一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法
阅读说明：本技术 一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法 (P-tau detection immunosensor and preparation and application methods thereof ) 是由 陈红霞 于 2021-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种P-tau检测免疫传感器的制备方法,包括步骤：(1)合成花状TiO-(2)；(2)将电极与杯芳烃衍生物溶液进行反应,使得杯芳烃衍生物附着在电极上；(3)将Anti-tau抗体添加到附着有杯芳烃衍生物的电极表面上；(4)将电极与超分子化合物溶液进行反应,为抗体提供固定基底。(The invention discloses a preparation method of a P-tau detection immunosensor, which comprises the following steps: (1) synthetic flower-like TiO 2 (ii) a (2) Reacting the electrode with the calixarene derivative solution to attach the calixarene derivative to the electrode; (3) adding Anti-tau antibody to the surface of the electrode to which the calixarene derivative is attached; (4) the electrodes are reacted with the solution of supramolecular compounds to provide a substrate for immobilization of the antibodies.)
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及一种P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是痴呆症的主要原因，也是世界上最大的医疗保健挑战之一，并造成严重的家庭和社会负担。鉴于目前尚无治疗AD的特效药，早期诊断、早期干预将为延缓AD进展、提高患者生活质量、减轻社会负担奠定基础。针对脑脊液(CSF) 中生物标志物的正电子发射断层扫描(PET)的使用彻底改变了AD的诊断工作。核心CSF生物标志物包括Aβ42、总tau(T-tau)和磷酸化tau(P-tau)。Aβ42减少和P-tau增加被认为反映了AD中的Aβ和tau病理。重要的是，脑脊液磷酸化tau蛋白对AD的特异性高于总tau蛋白和Aβ42。CSF分析和神经影像学可以在某些神经退行性疾病的最早阶段确定潜在的病理生理学，但不具备人群筛查所需的可扩展性。因此，基于血液的生物标志物对于AD的诊断和预后变得越来越重要。从未来的临床实践来看，低成本的血液常规检查有望取代昂贵的PET扫描。
最近的报告表明，血浆p-tau181可将AD痴呆与淀粉样蛋白β阴性的年轻人和认知功能未受损的老年人以及其他神经退行性疾病区分开来。其他位点的P-tau，如P-tau199、 P-tau217和P-tau231，对AD的诊断准确度相似。因此，血浆总P-tau是更可靠的AD血浆生物标志物。对于P-tau的临床检测对AD的早期诊断、诊疗方案的确定、治疗剂量的优化以及药物疗效的评价具有重要意义。
目前，P-tau开发的检测方法主要为ELISA试剂盒，但是现有方法依旧不能将P-tau低表达的患者与无患病人群有效区分，也不能预测大部分患者的临床结果，灵敏度还有待提高。重复性较差、易受非特异性蛋白的干扰出现假阳性、检测过程中干扰因素过多等缺点也制约了ELISA在血清P-tau检测中的应用。并且，磷酸化蛋白质的免疫分析仍然存在磷酸化蛋白质(P-蛋白质)丰度低和大量非P-蛋白质的信号抑制问题。因此，有必要在免疫分析之前富集P蛋白。目前常用超速离心等手段，然而，由于操作过程中的不确定因素过多，对实验结果可能造成较大影响。使检测所用到的样本的可靠性和可用性不能完全保证。对于P蛋白富集，已经开发了一些策略，例如基于适体或基于抗体的功能化磁珠。虽然基于功能磁珠的策略在P蛋白富集中应用最为广泛，但该方法存在磷酸化抗体修饰过程繁琐、加载效率低、抗体活性易破坏等缺陷。此外，为磷酸化而开发的抗体或适体通常可以特异性识别一个位点。相应的抗体作为富集和捕获的识别分子将无法实现全磷酸化识别。P-tau的多个位点，如P-tau199、P-tau217和 P-tau231，对AD的诊断准确性相似。单一的特异性识别分子会导致目标蛋白的漏检，降低AD分析的准确性。因此，开发一种快速、灵敏、准确的P-tau检测方法成为研究人员迫切需要解决的问题。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、准确的P-tau检测免疫传感器及其制备和应用方法。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种P-tau检测免疫传感器的制备方法，包括步骤：
