一种快速检测血浆硫酸吲哚酚的电化学方法
阅读说明：本技术 一种快速检测血浆硫酸吲哚酚的电化学方法 (Electrochemical method for rapidly detecting indoxyl sulfate in blood plasma ) 是由 张晓清 朱阳 丁敏 蒋梦丹 李彦茹 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种快速检测血浆硫酸吲哚酚的电化学方法。本发明采用免修饰丝网印刷碳电极,结合示差脉冲伏安法可有效降低背景电流的优点,采用示差脉冲伏安法进行电化学检测,根据电化学响应信号与待测物浓度间的线性关系,实现血浆中硫酸吲哚酚的快速定量检测。本发明所用仪器设备小型,丝网印刷碳电极具有设计简单、价格低廉、一次性使用、样品用量少、可微型化等优点,所述电化学检测方法简便快速,具有较好的重复性、稳定性和准确度,能实现血浆中硫酸吲哚酚的快速定量检测,有助于了解硫酸吲哚酚在妊娠期糖尿病中的代谢情况,为该疾病及其并发症的发生机制、诊断、治疗及预后提供实验室依据。(The invention discloses an electrochemical method for rapidly detecting indoxyl sulfate in blood plasma. According to the invention, a modification-free screen printing carbon electrode is adopted, the advantage of background current reduction can be effectively realized by combining with the differential pulse voltammetry, electrochemical detection is carried out by adopting the differential pulse voltammetry, and the rapid quantitative detection of indoxyl sulfate in plasma is realized according to the linear relation between an electrochemical response signal and the concentration of a substance to be detected. The instrument and equipment used by the invention are small, the silk-screen printing carbon electrode has the advantages of simple design, low price, one-time use, small sample dosage, miniaturization and the like, the electrochemical detection method is simple, convenient and quick, has better repeatability, stability and accuracy, can realize the quick quantitative detection of indoxyl sulfate in blood plasma, is beneficial to understanding the metabolic condition of indoxyl sulfate in gestational diabetes, and provides laboratory basis for the occurrence mechanism, diagnosis, treatment and prognosis of the disease and complications thereof.)
