具体实施方式

下面结合具体来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明。本发明试剂如无特别说明，均为常规试剂。如无特殊说明，物质百分比均为重量体积比。

实施例一

本发明腈菌唑胶体金快速检测试剂盒，包括试剂盒盒体，其中试剂盒盒体内有一次性吸管、样本提取液、检测试纸卡。其中检测试纸卡，如图1所示，包括PVC底板6，吸收垫1、反应膜3、吸水垫2；为了避免取放试纸卡进行检测过程中污染试纸卡，试纸卡还设置了塑料外盒，塑料外盒上对应吸收垫的上方设置有加样孔，塑料外盒上对应检测线和质控线的上方设置有观察窗口。所述反应膜上还包被有腈菌唑半抗原-HSA偶联物构成的检测线4和包被有抗抗体构成的质控线5；所述吸收垫上包被有腈菌唑特异性抗体-胶体金标记物，其中胶体金颗粒粒径优选30 nm。

主要材料制备：

一、检测线包被物腈菌唑半抗原-HSA偶联物的制备

腈菌唑半抗原制备：称取0.86 g腈菌唑于100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL丙酸溶解，加入琥珀酸酐0.5 g，无水三氯化铝0.5 g，80℃回流反应10 h，反应结束，冷却至室温。用丙酮洗涤2次，100℃将反应液蒸干，得油状物。上硅胶柱，乙酸乙酯：石油醚=2：1，(v/v，2/1)洗脱分离纯化，得到腈菌唑半抗原溶液，100℃蒸干，得固体腈菌唑半抗原。

腈菌唑半抗原-HSA偶联物制备：（1）称取腈菌唑半抗原60 mg，溶于1 mLDMF；（2）称取NHS、EDC各80 mg溶于1 mL去离子水中；（3）将步骤（2）混合液缓慢加入到步骤（1）中，室温搅拌1 h；（4）称取HSA100 mg溶解于4 mL去离子水；（5）搅拌下将步骤（3）的反应液等量加入到步骤（4），反应30 min后，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH 8-9，室温搅拌24 h；（6）用0.02mol/L，pH7.2 PBS缓冲液透析，每天早晚更换，透析3天。反应

合成路线如下所示：

二、腈菌唑单克隆抗体-胶体金标记物的制备

1.制备腈菌唑半抗原-KLH偶联物作为免疫原，其制备方法同腈菌唑半抗原-HSA偶联物合成步骤，不同之处在于载体蛋白为血蓝蛋白。

2．腈菌唑单克隆抗体的制备：

2.1动物免疫

将得到的腈菌唑半抗原-KLH偶联物作为免疫原注入到Balb/c小鼠体内，第一次加弗氏完全佐剂，免疫剂量为50 µg/只；15天后第二次免疫，加弗氏不完全佐剂，免疫剂量为50 µg/只，15天后第三次免疫，免疫剂量为50 µg/只；3周后加强免疫，免疫剂量为200 µg/只，使其产生抗血清。

2.2 细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按10：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株－腈菌唑的单克隆杂交瘤细胞株。

2.3细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。冻存液为30%小牛血清，60%1640培养液，10%DMSO。

2.4单克隆抗体的制备与纯化

将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5 mL/只，7天后腹腔注射腈菌唑的单克隆杂交瘤细胞株，1×10⁶个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境保存。使用前经过0.01 mol/L的NaCl 于4℃环境下透析48 h，中间每隔6 h换液一次。

3.腈菌唑单克隆抗体-胶体金标记物制备

本实施例采用30 nm胶体金，30 nm胶体金的制备方法：取0.01%氯金酸100 mL，加热煮沸后，加入1%柠檬酸三钠1.6 mL，煮沸10 min，出现透明的橙红色，自然冷却，得到。本实施例30 nm胶体金粒径与腈菌唑单克隆抗体的结合能力强，有效提高腈菌唑胶体金检测试剂盒对腈菌唑药物检测的敏感度，大大提高检测灵敏度。

腈菌唑单克隆抗体-胶体金标记物：取100 mL上述胶体金溶液，在磁力搅拌下，加入1%碳酸钾调节胶体金的pH 值至7.2，按照每mL胶体金溶液中加入10-20 μL标准加入腈菌唑单克隆抗体，搅拌10 min，放置5 min后加入5%BSA，至BSA 体积浓度为1%后，静置 20min；10000rpm、4℃离心15 min，弃上清液，沉淀物用含1%BSA、0.002%叠氮化钠的PBS缓冲液，重悬为原体积的1/10，置4℃备用。

本实施例选用腈菌唑单克隆抗体，腈菌唑多克隆抗体也适用。

三、抗抗体制备

本实施例羊抗鼠抗抗体由鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫制备得到，用于包被质控线。当特异性抗体选用腈菌唑多克隆抗体时，质控线可以包被羊抗兔抗抗体，其由兔源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫制备得到。

