改善癌因性疲乏的复方灵芝孢子油及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 改善癌因性疲乏的复方灵芝孢子油及其制备方法和应用 (Compound ganoderma lucidum spore oil for improving cancer-induced fatigue and preparation method and application thereof ) 是由 冯鹏 胡浪 彭雅娟 陈晓红 华克伟 于 2021-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种改善癌因性疲乏的复方灵芝孢子油及其制备方法和应用,该复方灵芝孢子油是通过以下方法制备得到的：先将灵芝细粉和破壁灵芝孢子粉与分别制粒、干燥,得到灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子粉颗粒,将灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子粉颗粒按照重量比1-2：1-2范围混合后进行CO2超临界萃取,采用的萃取条件：萃取釜温度38～42℃,萃取釜压力30～35MPa,萃取时间3～4h,收集萃取液。发明方法得到的产品具有显著的改善癌因性疲乏的药理活性,且将灵芝子实体和破壁灵芝孢子颗粒按照一定的比例混合萃取可以起到协同增效的作用。(The invention discloses a compound ganoderma lucidum spore oil for improving cancer-induced fatigue and a preparation method and application thereof, wherein the compound ganoderma lucidum spore oil is prepared by the following steps: respectively granulating and drying the fine ganoderma powder and the wall-broken ganoderma spore powder to obtain ganoderma fruit body granules and wall-broken ganoderma spore powder granules, and mixing the ganoderma fruit body granules and the wall-broken ganoderma spore powder granules according to a weight ratio of 1-2: 1-2, and performing CO2 supercritical extraction under the following extraction conditions: the temperature of the extraction kettle is 38-42 ℃, the pressure of the extraction kettle is 30-35 MPa, the extraction time is 3-4 h, and the extract liquor is collected. The product obtained by the method has the pharmacological activity of obviously improving cancer-induced fatigue, and the ganoderma lucidum fruiting body and the wall-broken ganoderma lucidum spore particles are mixed and extracted according to a certain proportion to play a role in synergy.)
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种具改善癌因性疲乏的复方灵芝孢子油及其制备方法和应用。
背景技术
癌因性疲乏(Cancer Related Fatigue，CRF)指的是肿瘤或肿瘤治疗导致的，患者长时间处于紧张、痛苦而产生的疲乏感，患者可有虚弱、注意力难以集中、活动耐力较差、兴趣不足、动力下降等表现。常见于接受放疗、化疗以及生物治疗的肿瘤患者，在接受化疗/放疗的患者中，约80％患者可出现疲乏症状，严重影响患者的生活质量。中医药在改善疲乏症状方面具有独特的优势，对各种慢性疾病中的疲劳现象的研究较为广泛，但在癌因性疲乏中的研究尚不多见。
