一种基于斑马鱼模型对水体中毒物进行快速预警的方法
阅读说明：本技术 一种基于斑马鱼模型对水体中毒物进行快速预警的方法 (Method for quickly early warning poison in water body based on zebra fish model ) 是由 吴元钊 徐帆 张安慧 王培淋 刘晋熙 王嘉雯 王帅 俞逸娴 祝鑫宇 王斌杰 许中 于 2021-04-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于斑马鱼模型对水体中毒物进行快速预警的方法,包括：(1)向96孔板中加入待测水体,然后加入斑马鱼幼鱼；(2)采集斑马鱼幼鱼的自发运动情况,并进行行为学数据处理；(3)根据行为学数据处理结果,判断水体中是否存在毒物。本发明采用斑马鱼作为生物模型,能够快速高效地获得水环境中的毒物情况,尤其是低浓度毒物的情况。(The invention discloses a method for quickly early warning toxicants in a water body based on a zebra fish model, which comprises the following steps: (1) adding a water body to be detected into a 96-well plate, and then adding zebra fish juvenile fish; (2) collecting the spontaneous movement condition of the zebra fish juvenile fish, and performing behavioural data processing; (3) and judging whether the water body has poison or not according to the behavioral data processing result. The method adopts zebra fish as a biological model, and can quickly and efficiently obtain the condition of toxicants in the water environment, particularly the condition of low-concentration toxicants.)
技术领域
本发明属于毒物分析领域，具体涉及一种基于斑马鱼模型对水体中毒物进行快速预警的方法。
背景技术
食品安全与环境污染问题一直是大众讨论的热点，各类中毒事件层出不穷，对人们的生命安全造成了巨大的威胁。研究剧毒物质急性毒性评价的方法，有利于快速分辨剧毒物种类、锁定致毒源头。自20世纪70年代以来，斑马鱼作为一种新型模式动物在生态毒理、环境监测、生物病理、药物筛选等领域的科学研究中被广泛的使用，因其本身繁殖能力强、易于饲养管理、发育迅速，与人类基因相似度达到87％，有丰富的毒性反应指标，可通过对斑马鱼生长发育状况观察来模拟环境中各类剧毒物质生态学影响，非常适合建立毒性筛查模型。基于斑马鱼模型进行剧毒物质检测，可以拓宽传统检测技术的检测范围，提高检测通量的同时兼具成本低的优点。近年越来越多的研究报道指出，斑马鱼模型可用于环境中许多化合物如有害重金属盐、双酚A、苯酚、环己胺、有机氯、及卤代芳香烃化合物等致癌物的累积效应和毒性效应的检测。自从斑马鱼进入研究者的视线，其优良的自身潜能及独特优势相比于其他动物模型具备更好的实验条件，为剧毒物质毒性评价的发展拓宽了新的研究思路。
目前，针对斑马鱼及转基因斑马鱼的常规毒性等实验技术已经成熟，实现了斑马鱼的多类毒理学评价指标对相关剧毒物质进行评价，但仍存在评价的剧毒物种类不全面、毒物评价指标不统一以及毒性实验时间较长等缺陷。传统的毒性试验测试斑马鱼在24、48、72和96h的染毒环境下的半致死率LC50，对化合物的毒性具有非常好的评价，但是很少有研究对接触毒物后2h内的毒性进行快速评估。短时间内获得水体的毒性评价，对于公安相关领域具有非常重要的作用。例如在重大活动的食品安保中，我们需要排除食品被未知毒物投毒污染的安全隐患；在剧毒物质或污染物的大规模泄露事件，我们需要尽早获得水环境对生物的毒性数据。
