阅读说明：本技术 用于生物样品中游离aim的免疫分析方法及用于检测对象中nash的方法 (Immunoassay method for free AIM in biological sample and method for detecting NASH in subject ) 是由 宫崎彻 冈上武 浅井智英 钟筑由香 广田次郎 于 2020-01-30 设计创作，主要内容包括：本发明要解决的问题是进一步提高与游离AIM特异性反应的抗体对游离AIM的特异性,已及不给患者和医务人员施加负担地诊断NASH。所述问题可以通过用于包含复合体AIM和游离AIM的生物样品中的游离AIM的免疫分析方法解决,该方法包括在抗-IgM抗体存在下使生物样品和与游离AIM特异性反应的抗体接触。(The problem to be solved by the present invention is to further improve the specificity of antibodies specifically reactive with free AIM for free AIM and to diagnose NASH without imposing a burden on patients and medical staff. The problem is solved by an immunoassay method for free AIM in a biological sample comprising complex AIM and free AIM, comprising contacting the biological sample with an antibody specifically reactive with free AIM in the presence of anti-IgM antibodies.)

具体实施方式

(生物样品)

本发明中可分析的生物样品的例子包括来自机体(生物体)的固体组织和体液，并且优选应用体液。本发明中可分析的生物样品更优选为体液样品，诸如血液、血清、血浆、尿、唾液、痰、泪液、耳漏或前列腺液，进一步优选血液、血清、血浆或尿。机体或对象的例子包括人或动物(例如，小鼠、豚鼠、大鼠、猴、狗、猫、仓鼠、马、牛和猪)，并且优选为人。来自对象的生物样品可在本发明实施之时收集或制备、或可预先地收集或制备并保存。制备样品的人和分析样品中游离AIM的量的人可不同。生物样品可以是体内样品。生物样品可以从可能患有NASH的对象或患有NASH的对象收集。在本发明中，生物样品包含游离AIM和复合体AIM二者。

(AIM)

AIM(巨噬细胞的凋亡抑制剂)是由组织巨噬细胞产生的、具有约50kDa分子量的分泌性血液蛋白。AIM具有下列结构，其中，3个富含半胱氨酸的清道夫受体(SRCR)结构域、即包含许多半胱氨酸残基的特异性序列串联连接，并且认为半胱氨酸残基在各结构域中彼此二硫键结合以形成紧凑的球形三维结构。

人AIM由SEQ ID NO:1所表示的347个氨基酸组成并且包含富含半胱氨酸的3个SRCR结构域。SRCR1结构域相应于由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列中的氨基酸编号24至125。SRCR2结构域相应于由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列中的氨基酸编号138至239。SRCR3结构域相应于由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列中的氨基酸编号244至346。

人AIM的氨基酸序列如下。

MALLFSLILAICTRPGFLASPSGVRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCENPESSFSPVPEGVRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECEDPFDLRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICSG(SEQ ID NO:1)

具体地，人AIM中的SRCR1结构域、SRCR2结构域和SRCR3结构域的氨基酸序列如下。

SRCR1结构域：

VRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCE(SEQ ID NO:2)

SRCR2结构域：

VRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECE(SEQ ID NO:3)

SRCR3结构域：

LRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICS(SEQ ID NO:4)

(游离AIM)

在本说明书中，“游离AIM”意味着不结合于其它物质诸如脂多糖或IgM、以游离状态存在的AIM。另一方面，在本说明书中，结合于其它物质诸如脂多糖或IgM并以复合体状态存在的AIM被称为复合体AIM。游离AIM优选地是以游离状态存在的人AIM。游离AIM优选地是人游离AIM，并且复合体AIM优选地是人复合体AIM。

(抗-IgM抗体)