技术领域
本发明属于电化学检测领域，主要涉及一种快速检测血浆硫酸吲哚酚的电化学方法。
背景技术
妊娠期糖尿病(GDM)是最常见的妊娠并发症，指妊娠期间首次发现或发生的糖尿病或糖耐量异常，GDM严重影响母亲和胎儿健康。GDM妇女易发生多种并发症，包括妊娠期高血压、心血管疾病和先兆子痫等，且其后代发生并发症的风险增加，包括巨大儿、早产、肩难产、新生儿低血糖和新生儿入院等。此外，GDM复发率高达48％，有20％～50％的GDM女性在10年内被诊断为2型糖尿病。然而，GDM的发病机制尚未明确，GDM不仅会导致严重的产科和围产期并发症，而且会在未来留下长期的健康风险，给医疗保健系统带来巨大的经济负担。
肠道菌群及其代谢物与代谢性疾病有着重要联系。研究发现，肠道菌群可能在GDM的发病机制中起着重要作用。硫酸吲哚酚是色氨酸的代谢产物。在肠道菌群作用下，色氨酸经色氨酸酶转化为吲哚，吲哚在肝脏中代谢为硫酸吲哚酚，最后经肾脏排出体外。硫酸吲哚酚具有肾脏和心血管毒性，对机体的生理功能有着较大影响。动物研究发现，长期暴露于硫酸吲哚酚的慢性肾病大鼠，主动脉中GLUT1表达降低，胰岛素受体和PPARα/γ功能受损，胰岛素抵抗增强，血糖浓度明显升高。
目前，常用的硫酸吲哚酚检测方法是高效液相色谱-荧光检测法，高效液相色谱-质谱法等。因这些方法所需仪器设备大型，且对操作人员要求高，故难以实现POCT。因此，亟需建立一种快速、简便的硫酸吲哚酚检测新方法。
电化学分析法是根据待测物在溶液中的电化学性质，通过电流、电位和电阻等参数与待测物浓度之间的关系，对待测物实现定性和定量分析。免修饰丝网印刷碳电极(SPCE)具有制作简单、可批量生产、易于实现微型化检测等特点，在电化学分析技术中应用广泛。目前，国内外虽然已有电化学方法检测血浆硫酸吲哚酚的报道，但还没有关于采用SPCE为电极材料和示差脉冲伏安法(DPV)为检测方法进行血浆硫酸吲哚酚定量测定的电化学方法的研究报道。
发明内容
本发明致力于提供一种快速检测血浆硫酸吲哚酚的电化学方法。本发明的电化学方法采用SPCE为电极材料，结合DPV技术能有效降低背景电流的优点，实现血浆中硫酸吲哚酚的快速定量检测。
本发明所述的电化学方法检测原理为：在酸性条件下，硫酸吲哚酚水解生成吲哚酚，吲哚酚吡咯环上的烯醇式结构变为酮式结构，在一定电位下，吲哚酮发生二聚或偶合反应，被氧化为靛蓝和靛玉红。利用电化学工作站对血浆硫酸吲哚酚产生的电化学响应信号进行检测，根据其氧化峰电流与血浆硫酸吲哚酚浓度在一定范围内呈线性关系，从而实现血浆硫酸吲哚酚的定量分析。
本发明所述的SPCE包括一印制电极的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)基片、PET基片上的外部绝缘膜和基片上的导线接口。其特征在于所述的基片上还印制有三个电极，分别为碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳对电极。三个电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下印制的导线与接口相连。所述SPCE用1.0％BSA溶液浸泡1h，用超纯水冲洗干净，于室温下晾干备用。
1.本发明的技术方案包括如下具体步骤：
1)分别取300μL血浆和900μL乙腈加入2mLEp管中，涡旋1min后，静置10min，然后，在4℃下以13300g离心10min，取上清液；
2)将步骤1)得到的上清液置于45℃下氮气吹干；
3)将步骤2)所得样品用300μL 0.10mol/LpH 2.0的PBS溶液复溶，涡旋90s以保证充分溶解，得到反应混合液；