发明内容
本发明提供了一种基于斑马鱼模型对水体中毒物进行快速预警的方法，该方法能够快速获得水环境对生物的毒性数据。
本发明的技术方案如下：
一种基于斑马鱼模型对水体中毒物进行快速预警的方法，包括：
(1)向96孔板中加入待测水体，然后加入斑马鱼幼鱼；
(2)采集斑马鱼幼鱼的自发运动情况，并进行行为学数据处理；
(3)根据行为学数据处理结果，获得水体的毒性数据。
作为优选，所述的斑马鱼幼鱼为鱼龄为6天的斑马鱼。
作为优选，步骤(1)中，待测水体中的毒物包括：氰化钾、甲基对硫磷、氟乙酰胺、敌鼠、氟鼠灵、氯杀鼠灵、氯鼠酮、杀鼠醚、鼠得克、溴鼠灵、溴敌隆、莨菪碱或东莨菪碱。
作为优选，步骤(2)中，采集斑马鱼幼鱼的自发运动情况，分别在全暗环境下、全亮环境下和明暗交替环境下进行。
作为进一步的优选，步骤(2)中，DanioVision高通量鱼类行为跟踪系统中，采用Ethovision XT 14软件追踪采集60～120min内斑马鱼幼鱼的自发运动情况；
采集斑马鱼幼鱼的自发运动情况，分别在明暗交替环境下进行。
作为优选，步骤(2)中，所述的明暗交替环境下具体为：10min全亮环境，然后10min全暗环境，重复循环。
作为优选，步骤(2)中，所述的自发运动情况包括游动轨迹、游动平均距离、游动最大速度、最大加速度、形态变化、死亡特征点。
作为优选，步骤(3)中，水体的毒性数据包括水体中是否存在毒物以及毒性大小。进一步地，根据移动距离的长短确定毒性的大小。
进一步地，所述待测水体中可能含有未知毒物，根据根据移动距离的长短可以估算毒物是否存在以及毒性的大小。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明采用斑马鱼作为生物模型，能够快速高效地获得水环境中的毒物情况，尤其是低浓度毒物的情况。
附图说明
图1为实施例1中全暗环境下不同浓度氰化钾溶液对斑马鱼游动平均距离的影响；
图2为实施例1中全亮环境下不同浓度氰化钾溶液对斑马鱼游动平均距离的影响；
图3为实施例1中明暗交替环境下不同浓度氰化钾溶液对斑马鱼游动平均距离的影响；
图4为实施例1中60～120min时不同浓度氰化钾溶液对斑马鱼行为能力(游动轨迹、游动平均距离、游动最大速度、最大加速度、形态变化、死亡特征点)的影响；
图5为不同时间段氰化钾溶液对斑马鱼移动距离的影响；
图6为实施例2中不同时间段氯杀鼠灵溶液对斑马鱼行为能力的影响；
图7为实施例3中不同时间段溴鼠灵溶液对斑马鱼行为能力的影响；
图8～20为实施例4～16中不同毒物溶液在60-120min时间段于明暗交替的检测环境下对斑马鱼行为能力的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明做进一步的描述，本发明所用的材料与设备如下。
实验动物：
本研究中所使用的亲代斑马鱼均为实验室饲养的野生型AB品系斑马鱼(WT/AB)，购自上海吉荧生物技术有限公司，实验中从国家斑马鱼中心购置补充种鱼，避免近亲繁殖。本实验所需的所有胚胎、幼鱼都采用健康6月龄种鱼产卵、孵化的方式获取。
斑马鱼养殖条件，水环境pH控制在7.0至8.0，水温控制在28℃左右，离子强度500-1500，一天内的明暗时间比为7:5。每天用丰年虾喂食2至3次。
仪器与设备：
ZW-H3000显微镜(中微科创，深圳)、Ethovision XT 14行为检测系统(诺达思，荷兰)、Pacific RO超纯水机(赛默飞世尔，美国)恒温培养箱(龙跃，上海)、自动水循环养殖系统(自制)、高压灭菌锅(赛默飞世尔，美国)、电子分析天平(赛多利斯，德国)、孵化盒(海圣，上海)、移液枪(艾本德，德国)、MS1 Minshaker(IKA)型涡旋振荡器、BSA224S-CW(sartorius)型分析天平、96孔圆孔板、96孔方孔板、培养皿、吸管等。
试剂：
E3培养液：分别称取NaCl 17.2g、KCl 0.76g、CaCl2 2.91g、MgSO4·7H2O 4.9g，用双蒸水H2O溶解后配置成1L的E3培养液。