如本文所用的术语“抗-IgM抗体”意味着具有与IgM结合的性质的抗体。换言之，“抗-IgM抗体”意味着通过Ouchterlony方法从其产生人IgM和沉淀线的物质。抗体可具有与其它抗原的结合性质，只要抗体具有与IgM的结合性质且不损害本发明的效果。本发明中使用的抗-IgM抗体优选地是抗-人IgM抗体。尽管多克隆抗体和单克隆抗体二者都可以用作本发明中使用的抗-IgM抗体，从确保与游离AIM特异性反应的抗体的灵敏度的观点而言，优选使用单克隆抗体。抗-IgM抗体可为能够与IgM结合的功能性片段。在本发明的免疫分析方法中，通过应用针对人血清样品的抗-IgM抗体，与不添加抗-IgM抗体的情况相比，由复合体AIM引起的非特异性反应可以减少至50％或更低，优选地40％或更低。

可商购的抗-IgM抗体也可以用作本发明中所应用的抗-IgM抗体。可商购的抗-IgM抗体可以是HBR-1、HBR-3、HBR-6、HBR-9、HBR20、HBR21、HBR23、HBR26(SCANTIBODIES)等。由于有效抑制非特异性反应，优选应用HBR-6和/或HRB-20。

抗-IgM抗体的添加浓度没有特别限定，只要实现足够的非特异性反应抑制效果和免疫分析的主要反应不受影响，并且在单克隆抗体的情况下，期望抗体以1至1000μg/mL的浓度范围应用，更期望10至1000μg/mL，进一步期望10至300μg/mL。在多克隆抗体的情况下，抗体期望以0.01至2wt％的浓度范围应用，期望以0.03至2wt％的浓度范围应用，进一步期望以0.05至1wt％的浓度范围应用。

在本发明中，只要可以获得本发明的效果，抗-IgM抗体对IgM的结合亲和力没有特别限定，并且例如，对IgM的结合亲和力可以是Kd为至少约10^-4M、至少约10^-5M、至少约10^-6M、至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^-9M、至少约10^-10M、至少约10^-11M、至少约10^-12M或更多。

抗-IgM抗体可以根据已知的方法作为单克隆抗体或多克隆抗体制备。例如，通过从用IgM或IgM片段免疫的非人哺乳动物分离为抗体产生细胞的脾细胞或淋巴结细胞，通过使该细胞与具有高增殖能力的骨髓瘤衍生细胞系融合以产生杂交瘤，和纯化该杂交瘤产生的抗体，可以获得单克隆抗体,。多克隆抗体可以从用IgM或IgM片段免疫的动物的血清获得。免疫原的例子包括但不限于灵长动物诸如人和猴、啮齿动物诸如大鼠和小鼠，狗，猫，马，绵羊和猪的IgM或IgM片段。

抗-IgM抗体可以是抗体分子整体以及具有抗原-抗体反应活性的抗体的片段，并可以是通过如上述的动物免疫步骤获得，或通过应用基因重组技术获得的抗体，或可以是嵌合抗体。抗体的片段优选地是功能性片段；其例子包括F(ab')₂、Fab'、scFv等；这些片段可以通过用蛋白分解酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)处理如上述获得的抗体、或通过将抗体的DNA进行克隆并在应用大肠杆菌或酵母的培养系统中表达而产生。

在本说明书中，“非特异性反应”意味着除了游离AIM以外的物质与本发明中使用的抗-AIM抗体结合。在本发明中，通过应用抗-IgM抗体，可以抑制由复合体AIM，或特别地由结合有IgM作为结合配偶的复合体AIM引起的非特异性反应。

(与游离AIM特异性反应的抗体)

在本说明书中，“与游离AIM特异性反应的抗体”意味着在抗-IgM抗体不存在下时仅与游离AIM反应，且实质上不与复合体AIM反应的抗体。在本说明书中，“实质上不与复合体AIM反应”意味着当通过本领域技术人员已知的方法测定抗体的反应性时，当对游离AIM的结合力是100时，对复合体AIM的结合力低于10％。在本说明书中，“抗-AIM抗体”意味着与游离AIM反应的抗体。因此，如本文应用的术语“抗-AIM抗体”包括与游离AIM特异性反应的抗体以及与游离AIM和复合体AIM二者反应的抗体。