灵芝，性平味甘，为我国名贵的传统中药，中华传统医学长期以来一直视为滋补强身、固本扶正的珍贵中草药。经过大量临床研究，灵芝对免疫调节、辅助抑制肿瘤、神经衰弱、高脂血症、冠心病心绞痛、心律失常、保肝护肝、消化不良、气管炎等各有不同程度的疗效。
近二十多年来，灵芝孢子粉的药用效果也逐渐被消费者认识和接受。随着各项技术的发展，灵芝孢子粉的产量越来越高，其相关研究也逐渐增多，灵芝孢子油是通过超临界二氧化碳流体萃取技术从破壁的灵芝孢子中提取的油状脂质物，集成了灵芝孢子的多种活性成分。
中医认为，病情比较单纯，选用一种针对性强的药物即能获得疗效，它符合简便廉验的要求，便于使用和推广。但若病情较为复杂，单味药难以实现既分清主次，又全面兼顾的治疗要求时，便需同时使用两种以上的药物，药与药之间就会发生某些相互作用，如有些药物因产生协同作用而增进疗效，但是中药成分复杂，混合使用也有效果相悖的可能，临床用药时要充分注意的。
灵芝三萜是灵芝子实体和灵芝孢子粉中的主要有效成分之一，具有广泛的药理作用，由于它在灵芝中的含量低且不易分离，给三萜的深入研究和临床应用带来很大的限制。本发明将灵芝子实体与灵芝孢子粉进行配伍，经超临界CO2萃取技术，得到易于制剂的复方灵芝孢子油，并探索其对癌因性疲乏的改善作用。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处提供一种改善癌因性疲乏的复方灵芝孢子油。
本发明的另一目的是提供上述改善癌因性疲乏的复方灵芝孢子油的制备方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种改善癌因性疲乏的复方灵芝孢子油，该复方灵芝孢子油是通过以下方法制备得到的：先将灵芝细粉和破壁灵芝孢子粉与分别制粒、干燥，得到灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子粉颗粒，将灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子粉颗粒按照重量比1-2：1-2范围混合后进行CO2超临界萃取，采用的萃取条件：萃取釜温度38～42℃，萃取釜压力30～35MPa，萃取时间3～4h，收集萃取液。
上述灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子粉颗粒按照重量比1：1混合。
上述CO2超临界萃取前灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子粉颗粒混合物用质量浓度为95％乙醇浸泡1.5-2.5h。
将未浸泡和浸泡后得到的萃取物分别进行灵芝三萜测定，检验方法如下：
精密称取在105℃干燥至恒重的齐墩果酸对照品10mg，置于50ml容量瓶中，加氯仿溶解稀释至刻度，得齐墩果酸标准对照品溶液。
对照品溶液
精密吸取标准齐墩果酸对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8ml，分别置于10ml比色管中，加热挥去溶剂后，加入80g/L香草醛溶液0.5ml，硫酸溶液5.0ml，混匀后，于60℃水浴中保温30min，取出后冷水浴放置15min。在1cm比色皿中，以试剂空白液为参比调零，于波长500nm处测定吸光度，以吸光度对浓度进行回归，绘制标准曲线。
2.样品溶液
称取未浸泡萃取物与浸泡萃取物样品120～150mg，加氯仿溶解于100ml容量瓶中。
精密吸取样品溶液0.2ml至10ml比色管中，按对照品溶液项下“加热挥去溶剂后”进行操作，测定吸光度，计算含量。
3.计算
式中：
W-样品中总三萜的含量，％
C-从标准曲线中查得的齐墩果酸的含量，mg/ml
V-比色液体积，ml
F-稀释倍数
m-样品的质量，mg
4.结果：
发现浸泡后的萃取物灵芝三萜含量更高，优选95％乙醇浸泡1.5-2.5h。
上述改善癌因性疲乏的复方灵芝孢子油的制备方法包括以下步骤：
先将灵芝细粉和破壁灵芝孢子粉与分别制粒、干燥，得到灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子粉颗粒，将灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子粉颗粒按照重量比1-2：1-2范围混合后进行CO2超临界萃取，采用的萃取条件：萃取釜温度38～42℃，萃取釜压力30～35MPa，萃取时间3～4h，收集萃取液。优选灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子粉颗粒按照重量比1：1混合。优选在CO2超临界萃取前灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子粉颗粒混合物用质量浓度为95％乙醇浸泡1.5-2.5h。