剧毒物溶液：配制0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、500mg/L的剧毒物质的E3溶液)。其中针对不溶于水的剧毒物，加入DMSO助溶剂，保证DMSO在最终的溶液中含量为均为0.1％。
一般实验方法：
以96孔培养板为例，通过注射器吸取270uL含有一条斑马鱼幼鱼的空白对照E3溶液，加入培养板中。每个浓度设置12个重复孔。最后每孔统一加入对应浓度的30uL的剧毒物溶液，混合后静置马上通过系统进行观测。
斑马鱼幼鱼的获取：
斑马鱼幼鱼的观察能够实现高通量，结合相关文献报道的斑马鱼幼鱼行为学能力的发育情况，本实验使用鱼龄为6天(6dpf)的斑马鱼进行实验。斑马鱼胚胎采用种鱼产卵的方式获取。在使用斑马鱼幼鱼之前的第七天的晚上挑选6个月左右健康成熟的WT/AB系成年雌雄斑马鱼，按照雄雌比2:1放入产卵缸(雌雄斑马鱼用隔板分开)，将交配缸转移至黑暗环境中，14h后抽去隔板，将孵化盒转移到光照环境中，使雌鱼与雄鱼交配。约20min后获取胚胎并将其转移至培养皿。用E3溶液冲洗胚胎2-3次，将收集好的胚胎放入28℃恒温培养箱备用。及时剔除已经发白死亡的鱼卵。
斑马鱼幼鱼的处理方法：
将96孔板置于DanioVision高通量鱼类行为跟踪系统中，采用Ethovision XT 14软件追踪采集2h内斑马鱼幼鱼的自发运动情况，以此作为依据统计游动轨迹、游动平均距离、游动最大速度、最大加速度、形态变化、死亡特征点。记录死亡数量，记录异常行为，使用软件采集各组幼鱼的行动轨迹，进行行为学数据处理。
数据处理方法
实验数据运用SPASS 16.0软件的单因素方差进行处理，计算每种毒物造成斑马鱼行为能力显著差异的浓度。
实施例1
采用注射器吸取270uL含有一条斑马鱼幼鱼的空白对照E3溶液，加入96孔培养板的孔中。然后向每孔加入30uL不同浓度的KCN水溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)，每个浓度设置12个重复孔，混合后静置马上通过DanioVision高通量鱼类行为跟踪系统进行观测，分别在全暗环境、全亮环境和明暗交替环境下采用Ethovision XT 14软件追踪采集2h内斑马鱼幼鱼的自发运动情况，以此作为依据统计游动轨迹、游动平均距离、游动最大速度、最大加速度、形态变化、死亡特征点。记录死亡数量，记录异常行为，使用软件采集各组幼鱼的行动轨迹，进行行为学数据处理，试验结果见图1～图4，其中，图1为全暗环境下不同浓度氰化钾溶液对斑马鱼游动平均距离的影响，图2为全亮环境下不同浓度氰化钾溶液对斑马鱼游动平均距离的影响，图3为明暗交替环境下不同浓度氰化钾溶液对斑马鱼游动平均距离的影响(明暗交替时间间隔为10分钟)，图4为60～120min时不同浓度氰化钾溶液对斑马鱼行为能力(游动轨迹、游动平均距离、游动最大速度、最大加速度、形态变化、死亡特征点)的影响，图5为不同时间段氰化钾溶液对斑马鱼移动距离的影响。
实验结果表明，斑马鱼幼鱼在接触剧毒物质氰化钾溶液后，不同的行为学检测环境下表现差异明显。在全暗环境中，空白组的斑马鱼在120分钟内活动能力明显比其他浓度的斑马鱼高，一直保持在每2min移动距离为50mm左右，但是各个浓度下斑马鱼的活动能力随时间变化很大，且不同浓度之间的移动距离区分度不明显。在全亮环境下，斑马鱼幼鱼在不同氰化钾溶液染毒后，移动距离变化很大，且多个时间段出现高浓度移动比低浓度高的情况。在明暗交替的检测环境下(10min亮+10min暗，重复循环)，观测到斑马鱼幼鱼出现稳定的周期性变化，而且在观测后期，呈现出浓度相关的行为学能力，由此确定明暗交替的检测环境。在接触氰化钾0-60min内，我们发现结果呈现出随着浓度上升，移动距离下降的规律。当氰化钾浓度超过1mg/L时，斑马鱼幼鱼的行为学能力显著下降，有统计学意义。更高浓度的氰化钾溶液，斑马鱼幼鱼的行为学能力下降更明显。这个规律在接触毒物60-120min内同样存在，说明斑马鱼幼鱼接触氰化钾溶液后，在早期(0-60min)的毒性反应和后期相同(60-120min)。
实施例2