本发明的免疫分析方法中使用的与游离AIM特异性反应的抗体可以与人AIM的SRCR2结构域中的表位结合。本发明的免疫分析方法中使用的与游离AIM特异性反应的抗体优选地与人AIM的SRCR2结构域中的表位结合且不与SRCR1结构域结合。本发明的免疫分析方法中使用的与游离AIM特异性反应的抗体更优选地与人AIM的SRCR2结构域中的表位结合，且与SRCR1结构域或SRCR3结构域都不结合。

本发明的免疫分析方法使用至少一种与游离AIM特异性反应的抗体。当进行其中待测定的游离AIM夹在识别不同表位的两种抗体之间的所谓夹心分析时，抗体之一可为与游离AIM特异性反应的抗体，并且另一抗体可为抗-AIM抗体，或优选地，两种抗体都是与游离AIM特异性反应的抗体。当进行其中待测定的游离AIM被夹在识别不同表位的两种抗体之间的所谓夹心分析时，所述两种抗体优选地识别不同的表位。在进行下述ECL法或ELISA法的情况下，与游离AIM特异性反应的抗体优选地用作固定在固相上的固相抗体。

只要可以获得本发明的效果，本发明的免疫分析方法中使用的与游离AIM特异性反应的抗体对游离AIM的结合亲和力没有特别限定，例如，对IgM的结合亲和力可以是Kd为至少约10^-4M、至少约10^-5M、至少约10^-6M、至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^-9M、至少约10^-10M、至少约10^-11M、至少约10^-12M或更多。

抗体与特定化合物诸如复合体AIM是否“实质上不反应”可以通过下列确认：抗原固相ELISA法、竞争ELISA法、夹心ELISA法等，以及应用表面等离子体共振原理的方法(SPR法)等。SPR法可以通过应用可在Biacore(注册商标)名称下商购的装置、传感器和试剂进行。

在本发明的免疫分析方法中，抗-IgM抗体在反应系统中的存在能够降低与游离AIM特异性反应的抗体与复合体AIM之间的反应性。尽管将抗-IgM抗体添加至测定系统的时机没有特别限定，只要可以获得本发明的效果即可，抗-IgM抗体优选地在添加与游离AIM特异性反应的抗体之前或与其同时添加。

与游离AIM特异性反应的抗体可以根据已知的方法作为单克隆抗体或多克隆抗体制备。单克隆抗体可以例如，通过从用游离AIM或游离AIM片段和/或复合体AIM或复合体AIM片段免疫的非人哺乳动物分离为抗体产生细胞的脾细胞或淋巴结细胞，使该细胞与具有高增殖能力的骨髓瘤衍生细胞系融合以产生杂交瘤，和纯化该杂交瘤产生的抗体而获得。多克隆抗体可以从用游离AIM或游离AIM片段和/或复合体AIM或复合体AIM片段免疫的动物的血清获得。免疫原的例子包括但不限于灵长动物诸如人和猴、啮齿动物诸如大鼠和小鼠，狗，猫，马，绵羊和猪的游离AIM或游离AIM片段和/或复合体AIM或复合体AIM片段。

与游离AIM特异性反应的抗体可以是抗体分子整体以及具有抗原-抗体反应活性的抗体的片段。所述抗体可以是通过如上述动物的免疫步骤获得或通过应用基因重组技术获得的抗体、或可以是嵌合抗体。抗体的片段优选地是功能性片段，其例子包括F(ab')₂、Fab'、scFv等。这些片段可以通过用蛋白分解酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)处理如上述获得的抗体、或通过克隆抗体的DNA并在应用大肠杆菌或酵母的培养系统中表达而产生。

尽管与游离AIM“反应”、“识别”游离AIM和与游离AIM“结合”在本说明书中同义应用，它们应以最广义解释而不限于这些示例。抗体是否与抗原(化合物)诸如游离AIM“反应”可以通过下列确认：抗原固相ELISA法、竞争ELISA法、夹心ELISA法等，以及应用表面等离子体共振原理的方法(SPR法)等。SPR法可以通过应用可在Biacore(注册商标)名称下商购的装置、传感器和试剂进行。