四、本发明反应膜可为醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜，优选硝酸纤维素膜，在包被检测线和质控线之前用pH7.2，5%蔗糖，0.01mol/LPBS浸泡30 min，37℃烘干2 h。检测线腈菌唑半抗原-HSA包被浓度为10 mg/mL，羊抗鼠抗抗体包被浓度为1 mg/mL。反应膜制备好后，置于含1%牛血清白蛋白、1%NaCl、pH值为7.0、0.01mol/L PBS缓冲液中封闭30 min后，37℃干燥2 h备用。硝酸纤维素膜经过处理后可以增加亲水率，降低信号强度，降低假阳性。

吸收垫为玻璃纤维膜，在包被腈菌唑特异性抗体-胶体金标记物之前，用pH7.0，含20%吐温-20的PBS缓冲液浸泡30 min，37℃烘干2 h。按照每5平方厘米结合l mL腈菌唑特异性抗体-胶体金标记物进行包被，后真空干燥备用。

吸水垫为吸水纸。

实施例二

胶体金免疫层析是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种免疫标金技术。本发明腈菌唑胶体金检测试剂盒采用竞争胶体金免疫层析方法，在硝酸纤维素膜质控线上预包被腈菌唑半抗原-HSA偶联物，在层析过程中样本中的腈菌唑和硝酸纤维素膜上预包被的偶联抗原竞争胶体金标记的腈菌唑特异性抗体，通过检测线是否显色判断样本中是否有腈菌唑药物。

1、本发明腈菌唑胶体金试剂盒操作步骤

用一次性吸管吸取待检样本垂直滴加 2～3滴于加样孔中；液体流动时开始计时，反应3～5 min后，判定结果。

2、结果分析，见图2所示

阴性：检测线（T）和质控线（C）都显红色，表示样本中腈菌唑药物浓度低于检测限。

阳性：检测线（T）无显色或较质控线（C）浅，质控线（C）显色，表示样本中腈菌唑药物浓度等于或高于检测限。

无效：未出现质控线（C），表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效。应重新检测。

3、样本前处理

小麦、烟叶样本处理方法：将烟叶用剪刀剪成1 cm，小麦直接取用；称取1.0 g待检样本至50 mL聚苯乙烯离心管中；加入2 mL样本提取液，用振荡器充分混合样本5 min，室温静置2 min；用一次性吸管吸取上清液用于分析。样本提取液为含有70%乙醇，pH6.0，0.05 mol/LMES缓冲液，百分比为体积百分比。

4、检测灵敏度

将腈菌唑标准品稀释成如下不同浓度：0.005 µg/g、0.01 µg/g、0.02 µg/g、0.04 µg/g，取腈菌唑试纸卡进行检测，每个样本重复测定3次。

当测定0.005 µg/g腈菌唑标准溶液时，试纸卡上显示出肉眼可见的两条红色条线，呈阴性；当测定0.01 µg/g、0.02 µg/g、0.04 µg/g腈菌唑标准溶液时，试纸卡质控线显色，检测线不显色，呈阳性。本发明产品对腈菌唑的检测灵敏度为0.01 µg/g。

样本检出限

取空白小麦、烟草样本，在其中分别添加腈菌唑至终浓度为0、0.005、0.01、0.02、0.04μg/g，取本发明腈菌唑胶体金检测试剂盒进行检测，每个样本重复测定5次。

当小麦、烟草中腈菌唑添加浓度为0、0.005 μg/g时，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色线，呈阴性；当其中腈菌唑添加浓度为0.01、0.02、0.04 μg/g时，试纸条质控线显示红色，检测线不显色，呈阳性；表明本发明产品对小麦、烟草中腈菌唑药物的检出限为0.01 μg/g。

5、重复性实验

取0.02 µg/g腈菌唑标准品溶液，用本发明5个不同批次生产的腈菌唑试纸卡进行测定，测定结果见图3。本发明腈菌唑胶体金检测试剂盒检测显色均一，批间差异小，重复性好。

6、特异性试验

特异性是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。本发明腈菌唑检测产品对腈菌唑检测灵敏度为0.01 µg/g。粮食、烟草中常检的烯酰吗啉、多菌灵、吡虫啉、三唑酮药物，当这些药物标准品浓度为50 μg/g时，用本发明检测产品检测结果仍为阴性，可以得到本发明产品未对这些药物发生交叉反应，能够特异性检测腈菌唑药物。

6、阴阳性复核率

取已知添加腈菌唑0.05 μg/g的小麦阳性样本20份和经仪器测定腈菌唑含量为0 μg/g的小麦阴性样本20份，用本发明腈菌唑胶体金检测试剂盒进行检测。检测20份阳性样本时，检出20份阳性，假阴性率为0；检测20份阴性样本时，结果全部为阴性，假阳性率为0。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。