(1)合成花状TiO2；
(2)将芯片电极放入杯芳烃衍生物溶液中，使得杯芳烃衍生物附着在芯片电极上；
(3)将Anti-tau抗体添加到附着有杯芳烃衍生物的电极表面上；
(4)将芯片电极放入超分子化合物溶液中，为抗体提供固定基底。
进一步地，在步骤(1)中包括步骤：
(11)将钛酸四丁酯加入盐酸和去离子水的混合物中，搅拌1h；
(12)将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，在160℃反应3小时；反应结束后，离心得到的沉淀用去离子水反复洗涤以除去未反应的试剂；
(13)最后，将沉淀物在80℃下干燥12h得到花状TiO2，并在4℃下储存备用。
进一步地，步骤(2)中的杯芳烃衍生物溶液为0.1mM的Prolinker溶液，将电极置于Prolinker溶液中反应8-12h，反应结束后将电极置于甲醇溶液中洗涤1h，洗涤之后用超纯水清洗并用氮气吹干电极表面的水分。
进一步地，步骤(3)中，将浓度为1μg/mL的Anti-tau抗体添加到附着有Prolinker的电极表面上，孵育2小时后，用缓冲液洗涤金片表面以洗脱未连接的抗体。
进一步地，步骤(4)中，将芯片与浓度为0.01mg/mL的BSA溶液反应半小时。
本发明还提供了一种P-tau检测免疫传感器，其使用花状TiO2作为Anti-tau抗体的富集材料，使用超分子化合物为抗体固定基底。
进一步地，其中，花状TiO2是采用如下步骤制备的：
(1)将钛酸四丁酯加入盐酸和去离子水的混合物中，搅拌1h；
(2)将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，在160℃反应3小时；反应结束后，离心得到的沉淀用去离子水反复洗涤以除去未反应的试剂；
(3)最后，将沉淀物在80℃下干燥12h得到花状TiO2，并在4℃下储存备用。
进一步地，其中，超分子化合物为BSA。
本发明还提供了一种如上述的P-tau检测免疫传感器的应用方法，包括步骤：在靶标溶液中加入花状TiO2溶液，随后通过离心添加至电极表面，并通过电化学阻抗检测P-tau引起电化学信号变化。
本发明的有益效果有：
1、超分子化合物的主客体识别为固定抗体提供丰富的结合位点，并确保抗体活性；
2、花状TiO2实现一步法分离富集靶标分析物，且分离效率高，特异性强，并可作为检测的信号放大分子；
3、花状TiO2-靶标复合物对电化学阻抗信号有显著增强作用；
4、这种传感模式为开发更直接有效的生物传感器提供了实际的临床应用价值。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的P-tau检测原理示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例中的合成的花状TiO2材料的表征图；
图3是本发明的一个较佳实施例中的不同浓度的P-tau引起的EIS图；
图4是本发明的一个较佳实施例中的电阻响应与P-tau浓度对数之间的线性关系图；
图5是本发明的一个较佳实施例中的一种P-tau检测免疫传感器的示意图；
图6是本发明的一个较佳实施例中的一种P-tau检测免疫传感器的使用示意图；
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
电化学阻抗谱(EIS)是目前最有效的分析方法之一，因为它可以表征不同改性层中的物理和化学过程，高频下的样品电荷转移和低频下的跟踪传质。在测量免疫相互作用方面，EIS比其他电化学方法的损失更小，因为它是在很窄的施加电位范围内进行的。因此，EIS在生物传感器设计领域引起了广泛关注。磷酸化蛋白质的EIS分析仍然存在磷酸化蛋白质(P-蛋白质)丰度低和大量非P-蛋白质的信号抑制问题。因此，有必要在EIS分析之前富集P蛋白。虽然基于功能磁珠的策略在P蛋白富集中应用最为广泛，但该方法存在磷酸化抗体修饰过程繁琐、加载效率低、抗体活性易破坏等缺陷。此外，为磷酸化而开发的抗体或适体通常可以特异性识别一个位点。相应的抗体作为富集和捕获的识别分子将无法实现全磷酸化识别。P-tau的多个位点，如P-tau199、 P-tau217和P-tau231，对AD的诊断准确性相似。因此，单一的特异性识别分子会导致目标蛋白的漏检，降低AD分析的准确性。
TiO2可以与P蛋白的磷酸基团形成配位键并稳定结合，不受抗体活性变化的干扰，实现高选择性富集。花状TiO2(F-TiO2)超结构，即具有分级结构的3D微纳米材料，具有较大的比表面积、优异的生物相容性和强大的电子转移能力。F-TiO2的大比表面积有助于P蛋白更灵敏地与其表面结合。良好的生物相容性将保持结合蛋白的天然活性不变。此外，较大的电子转移阻碍能力使得F-TiO2作为富集材料可以获得更好的信号放大效果，显著提高检测的灵敏度。
基于上述的机制，本发明设计了一种简便且灵敏的免疫传感器，通过电化学信号输出来定量总P-tau的水平。该传感器涉及F-TiO2和P-tau的配位结合作用，以及抗体的特异性识别，如图1所示。通过F-TiO2介导的免疫传感器的成功构建，一步法实现 P-tau富集及靶标信号放大。首先，杯芳烃衍生物用于将Anti-tau定向到金电极表面。超分子化合物通过主客体识别为固定抗体提供丰富的结合位点，并通过非共价相互作用确保Anti-tau活性。F-TiO2将作为信号放大标签，其独特的花形结构和高电子阻碍能力导致电荷转移电阻(Rct)的净变化。此外，夹心法中的F-TiO2不仅提供亲水性，可以减少非特异性结合，而且大的比表面积保证了P-tau结合的高灵敏度。这允许设计的电化学生物传感器在靶标检测期间输出放大的阻抗信号。Anti-tau和F-TiO2实现了P-tau的双重特异性识别，保证了总P-tau检测的高选择性。通过该模式，使得抗原被更多的捕获于界面，信号输出进一步增强，使得检测灵敏度更一步增加。