本发明所述复方灵芝孢子油在制备改善癌因性疲乏的药物中应用具有显著的效果。
与现有技术比较本发明的有益效果：本发明方法得到的产品具有显著的改善癌因性疲乏的药理活性，且将灵芝子实体颗粒和破壁灵芝孢子颗粒按照一定比例混合萃取，可以起到协同增效的作用。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行解释说明：
实施例1
1)用粉碎机将灵芝粉碎，过40～50目筛，得灵芝细粉。灵芝细粉加入灵芝细粉重量30％水，制粒机中制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得灵芝颗粒。
2)取灵芝孢子粉，破壁机中破壁，破壁率达70％。将破壁好的灵芝孢子粉加入破壁后的灵芝孢子粉重量30％水，制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得破壁灵芝孢子粉颗粒。
3)灵芝颗粒与破壁灵芝孢子粉颗粒等比例混合，投入超临界萃取设备内，用同比例重量的95％乙醇进行浸泡2h，将浸泡后的混合物进行CO2超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度40℃，萃取釜压力30MPa，萃取时间3h，收集萃取液，得到复方灵芝孢子油，为含有油状物质的深棕色的乙醇液体，除去乙醇，得深棕色的油状液体，过滤，此复方灵芝孢子油中三萜含量57.5％，萃取率13.6％。
实施例2
1)取灵芝孢子粉，破壁机中破壁，破壁率达70％。将破壁好的灵芝孢子粉加入破壁后的灵芝孢子粉重量30％水，制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得破壁灵芝孢子粉颗粒。
2)将破壁灵芝孢子粉颗粒投入超临界萃取设备内，用同比例的95％乙醇进行浸泡2h，将浸泡后的破壁灵芝孢子粉颗粒进行CO2超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度40℃，萃取釜压力30MPa，萃取时间3h，收集萃取液，为含有油状物质的棕色的乙醇液体，除去乙醇，得棕色的油状液体，过滤。此萃取物中三萜含量15.4％，萃取率22.4％。
实施例3
1)用粉碎机将灵芝粉碎，过40～50目筛，得灵芝细粉。灵芝细粉加入灵芝细粉重量30％水，制粒机中制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得灵芝颗粒。
2)将灵芝颗粒投入超临界萃取设备内，用同比例的95％乙醇进行浸泡2h，将浸泡后的灵芝颗粒进行CO2超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度40℃，萃取釜压力30MPa，萃取时间3h，收集萃取液，为含有膏状物质的深棕色的乙醇液体，除去乙醇，得深棕色的膏状固体，过滤。此萃取物中三萜含量61.4％，萃取率2.6％。
实施例4
1)用粉碎机将灵芝粉碎，过40～50目筛，得灵芝细粉。灵芝细粉加入灵芝细粉重量30％水，制粒机中制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得灵芝颗粒。
2)取灵芝孢子粉，破壁机中破壁，破壁率达70％。将破壁好的灵芝孢子粉加入破壁后的灵芝孢子粉重量30％水，制粒，真空干燥箱中60℃烘干2h，得破壁灵芝孢子粉颗粒。
3)灵芝颗粒与破壁灵芝孢子粉颗粒按照1:2的重量比例混合，投入超临界萃取设备内，用同比例重量的95％乙醇进行浸泡2h，将浸泡后的混合物进行CO2超临界萃取，萃取条件：萃取釜温度40℃，萃取釜压力30MPa，萃取时间3h，收集萃取液，得到复方灵芝孢子油，为含有油状物质的深棕色的乙醇液体，除去乙醇，得深棕色的油状液体，过滤，此复方灵芝孢子油中三萜含量44.2％，萃取率17.5％。
试验例1
以下通过药效实验对本发明进行进一步说明：
1.实验目的：探究复方灵芝孢子油对癌因性疲乏荷瘤小鼠的改善作用。
2.实验材料
2.1受试药物1：复方灵芝孢子油(按照实施例1方法制备得到)
配制方法：复方灵芝孢子油高剂量为1g/kg*日，中剂量为0.67g/kg*日，低剂量为0.33g/kg*日。复方灵芝孢子油密度为0.8g/mL，分别精密量取0.325mL、0.218mL及0.107mL复方灵芝孢子油，再分别加入2.275mL、2.382mL及2.493mL大豆油，充分混匀，每日灌胃给药，给药体积0.2mL。