在本说明书中，“不溶性载体”可表示为“固相”，并且用不溶性载体物理上或化学上支持抗原或抗体或支持状态可表示为“固定”、“固定的”或”固相化的”。术语“分析”、“检测”或“测定”应以最广义的含义解释，包括游离AIM的存在证明和/或定量，并且不应以任何意义以限定方式解释。

(免疫分析方法)

本发明的免疫分析方法的例子包括但不限于电化学发光免疫分析(ECL法)、ELISA、酶免疫分析、免疫组化染色法、表面等离子体共振法、乳胶凝集免疫分析、化学发光免疫分析、荧光抗体法、放射免疫分析、免疫沉淀法、蛋白质印迹法、免疫色谱、EATA法(电动分析物传输分析(Electrokinetic Analyte Transport Assay))和高效液相色谱(HPLC)。

通过应用可以与所应用的抗体结合的标记的抗体(二次抗体)，可以测定结合于游离AIM的抗体的量并且可以由此测定生物样品中的游离AIM的量。用于产生标记的抗体的标记物质的例子包括酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、亲和素、放射性同位素、胶体金颗粒或着色乳胶。本领域技术人员可以取决于所应用的抗体和标记物质适当选择免疫分析方法。

电化学发光免疫分析(ECL法)优选地用作免疫分析方法。电化学发光免疫分析(ECL法)是指通过使标记物质通过电化学刺激发光和检测发光的量来计算分析物的量的方法。在电化学发光免疫分析(ECL法)中，钌络合物可以用作标记物质。通过在固相(微孔板或珠等)上设置电极并在电极上引起电化学刺激，可以检测此钌络合物的发光的量。

尽管与游离AIM特异性反应的抗体可用作固相抗体或检测抗体，电化学发光免疫分析(ECL法)优选地通过使用与游离AIM特异性反应的抗体作为固相抗体，和与固相抗体识别不同的表位的抗-AIM抗体作为检测抗体(标记的抗体)进行。当与游离AIM特异性反应的抗体用作固相抗体、同时抗-AIM抗体用作标记的抗体，并且珠和钌络合物分别用作固相和标记时，测定原理如下。下文描述本发明的一个实施方案中的测定原理，且完全不限制本发明的范围。

1.当具有与其结合的与游离AIM特异性反应的抗体的珠在抗-IgM抗体存在下与样品反应时，样品中的游离AIM与结合于珠的固相抗体结合。

2.洗涤珠之后，使钌-标记的抗体与结合于珠的游离AIM反应并且以夹心形状结合。

3.洗涤珠之后，当在电极上应用电能时，钌络合物取决于经由游离AIM结合于珠的钌-标记的抗体的量发光。通过测定此发光的量，可以测定样品中的游离AIM。

与游离AIM特异性反应且与固相抗体识别不同的表位的抗体也可以用作钌-标记的抗体。

在免疫分析中，由于可以容易和快速地测定靶，应用酶标记的ELISA法也是优选的。在夹心ELISA的情况下，可以应用具有与其固定的与游离AIM特异性反应的抗体的不溶性载体，和被标记物质标记且与固定的抗体识别不同的表位的抗-AIM抗体。在此情况下，不溶性载体优选地是板(免疫板)，并且可以适当选择和应用标记物质。

尽管与游离AIM特异性反应的抗体可用作固相抗体或检测抗体，夹心ELISA优选地通过应用与游离AIM特异性反应的抗体作为固相抗体，和与固相抗体识别不同的表位的抗-AIM抗体作为检测抗体(标记的抗体)进行。在抗-IgM抗体存在下，固定在不溶性载体上的与游离AIM特异性反应的抗体捕获样品中的游离AIM，并在不溶性载体上形成抗体-游离AI M复合体。用标记物质标记的抗体与捕获的游离AIM结合，而与上述抗体-游离AIM复合体形成夹心结构。样品中的游离AIM可以通过用对应于标记物质的方法测定标记物质的量而测定。对于具体的方法，诸如，用于在不溶性载体上固定抗体的方法以及用于结合抗体和标记物质的方法，可以没有限制地应用本领域技术人员公知的方法。