在根据本发明的一个优选实施例中，花状TiO2特异性检测P-tau的电化学测定方法和步骤如下：
(一)合成花状TiO2：
(1)将钛酸四丁酯(TBOT)加入37％盐酸和去离子水的混合物中，搅拌均匀，继续搅1h；
(2)然后将上述混合物转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，在160℃反应3小时。反应结束后，离心得到的沉淀用去离子水反复洗涤以除去未反应的试剂。
(3)最后，将沉淀物在80℃下干燥12h得到F-TiO2，并在4℃下储存以备后续使用。
分别通过紫外可见光谱(Uv-vis)，动态光散射(DLS)，Zeta电位和扫描电子显微镜(SEM)表征所得到的F-TiO2，并通过DLS分析了材料稳定性。材料的表征参见附图2。
(二)电化学方法测定P-tau：
(1)首先，配置0.1mM的Prolinker溶液，将电极置于Prolinker溶液中反应8-12h。Prolinker是一种可在市场上购买的杯芳烃衍生物，可以通过金-巯键与芯片表面结合反应，其杯芳烃空腔可以用来将抗体锚定到芯片表面。反应结束后将电极置于甲醇溶液中洗涤一小时，洗涤之后用超纯水清洗并用氮气吹干电极表面的水分。
(2)之后，将附着有Prolinker的电极安装到电化学工作站仪器上。而后，将100μL的浓度为1μg/mL的Anti-tau抗体添加到附着有Prolinker的电极表面上。孵育2小时后，用缓冲液洗涤金片表面以洗脱未连接的抗体。
(3)为了避免芯片表面上的非特异性吸附，将芯片与浓度为0.01mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)溶液反应半小时。
(4)然后，在100μL的靶标溶液中加入F-TiO2溶液，由于TiO2与P-tau的配位结合能力，二者形成了相应的复合物，随后通过离心添加至电极表面。并通过电化学阻抗检测不同浓度P-tau引起电化学信号变化。
按照上述步骤对不同浓度的P-tau进行测试。
测试采用P-tau浓度分别为：1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml。
测试条件：使用电化学工作站(AutolabPGSTAT128Nsystem)，以10min作为孵育时间，在室温条件下进行不同浓度P-tau作用下的电化学阻抗测定。
参见附图3和4。图3为不同浓度的P-tau引起的EIS图。图4为电阻响应与P-tau 浓度对数之间的线性关系。
由图3和4可见：随着P-tau浓度的增大，导致的电化学信号也越大。因此可以对其进行灵敏的定量分析。
参见附图，图2为材料的表征，具体为：(A)和插图显示合成F-TiO2的SEM图像。 (B)F-TiO2的紫外-可见光谱。(C)F-TiO2的DLS和Zeta电位。(D)F-TiO2在不同时间条件下的稳定性(n＝3)。由图可知，F-TiO2的整体形状为均匀分散的花状球形结构。粒径为350±50nm，分散性好，形状清晰。UV-vis吸收光谱中325nm左右的峰被认为是 F-TiO2的特征吸收峰。F-TiO2的均等效流体动力学直径为401±15.4nm。zeta电位为 23.2±0.51mV。上述的结果证明F-TiO2的成功合成；F-TiO2在4℃下放置20天后，粒径变化仅为7.59％，表明合成的纳米颗粒具有良好的稳定性。证明F-TiO2的稳定性较好，可用于后续试验。
图3和4为不同P-tau浓度与阻抗变化间的线性相关关系。由图可见：随着P-tau 浓度的增大，造成的阻抗变化也越大，并且P-tau浓度与阻抗变化间呈现出较好的线性相关关系。线性方程为：y＝93.153+333.51×lgCP-tau，线性相关系数为0.98，检测限为25.1pg/mL，符合检测要求。
如图5和6所示，本发明还提供了一种P-tau检测免疫传感器，包括设置在PI基底1上的一对金电极2，金电极2导通至检测池4。金电极2预先经过Prolinker溶液和Anti-tau抗体附着及BSA溶液反应处理，然后再检测池4内滴入F-TiO2溶液，在 120℃干燥10min后在检测池4中得到花状TiO2沉积膜3后保存备用。检测时，通过在检测池4中滴入靶标溶液7，使得TiO2与P-tau结合，然后对传感器进行上述电化学检测。
本发明利用花状TiO2高特异性的配位结合P-tau，与Anti-tau的联合使用具有双重选择性，并且通过F-TiO2-P-tau复合物对阻抗值进行信号放大。该方法不仅就有高的特异性和选择性，而且具有高的灵敏度，能检测极微量的P-tau。另外，该方法双选择性的结合P-tau，改善了单一的抗原抗体特异性识别所出现的假阳性问题，检测结果高效可信。我们构建的高特异性和双重选择的简便的电化学免疫传感器为血液中的总P-tau的检测提供了一种更方便快捷和准确的方法。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。