受试药物2：灵芝孢子油(按照实施例2方法制备得到)
配制方法：灵芝孢子油剂量为0.67g/kg*日。灵芝孢子油密度为0.8g/mL，精密量取0.218mL灵芝孢子油，再加入2.382mL大豆油，充分混匀，每日灌胃给药，给药体积0.2mL。
受试药物3：灵芝萃取物(按照实施例3方法制备得到)
配制方法：灵芝萃取物剂量为0.67g/kg*日。精密称取0.174g灵芝萃取物，再加入2.382mL大豆油，充分混匀，每日灌胃给药，给药体积0.2mL。
受试药物4：复方灵芝孢子油(按照实施例4方法制备得到)
配制方法：复方灵芝孢子油剂量为0.67g/kg*日。复方灵芝孢子油密度为0.8g/mL，精密量取0.218mL复方灵芝孢子油，再加入2.382mL大豆油，充分混匀，每日灌胃给药，给药体积0.2mL。
造模药物：注射用环磷酰胺(安道生)生产厂家：Baxter Oncology GmbH批号：5N053A
配制方法：环磷酰胺给药剂量为30mg/kg*日。将1瓶(0.2g)注射用环磷酰胺充分溶解于10mL无菌生理盐水，以2.7mL每管分装并于-20℃保存，临用前充分化冻，并加入15.3mL无菌生理盐水稀释至给药浓度，隔日腹腔注射给药，给药体积0.2mL。
2.2实验试剂
肝/肌糖原测定试剂盒(比色法)：南京建成生物工程研究所出品，货号A043-1-1；浓硫酸：南京试剂厂出品，货号：C0680150225
2.3实验细胞
小鼠Lewis肺癌细胞来源于ATCC。细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基。培养于37℃含5％CO2的恒温培养箱。
2.4实验动物
品系及级别：SPF级C57BL/6小鼠生产厂家：常州卡文斯实验动物有限公司许可证号：SCXK(苏)2016-0001；周龄：5-6周性别：雌；饲料：小鼠维持饲料，南京市江宁区青龙山动物繁殖场出品饲养条件：空调房间，温度18-24℃，相对湿度70％
2.5实验仪器
酶标仪：Molecular Devices,Inc水浴锅：常州国华电器有限公司小鼠旷场实验系统：CleverSys,Inc小鼠悬尾实验系统：CleverSys,Inc小鼠强迫游泳实验系统：CleverSys,Inc
3.实验方法
3.1实验分组
3.2实验方法
收集小鼠Lewis肺癌细胞，并调整密度为4×106/mL，按0.2mL/只将细胞悬液注射于小鼠腋窝皮下进行接种，接种后第5天，开始按上述组别进行给药，连续干预15天。实验周期共20天。在实验期间对小鼠进行观测，在出现活动减少，皮色变暗，体重减轻时开始旷场实验、悬尾实验及强迫游泳实验等行为学实验，并记录相关指标。实验结束日处死动物，取瘤，称重并拍照。取肝，液氮瞬冻并于-80℃保存，此后运用试剂盒测量肝糖原含量。
3.3检测指标
3.3.1动物体重：分别记录小鼠初始体重，给药第1天、第5天、第10天及第15天体重。
3.3.2脑力疲乏：小鼠旷场实验可作为脑力疲乏的评定标准之一。观察小鼠在开阔箱正中格内的活动情况，包括在正中格停留次数、方格间穿行次数即三爪以上跨入临格的次数、竖起时间即两前肢离地1cm以上的时间。
3.3.3体力疲乏：小鼠尾悬挂实验可作为体力疲乏的评定标准之一。将小鼠尾端2cm的部位固定，使其呈倒挂状态，其头部离地面5～6cm，用木板隔开相邻动物的视线，适应1min后，记录每只小鼠5min内的累计不动时间。力竭游泳实验也可作为体力疲乏的评定标准之一。准备重量相当于7％小鼠体重的配重物，用医用胶布粘于小鼠尾部，将小鼠放入水温25℃±1℃的游泳箱中进行游泳测试，直至其力量耗竭，下沉不起，记录所经历的时间。
3.3.4瘤重和抑瘤率：分别记录各组瘤重，与Lewis肺癌组进行比较，计算抑瘤率。抑瘤率计算公式：抑瘤率(％)＝100-(给药组平均瘤重/Lewis肺癌组平均瘤重)
*100％
3.3.5肝糖原含量：分别测量各组小鼠肝糖原含量。
4.实验结果
4.1瘤重及抑瘤率
实验结束时，动物称重，剥除肿瘤，称取瘤重，计算抑瘤率。如表1所示，各给药组与Lewis肺癌组相比瘤重均出现了极显著下降(***p<0.001)。抑瘤率结果显示各药物均能在体内有效抑制Lewis肺癌细胞增殖，实施例1复方效果最好。
表1.各给药组抑瘤率(N＝10，data＝Mean±SD)
注：与Lewis肺癌组相比，***p<0.001。
4.2脑力疲乏实验结果
小鼠在旷场中心停留次数可作为其脑力疲乏的衡量指标之一。中心停留次数越多，脑力越疲乏。表2结果显示，Lewis肺癌组小鼠旷场中心停留次数显著高于空白对照组(*p<0.05)；给予药物干预后，各组小鼠旷场中心停留次数均显著低于Lewis肺癌组(###p<0.001)，脑力疲乏得到显著缓解。其中，实施例1复方灵芝孢子油三个剂量和环磷酰胺的联用组均较为为明显。