与游离AIM特异性反应且与固相抗体识别不同的表位的抗体也可以用作标记的抗体。高效液相色谱法(HPLC法)或EATA法(电动分析物传输分析)也可以用作免疫分析方法。通过应用富士胶片和光纯药株式会社制造的μTAS Wako i30，可以进行EATA法。

乳胶免疫凝集方法(下文也称为LTIA法)是典型的颗粒凝集免疫分析，并且也优选作为免疫分析方法。在LTIA法中，使用携带有针对靶成分的抗体的乳胶颗粒，并通过光学方法(例如，测定透射光的浊度法(turbidimetric method)、测定散射光的比浊法(turbiditymethod))对乳胶颗粒的凝集的程度(浊度)进行检测，由此可以分析靶成分，其中，所述凝集由作为靶成分的抗原与支持有抗体的乳胶颗粒之间形成抗原-抗体复合体而结合而引起。在本发明的免疫分析方法中应用了携带有与游离AIM特异性反应的抗体的乳胶颗粒，可以通过光学方法检测乳胶颗粒的凝集的程度，该凝集由为靶成分的游离AIM与支持有抗体的乳胶颗粒之间结合形成抗原-抗体复合体引起。当采用LTIA法时，可以使用与游离AIM特异性结合的两种或更多种抗体，或者也可以使用与游离AIM特异性反应的抗体，以及具有与游离AIM和复合体AIM二者反应的性质的抗体。

[2]用于测定游离AIM的量的分析试剂盒

本发明的用于游离AIM量的分析试剂盒包括抗-IgM抗体和至少一种与游离AIM特异性反应的抗体。本发明的分析试剂盒也可以包括其它检测试剂、样本稀释剂和/或使用说明书。

本发明的用于游离AIM量的分析试剂盒优选地包括下列(1)至(3)：

(1)固相，在其上固定有与游离AIM特异性反应的抗体；

(2)抗-AIM抗体，其用电化学发光物质标记且与固定的抗体识别不同的表位；和

(3)抗-IgM抗体。

当应用ECL法时，本发明的分析试剂盒优选地包括在其上固定有与游离AIM特异性反应的抗体的固相，和用电化学发光材料诸如钌络合物标记的抗-AIM抗体。例如，在应用微珠作为固相的试剂盒中，在抗-IgM抗体存在下，将生物样品添加至在其上固相化有与游离AIM特异性反应的抗体的微珠并与其反应，然后除去和洗涤样品。随后，添加用电化学发光材料标记且与与游离AIM特异性反应的抗体识别不同表位的抗-AIM抗体，并使其反应。洗涤微珠后，施加电能用于发光，可以测定标记物质的发光的量以获得游离AIM浓度。

固定的抗体和标记的抗体中的至少一种可为与游离AIM特异性反应的抗体，而与游离AIM特异性反应且与固相抗体识别不同的表位的抗体也可以用作用电化学发光物质标记的抗体。

当应用夹心ELISA法时，分析试剂盒包括至少下列(1)至(3)：

(1)不溶性载体，在其上固定有与游离AIM特异性反应的抗体(固相抗体)；

(2)抗-AIM抗体(标记的抗体)，其被标记物质标记且与固相抗体识别不同的表位；和

(3)抗-IgM抗体.