4)取步骤3)得到的反应混合液50μL滴加到SPCE工作区域，所述SPCE与电化学工作站相连。采用DPV进行电化学检测，其参数设置为：低电位0.1V，高电位1.0V，脉冲幅度150mV，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.6s。
作为优选，所述PBS溶液由0.10mol/L磷酸二氢钠与磷酸氢二钠溶液配制。
2.本发明所述快速检测血浆硫酸吲哚酚的电化学方法有益效果如下：
1)本发明所述的电化学检测方法，通过使用免修饰SPCE连接电化学工作站对血浆硫酸吲哚酚进行定量测定，操作简单、快速。
2)本发明所述的电化学检测方法中所用的丝网印刷电极，制作成本低廉，制作过程简单、快速，可实现批量生产。SPCE为一次性使用电极，既能避免传统柱电极打磨抛光的时间精力损耗，又能有效避免柱电极重复使用过程中可能造成的实验交叉污染问题。
3)本发明所述电化学检测方法采用DPV技术，既能有效降低背景电流，又无需对电极进行修饰，检测结果具有较好的重复性和稳定性，可对血浆硫酸吲哚酚进行快速、准确定量。
4)本发明所述电化学检测方法能实现血浆中硫酸吲哚酚的含量测定，有助于了解GDM中硫酸吲哚酚的代谢情况，为GDM及其并发症的发生机制、诊断、治疗及预后提供实验室依据。
附图说明
图1为本发明所述方法的检测原理示意图。
图2为本发明检测硫酸吲哚酚的CV曲线和DPV曲线。
图A中实线a和点划线b分别为PBS缓冲溶液和含40.0μmol/L硫酸吲哚酚的PBS溶液的CV曲线；图B中实线a和虚线b分别为PBS缓冲溶液和含40.0μmol/L硫酸吲哚酚的PBS溶液的DPV曲线。
图3为本发明氧化峰电流与PBS缓冲溶液pH值关系的曲线图。
图中■代表硫酸吲哚酚的氧化峰电流；图中虚线a为PBS溶液的pH值影响硫酸吲哚酚氧化峰Ⅱ峰电流的曲线图；图中实线b为PBS溶液的pH值影响硫酸吲哚酚氧化峰Ⅰ峰电流的曲线图。
图4为本发明氧化峰电流与PBS缓冲溶液浓度关系的曲线图。
图中■代表硫酸吲哚酚的氧化峰电流。
图5为本发明氧化峰电流与沉淀剂种类和沉淀剂比例关系的曲线图。
图B中■代表硫酸吲哚酚的氧化峰电流。
图6为本发明有效氧化峰电流对血浆硫酸吲哚酚浓度的标准曲线图。
图中■代表硫酸吲哚酚的有效氧化峰电流；c代表血浆硫酸吲哚酚浓度。
图7为本发明所述方法检测对照组和GDM组血浆硫酸吲哚酚的浓度分布柱状图。
图8为本发明所述方法检测血浆硫酸吲哚酚用于诊断GDM的ROC曲线。
具体实施方式
本发明电化学工作站仅以CHI852C电化学工作站为例，其购于上海辰华仪器有限公司。
实施例1：本发明所述丝网印刷碳电极的制备
本发明所述丝网印刷碳电极是在PET基板上依次印刷碳浆、Ag/AgCl浆和绝缘浆。具体包括如下步骤：
1)清洗PET基板，晾干后在PET基板上印刷碳浆，制作碳工作电极和碳糊辅助电极，常温干燥；
2)在上述PET基板上印刷含有氯化银的银浆，制成Ag/AgCl参比电极，常温干燥；
3)避开圆形工作区域，在上述PET基板上印刷绝缘浆，将导线覆盖住；
4)上述工作电极、辅助电极和参比电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下的导线与接口相连，然后于30℃～40℃烘干，保存备用。
5)电极使用前需用1.0％BSA溶液浸泡1h，用超纯水冲洗干净，室温下晾干备用。
实施例2：本实施例所述一种快速检测血浆硫酸吲哚酚的电化学方法，具体包括如下步骤：
1)分别取300μL血浆和900μL乙腈加入2mLEp管中，涡旋1min后，静置10min，然后在4℃下以13300g离心10min，取上清液；
2)将步骤1)得到的上清液置于45℃下氮气吹干；
3)将步骤2)所得样品用300μL0.10mol/LpH2.0的PBS溶液复溶，涡旋90s，得到反应混合液；