表2.各组小鼠旷场中心停留次数(N＝10，data＝Mean±SD)
组别
旷场中心停留次数
空白对照组
30.20±4.96
Lewis肺癌组
45.50±21.96<sup>*</sup>
实施例1复方灵芝孢子油(高)+环磷酰胺组+Lewis肺癌
10.50±4.12<sup>###</sup>
实施例1复方灵芝孢子油(中)+环磷酰胺组+Lewis肺癌
13.40±9.11<sup>###</sup>
实施例1复方灵芝孢子油(低)+环磷酰胺组+Lewis肺癌
12.45±10.37<sup>###</sup>
实施例2灵芝孢子油+环磷酰胺组+Lewis肺癌
18.63±9.61<sup>###</sup>
实施例3灵芝萃取物+环磷酰胺组+Lewis肺
16.70±7.36<sup>###</sup>
实施例4复方灵芝孢子油(中)+环磷酰胺组+Lewis肺癌
21.56±9.10<sup>###</sup>
环磷酰胺组+Lewis肺癌
19.50±11.23<sup>###</sup>
注：与空白对照组相比，*p<0.05；与Lewis肺癌组相比，###p<0.001。
4.3体力疲乏实验结果
小鼠尾悬挂实验可作为其体力疲乏的评定标准之一。小鼠挣扎时间占比越短，小鼠体力越疲乏。表3结果显示，Lewis肺癌小鼠挣扎时间占比显著低于空白对照组(**p<0.01)；给予药物干预后，各组小鼠挣扎时间占比均显著高于Lewis肺癌组(#p<0.05)，体力疲乏得到一定程度缓解。
此外，力竭游泳实验也可作为体力疲乏的另一评定标准。小鼠在水中活动越短，小鼠体力越疲乏。结果表4所示，Lewis肺癌小鼠挣扎时间占比显著低于空白对照组(***p<0.001)；给予药物干预后，除环磷酰胺组外(*p>0.05)，各组小鼠挣扎时间占比均显著高于Lewis肺癌组(#p<0.05)，体力疲乏得到显著缓解。由于环磷酰胺具有多系统毒性，我们推测环磷酰胺组实验小鼠体力疲乏是由于环磷酰胺累积毒性引起的。而其他联用组均能够有效改善小鼠体力疲乏。
表3.各组小鼠悬尾挣扎时间占比(N＝10，data＝Mean±SD)
注：与空白对照组相比，**p<0.01；与Lewis肺癌组相比，#p<0.05。
表4.各组小鼠力竭游泳停止挣扎时间(N＝10，data＝Mean±SD)
注：与空白组相比，***p<0.001；与Lewis肺癌组相比，#p<0.05。
4.4肝糖原检测
疲乏和困倦是胰岛素抵抗的重要表现。肝胰岛素抵抗的本质是胰岛素抑制内源性葡萄糖生成的能力减弱和肝糖原合成减少。因此通过测定肝糖原含量能有效反映药物对疲乏和困倦的缓解程度。肝糖原含量测定实验结果(表5)显示，Lewis肺癌组小鼠肝糖原含量极显著低于空白对照组(***p<0.001)；给予药物干预后，多组小鼠肝糖原含量得到显著回升(##p<0.01)，其中实施例1复方灵芝孢子油(高)+环磷酰胺组、复方灵芝孢子油(低)+环磷酰胺组回升最为显著，环磷酰胺组单用也有一定回升作用。
表5各组小鼠肝糖原含量(N＝10，data＝Mean±SD)
组别
小鼠肝糖原含量(mg/g组织)
空白对照组
5.01±1.306
Lewis肺癌组
2.185±0.7102<sup>***</sup>
实施例1复方灵芝孢子油(高)+环磷酰胺组+Lewis肺癌
7.833±2.675<sup>###</sup>
实施例1复方灵芝孢子油(中)+环磷酰胺组+Lewis肺癌
2.239±1.094
实施例1复方灵芝孢子油(低)+环磷酰胺组+Lewis肺癌
7.463±1.867<sup>###</sup>
实施例2灵芝孢子油+环磷酰胺组+Lewis肺癌
3.8±0.9194<sup>##</sup>
实施例3灵芝萃取物+环磷酰胺组+Lewis肺癌
3.546±2.309<sup>##</sup>
实施例4复方灵芝孢子油(低)+环磷酰胺组+Lewis肺癌
3.955±0.6356<sup>##</sup>
环磷酰胺组+Lewis肺癌
5.696±1.987<sup>##</sup>
注：与空白组相比，***p<0.001；与Lewis肺癌组相比，##p<0.01，###p<0.001。
4.5实验结论
本实验癌因性疲乏模型造模成功。各给药组均能显著抑制Lewis肺癌皮下移植瘤增殖。各给药组合均能显著缓解癌因性疲乏小鼠脑力疲乏，对癌因性疲乏小鼠体力疲乏也有一定缓解作用。实施1复方灵芝孢子油各剂量对癌因性疲乏荷瘤小鼠均有改善作用。
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