在这样的试剂盒中，首先，在抗-IgM抗体存在下将生物样品添加至在其上固定有固相抗体的不溶性载体，和然后温育，并除去和洗涤样品。添加标记的抗体然后温育，并且添加底物用于显色。通过用读板仪等测定显色，可以获得所述生物样品中的游离AIM浓度。

固定的抗体和标记的抗体中的至少一种可为与游离AIM特异性反应的抗体，而与游离AIM特异性反应且与固相抗体识别不同的表位的抗体也可以用作标记的抗体。

当应用LTIA法时，分析试剂盒可以是应用LTIA法的游离AIM分析试剂盒，其包括至少下列(1)至(3)：

(1)乳胶颗粒，在其上固定有与游离AIM特异性反应的抗体(第一固相抗体)；

(2)乳胶颗粒，在其上固定有与固相抗体识别不同的表位的抗-AIM抗体(第二固相抗体)；和

(3)抗-IgM抗体。

在这样的分析试剂盒中，在抗-IgM抗体存在下，第一固相抗体和第二固相抗体借助游离AIM凝集。通过应用光学方法检测凝集的程度，可以获得所述生物样品中的游离AIM浓度。

(NASH)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大致分类为其中脂肪仅沉积在肝细胞中的单纯性脂肪肝，和其中脂肪沉积伴有肝细胞变性/坏死和炎症以及纤维化的脂肪性肝炎。“NASH”意味着后者。因此，在本说明书中，“NASH”意味着除了其中脂肪仅沉积在肝细胞中的单纯性脂肪肝以外的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。

NASH的病理诊断可根据例如日本胃肠病学会(Japanese Society ofGastroenterology)的非酒精性脂肪肝病/非酒精性脂肪性肝炎循证临床实践指南(Evidence-based Clinical Practice Guidelines for Nonalcoholic Fatty LiverDisease/Nonalcoholic Steatohepatitis，2014版)进行。具体地，患者可以根据指南第80页所述的Mattenoni分类进行分类，并且3型和4型可以诊断为NASH。1型和2型可诊断为NAFL。此外，根据指南第82页所述的NAS(NAFLD活动评分)对患者进行分类，具有5分或更高的患者极有可能患有NASH。根据指南第82页中描述的Yoonossi诊断标准，满足以下(1)或(2)时可诊断为NASH。

(1)除了肝细胞脂肪变化(无论程度如何)，还观察到肝细胞小叶中心膨胀(centrilobular ballooning)和Mallory-Denk小体。

(2)除肝细胞脂肪变化外，还观察到小叶中心细胞周/窦周(centrilobularpericellular/perisinusoidal)纤维化或桥接纤维化。

在本说明书中，“NASH”包括伴有晚期NASH的肝硬化，并且不包括伴有晚期NASH的肝细胞癌。

专利文献1描述了在患有NAFL的对象和患有NASH的对象的血清中游离AIM的量没有发现差异。然而，当在抗-IgM抗体存在下进行分析时，可以确认患有NAFL的对象和患有NASH的对象的血清中游离AIM的量有显著差异。在专利文献1中，推测在用于游离AIM的免疫分析方法中发生由复合AIM引起的非特异性反应，并抑制了对象之间显著差异的产生。

在进行本发明的NAFLD或NASH的检测或方法之后，如果需要，可对患者进行其它NASH检测方法和/或可向患者施用NASH治疗剂。

(信号)

信号没有特别限制，只要能够准确地测量游离AIM量即可，可以采用本领域技术人员已知的任何信号。信号可以是用于标记抗体的标记物质发出的信号。用于标记抗体的标记物质的例子包括酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、亲和素、放射性同位素、胶体金颗粒或着色乳胶。用于结合标记物质与抗体的方法可以是可以由本领域技术人员应用的诸如戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法或高碘酸法的方法。对于任何标记物质和结合方法，可以使用已知方法，不限于上述。例如,当酶诸如过氧化物酶或碱性磷酸酶用作标记物质时，酶活性可以通过应用酶的特异性底物(例如，当酶是辣根过氧化物酶时，为1,2-苯二胺或3,3',5,5'-四甲基联苯胺，或当酶是碱性磷酸酶时，为对硝基苯基磷酸酯)而测定，当生物素用作标记物质时，至少用生物素以外的标记物质标记的亲和素典型地与其反应。