操作方法与实施例1基本相同，不同之处在于采用氯杀鼠灵溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)代替氰化钾溶液，测定不同时间段氯杀鼠灵造成斑马鱼的行为能力变化，结果见图6。在接触氯杀鼠灵0-60min内，我们统计了不同浓度下斑马鱼的移动距离，发现结果呈现出随着浓度上升，移动距离呈现倒U型变化的规律。当氯杀鼠灵溶液浓度为1mg/L时，斑马鱼幼鱼的行为学能力显著上升，有统计学差异。更高浓度的氯杀鼠灵溶液，如10mg/L，斑马鱼幼鱼的行为学能力上升更明显，有统计学差异。当浓度为当浓度到50mg/L时，与空白没有明显差异。这个规律在接触毒物60-120min内不存在，说明斑马鱼幼鱼接触氯杀鼠灵溶液后，在早期(0-60min)的毒性反应和后期不同(60-120min)，早期以剧烈的应急反应为主，后期则能正确体现毒性规律。
实施例3
操作方法与实施例1基本相同，不同之处在于采用溴鼠灵溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)代替氰化钾溶液，测定不同时间段氯杀鼠灵造成斑马鱼的行为能力变化，结果见图7。在接触溴鼠灵0-60min内，我们统计了不同浓度下斑马鱼的移动距离，发现结果呈现出随着浓度上升，移动距离没有呈现出明显变化的规律。这个规律在接触毒物60-120min内不存在，说明斑马鱼幼鱼接触氰化钾溶液后，在早期(0-60min)的毒性反应和后期不同(60-120min)，早期以适应反应为主，后期则能正确体现毒性规律。
实施例4～16
本实施例操作方法与实施例1基本相同，分别采用氰化钾溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、敌鼠溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、氟鼠灵溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、氯杀鼠灵溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、杀鼠醚溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、鼠得克溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、溴敌隆溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、溴鼠灵溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、氟乙酰胺溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、氯鼠酮溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、甲基对硫磷溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、东莨菪碱溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)、莨菪碱溶液(0.01mg/L，0.1mg/L,1mg/L,10mg/L,50mg/L)作为测试毒物，测试环境为在明暗交替的检测环境下(10min亮+10min暗，重复循环)，检测时间为60-120min，测定不同时间段不同毒物造成斑马鱼的行为能力变化，结果见图8～20，统计得到的预警模型见表1。
表1不同毒物染毒60-120min后斑马鱼幼鱼的行为能力
*代表显著性p值<0.01，**代表显著性p值<0.001，***代表显著性p值<0.0001。
通过数据的归一化处理，我们发现当常见的毒物浓度超过1mg/L以上时(除了敌鼠和氯杀鼠灵)，均观测到斑马鱼幼鱼移动距离显著下降。当浓度到达10mg/L时，所有毒物都导致鱼类显著的行为能力下降，体现出我们模型的灵敏性。
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