4)取步骤3)得到的反应混合液50μL滴加到SPCE上，所述SPCE与电化学工作站相连，采用DPV技术进行电化学检测。其参数设置为：低电位0.1V，高电位1.0V，脉冲幅度150mV，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.6s。
作为优选，所述PBS溶液由0.10mol/L磷酸二氢钠与磷酸氢二钠溶液配制。
实施例3：
本实施例是考察硫酸吲哚酚的电化学行为。采用CV对硫酸吲哚酚在SPCE上的电化学行为进行表征，检测溶液为0.10mol/LpH 2.0的PBS溶液，扫速为50mV/s，结果如图2A所示。40.0μmol/L硫酸吲哚酚分别在0.485V和0.862V处出现两个不可逆的氧化峰Ⅰ和氧化峰Ⅱ，无还原峰(点划线b)。由于氧化峰Ⅰ的峰电位低于氧化峰Ⅱ的峰电位，低氧化电位有利于避免检测过程中噪音的干扰，并且氧化峰Ⅰ的峰电流高于氧化峰Ⅱ的峰电流。综合考虑，采用氧化峰Ⅰ的峰电流值对硫酸吲哚酚进行定量分析。进一步采用DPV对硫酸吲哚酚的电化学行为进行表征，检测溶液为0.10mol/LpH 2.0的PBS溶液，结果如图2B所示。40.0μmol/L硫酸吲哚酚在SPCE上发生电化学氧化，产生两个明显的氧化峰Ⅰ和氧化峰Ⅱ(虚线b)，其结果与CV表征结果一致，说明硫酸吲哚酚在SPCE上是分步氧化的。由于DPV对硫酸吲哚酚检测的灵敏度优势，故采用DPV法对硫酸吲哚酚进行定量分析。
实施例4：
本实施例是考察检测溶液的pH值对硫酸吲哚酚电化学行为的影响，结果如图3所示。pH值1.0的检测溶液由0.10mol/LHCl溶液配制，pH 2.0～7.0的PBS溶液由不同比例NaH2PO4和Na2HPO4溶液配制。结果显示，硫酸吲哚酚氧化峰Ⅱ(虚线a)受pH值的影响较大，当pH值为2.0时，氧化峰Ⅰ(实线b)和氧化峰Ⅱ的峰电流均达最高。因此，选择PBS溶液的pH值为2.0。
实施例5：
本实施例考察检测缓冲溶液的浓度对硫酸吲哚酚峰电流的影响，结果如图4所示。当PBS溶液的浓度为0.05～0.10mol/L时，硫酸吲哚酚的峰电流随PBS浓度的增加而逐渐增大，当PBS浓度大于0.10mol/L时，其峰电流逐渐减小。因此，检测缓冲溶液浓度选择为0.10mol/L。
实施例6：
本实施例考察沉淀剂种类对硫酸吲哚酚峰电流的影响，结果如图5A所示。本研究采用蛋白质沉淀法作为血浆样本预处理方法，以减少基质效应的干扰。在相同条件下，选用甲醇、丙酮与乙腈作为沉淀剂进行蛋白质沉淀。当采用乙腈对血浆样本进行蛋白质沉淀时，所得的硫酸吲哚酚峰电流最大。因此，选择乙腈作为血浆样本预处理的最佳沉淀剂。进一步考察了血浆样本与沉淀剂的体积比例对峰电流的影响，结果如图5B所示。当V血浆∶V乙腈为1∶3时，其峰电流达最大，若继续增大乙腈比例，峰电流反而减小。综上，选择乙腈作为沉淀剂，并采用血浆与乙腈的体积比为1∶3进行样本预处理。
实施例7：
本实施例考察所述电化学方法的有效氧化峰电流(氧化峰电流用■表示)与血浆硫酸吲哚酚浓度间的相关性，结果见图6。向270μL血浆基质中加入30μL浓度为10.0～1600.0μmol/L的硫酸吲哚酚标准溶液，配制成系列浓度的工作液。将加标血浆样本进行蛋白质沉淀，氮吹干燥后，复溶于300μL 0.10mol/LpH 2.0的PBS溶液中备用，在最优实验条件下进行检测。在1.0～160.0μmol/L浓度范围内，硫酸吲哚酚的峰电流与其浓度呈良好的线性关系，回归方程为：y＝0.0369x+0.3460，R2＝0.9942(x表示血浆硫酸吲哚酚的浓度，y表示加标与未加标血浆硫酸吲哚酚的峰电流之差，即有效峰电流)，LOD为0.2μmol/L(S/N＝3)。
实施例8：
本实施例是考察本发明所述电化学方法用于测定血浆硫酸吲哚酚的精密度。向血浆基质中加入低、中、高浓度的硫酸吲哚酚标准溶液，配制成终浓度分别为5.0μmol/L，20.0μmol/L和120.0μmol/L的工作液。经过样品预处理后，在最优条件下测定血浆中硫酸吲哚酚的浓度。对各浓度工作液分别进行日内重复测定5次，日间连续测定5天，分别计算各浓度的日内和日间相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)，以考察该方法的日内、日间精密度，结果如表1所示。日内标准偏差低于5.1％，日间标准偏差低于6.9％，表明本发明所述电化学检测方法具有较好的重复性。