当应用LTIA法时，可以通过应用散射光强度、透射光强度、吸光度等光学测定乳胶凝集的程度，乳胶凝集的程度可以用作信号。光学测定可以应用由能够检测散射光强度、透射光强度、吸光度等的光学装置代表的任何通常的生化自动分析仪，或配备有多种这些检测方法的光学装置进行。将常规已知的方法用作用于光学测定凝集的程度的方法，其例子包括其中将凝集的形成捕捉为浊度增加的浊度法(turbidimetric method)、其中将凝集的形成捕捉为粒度分布或平均粒径的变化的方法，和其中通过应用积分球测量由凝集的形成引起的前向散射光的变化用于比较与透射光强度的比的积分球浊度法(integratingsphere turbidity method)。

(参考值)

本发明的用于检测NASH的方法包括将测定的游离AIM量与参考值比较。在本发明的用于检测NASH的方法中，NASH可以通过以下事实检测：应用对象中游离AIM的量高于健康对象组或NAFL组中游离AIM的量。具体地，例如，当对象中游离AIM的量等于或大于用于健康对象组或NAFL组的阈值(参考值)时，可以确定患有NASH的可能性高。

可以将数值范围用作参考值。在诊断一个人是否患有NASH的情况下，预先测定已被诊断患有NASH的对象和已被诊断为未患有NASH的对象的生物样本中游离AIM的量的范围，并且如果对象的生物样本中游离AIM的量落入健康对象或患有NAFL的对象的生物样品中游离AIM的量的范围内，该对象极有可能没有NASH，并且如果该量落在患有NASH的对象的生物样品中游离AIM的量的范围内，该对象极有可能患有NASH。

期望所述阈值(参考值)根据各种条件诸如基础疾病、性别和年龄而变化；但是，本领域技术人员可以适当地选择与对象对应的合适的群体，并可以通过对从群体中获得的数据进行统计处理来确定正常值范围或阈值。例如，参考值可以是在人血清中为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1.0μg/mL、1.1μg/mL、1.2μg/mL、1.3μg/mL、1.4μg/mL、1.5μg/mL、1.6μg/mL、1.7μg/mL、1.8μg/mL、1.9μg/mL、2.0μg/mL、2.1μg/mL、2.2μg/mL、2.3μg/mL、2.4μg/mL、2.5μg/mL、2.6μg/mL、2.7μg/mL、2.8μg/mL、2.9μg/mL、3.0μg/mL、3.1μg/mL、3.2μg/mL、3.3μg/mL、3.4μg/mL或3.5μg/mL的值。

本发明的用于检测NASH的方法还可以监测对象中从NAFL到NASH的进展。当在特定时间点测定患有NAFL的对象中的游离AIM的量，并且在一定期间后(例如，1、3、6或12个月后，或3至6个月后)，再次测定该对象的游离AIM的量时，如果游离AIM的量超过参考值，则可以确定发生了从NAFL到NASH的进展。相反，如果该量低于参考值，则可以确定没有发生从NAFL到NASH的进展。

(用于NASH的诊断试剂盒)

用于游离AIM量的分析试剂盒可以用作用于NASH的诊断试剂盒。特别地，可以将包含(1)至(3)的应用ECL法的用于游离AIM的分析试剂盒、包含(1)至(3)的应用夹心ELISA法的用于游离AIM量的分析试剂盒，和包含(1)至(3)的应用LTIA法的用于游离AIM量的分析试剂盒用作用于NASH的诊断试剂盒。

本发明将在下文用实施例具体描述；但这些实施例并不限制本发明的范围。如果没有特别说明，则％意味着按重量计的％。

实施例

[制备实施例1：与游离AIM特异性反应的抗体的制备]

1.小鼠抗-人AIM单克隆抗体的制备

抗体号1和抗体号2是小鼠抗-人AIM单克隆抗体，并通过下列程序获得。

通过混合作为抗原的全长人rAIM(1mg/ml)与等量的TiterMax Gold(G-1Funakoshi)制备乳剂。将两只8周龄雌性Balb/c小鼠(Charles River Laboratories)用作免疫动物，将100μL的抗原溶液施用于后足底。两周后进行相同的施用，并且在另一个2周或更长时间后，将100μg的抗原溶液施用于后足底，以准备用于3天后进行的细胞融合。小鼠P3U1用于骨髓瘤细胞。

