙油微粉、林蛙卵微粉和林蛙胚微粉由吉林省蛙王生物工程有限公司提供。其中，林蛙卵通过本发明步骤(1)所获得；林蛙胚通过本发明步骤(1)和(2)所获得的受精卵在20-24℃条件下发育8-9小时所得。
2.对照品
雌二醇对照品购于成都埃法生物科技有限公司。
3.试剂
丙酮(分析纯)；甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；超纯水。
二、试验方法
1.对照品及供试品的配制
(1)对照品溶液制备
取雌二醇对照品2mg，精密称定，用甲醇定容于2mL容量瓶中得对照品储备液，稀释得0.016mg/ml的雌二醇对照品溶液。
(2)供试品溶液制备
取2g供试品粉末，精密称定，于锥形瓶中加入40mL丙酮；置于超声波清洗仪提取约30min后抽滤得滤液；滤液用旋转蒸发仪在45℃下减压蒸干滤液中溶剂丙酮；最后加入甲醇定容至2mL容量瓶即得供试品溶液；HPLC分析前，过0.22μm微孔滤膜过滤。
2.色谱条件
本次测定采用Agilent TC-C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱，以甲醇-水(60:40)为流动相，流速1.0mL/min；检测波长225nm；柱温30℃；进样量10μl。
三、检测结果
雌二醇对照品、林蛙油、林蛙卵和林蛙胚色谱图如图1-4所示，雌二醇含量分析如表1所示；
表1 林蛙油、林蛙卵和林蛙胚雌二醇含量(μg/g)
林蛙油
林蛙卵
林蛙胚
雌二醇
0.126
4.70
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四、结果分析
测定结果显示，在林蛙油微粉、林蛙卵微粉和林蛙胚微粉中，林蛙卵雌二醇含量最高为4.70μg/g，其次是林蛙油雌二醇含量为0.126μg/g，林蛙胚中未检出雌二醇。林蛙胚是改性林蛙油和发育卵的混合物，检测报告中林蛙胚不含雌二醇激素即可代表改性林蛙油不含雌二醇激素。
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