表1.精密度
实施例9：
本实施例是考察本发明所述电化学方法用于测定血浆硫酸吲哚酚的回收率，向血浆基质中加入硫酸吲哚酚标准品溶液配制成低浓度5.0μmol/L、中浓度20.0μmol/L、高浓度120.0μmol/L硫酸吲哚酚的工作液，各浓度平行测定5次，进行回收率实验。相对回收率＝(加标后测得血浆中硫酸吲哚酚浓度-加标前测得血浆中硫酸吲哚酚浓度)/加入的硫酸吲哚酚标准品浓度×100.0％，结果见表2。血浆中硫酸吲哚酚的平均回收率在96.1％～106.9％之间，相对标准偏差均≤7.1％，表明本发明所述电化学方法具有较好的准确性。
表2.回收率
实施例10：
本实施例是考察本发明所述电化学方法用于测定血浆中硫酸吲哚酚的抗干扰能力。根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)制定的指南(EP7-A2)进行干扰实验，即测定未加干扰物质的血浆基质中硫酸吲哚酚浓度(XC)和加入干扰物质后的硫酸吲哚酚浓度(XT)。干扰值用(XT-XC)表示，若干扰值低于1.96S(即95％可信度)，则为无显著干扰，用N表示；若干扰值超过1.96S，则为有显著干扰，用I表示。
胆红素和血红蛋白是血浆中常见的内源性干扰物质。此外，吲哚丙酸与硫酸吲哚酚的结构相似。因此，本研究考察了胆红素、血红蛋白和吲哚丙酸对硫酸吲哚酚检测结果的干扰。在含有20.0μmol/L硫酸吲哚酚的血浆样本中加入不同浓度的干扰物，测定加入干扰物前后血浆样本中硫酸吲哚酚浓度，结果如表3和表4所示。胆红素浓度低于30.79μmol/L，血红蛋白浓度低于2.06g/L或吲哚丙酸浓度低于52.85μmol/L对血浆中硫酸吲哚酚的检测不会造成干扰。正常情况下，人体血液中胆红素浓度低于17.10μmol/L，胆红素的干扰浓度显著大于正常值，即正常体内浓度的胆红素对检测结果不造成干扰。正常血浆仅含微量的血红蛋白，其浓度小于10.0mg/L，血红蛋白的干扰浓度2.06g/L显著大于正常值。但当发生溶血时，红细胞会释放血红蛋白进入血浆中。因此，在样本采集时应避免重度溶血。吲哚丙酸在人体内含量低于0.4μmol/L，由表4可知，其干扰浓度显著高于血浆中的实际浓度。因此，本发明所述电化学方法具有良好的抗干扰能力。
表3胆红素和血红蛋白对血浆硫酸吲哚酚检测的干扰
表4吲哚丙酸对血浆硫酸吲哚酚检测的干扰
实施例11：
本实施例是考察所述电化学方法用于检测对照组和GDM组孕妇血浆中硫酸吲哚酚。采用已建立的电化学方法对GDM组和对照组孕妇血浆中硫酸吲哚酚的浓度进行检测，结果如表5所示。GDM组孕妇血浆中硫酸吲哚酚的平均浓度为13.70μmol/L，显著高于对照组孕妇血浆中硫酸吲哚酚的平均浓度，差异具有统计学意义(p<0.05)。对照组和GDM组孕妇血浆中硫酸吲哚酚浓度的分布如图7所示，表明GDM孕妇体内存在硫酸吲哚酚代谢紊乱。综上，本发明所述电化学方法能用于临床血浆样本中硫酸吲哚酚的检测。
表5 GDM组和对照组血浆硫酸吲哚酚浓度
实施例12：
本实施例是考察血浆硫酸吲哚酚对GDM的诊断效能。ROC曲线分析是一种全面、准确的诊断试验评价工具，能客观地揭示诊断方法对疾病的诊断能力。本发明采用ROC曲线分析硫酸吲哚酚对GDM的诊断效能，寻找最优的诊断阈值。结果显示，AUC为0.873，Cut-off值为10.61μmol/L，灵敏度为70.0％，特异度为100.0％，如图8所示，表明本发明中硫酸吲哚酚对GDM具有较好的诊断效能。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法