在麻醉下收集心脏血液后，从小鼠无菌取出腘淋巴结，并将腘淋巴结置于带有#200网孔的烧杯上并用硅棒按压，以制备细胞悬浮液。将细胞在RPMI 1640中离心洗涤2次，然后计数细胞的数目。将对数生长期中的骨髓瘤细胞通过离心收集，洗涤，然后调节使得淋巴细胞与骨髓瘤细胞的比是5:1，并进行混合离心。通过应用PEG1500(783641Roche)进行细胞融合。具体地，在细胞球团与1mL的PEG溶液反应3分钟后，然后梯度稀释，并通过离心洗涤，添加培养基，并且在15个96孔板中置入200μL/孔，进行1周培养。关于培养基，将HAT补充剂(21060-017GIBCO)添加至用于骨髓瘤细胞的培养基以调节FBS浓度至15％。

将冷冻保存的细胞解冻和进行增殖培养后，将1×10⁸个细胞施用于在1周或更长时间之前对其腹膜内施用了0.5ml的pristane(42-002Cosmo Bio)的裸小鼠(BALB/cAJcl-nu/nu Nippon Claire)的腹腔，并且在约2周后，获得4至12ml的腹水。通过离心除去固体物后，冷冻保存腹水。随后，从冷冻保存的腹水纯化抗体，以获得抗体号1和抗体号2。

[实施例1：通过添加抗-人IgM抗体抑制非特异性反应的效果的确认]

1.通过柱色谱分离人样本

通过尺寸排阻色谱(TSKgel G3000 SWXL，Tosoh)对10μL的人样本进行尺寸分级，以获得复合体AIM和游离AIM的各自级分(复合体AIM：级分号6和7，游离AIM：级分号14和15)。通过以1mL/min的流速应用磷酸盐缓冲液进行HPLC，获得各级分各500μL。

2.抗体号2-结合的磁珠的制备

1)测定用150mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8)进行了透析的抗体号2的吸光度，并通过应用相同缓冲液调节至Abs 0.5。

2)应用缓冲液，洗涤1mL(30mg/mL)的Dynamic Biotech制造的Dynabeads M-450Epoxy 3次，并添加1mL的1)的抗体溶液。在25℃进行旋转搅拌18小时或更长时间。

3)用珠封闭缓冲液[50mM Tris，150mM NaCl，0.1％BSA，0.09％NaN₃，pH 7.8]洗涤2)中制备的珠两次。通过洗涤除去缓冲液，从而除去保持在溶液中且未与珠结合的抗体。随后，添加1mL的珠封闭缓冲液并搅拌，并在25℃进行旋转搅拌18小时或更长时间。

4)用珠封闭缓冲液洗涤珠两次后，添加1mL的珠封闭缓冲液并搅拌。将它们用作抗体-结合的磁珠并在4℃保存直至应用。

3.钌-标记的抗体号1的制备

1)向用150mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8)进行了透析的312.5μL的抗体号1溶液添加14.1μL的10mg/mL钌络合物(Origin Tag-NHS ESTER，IGEN制造)，并搅拌溶液30分钟。随后，添加50μL的2M甘氨酸，并搅拌溶液20分钟。

2)将钌络合物-标记的抗体用于在直径1cm，高度30cm的玻璃管中填充的凝胶过滤柱色谱(Sephadex G-25，GE Healthcare Bioscience制造)，以分离和纯化非标记钌络合物和钌络合物-标记的抗体。用10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)进行洗脱。

4.通过添加抗-人IgM抗体抑制非特异性反应的效果的确认

1)从复合体AIM级分(编号6和7)各采取10μL，以将总共20μL添加至200μL的反应溶液[50mM HEPES，50mM NaCl，0.05％Tween 20，1mM EDT-4Na，0.5％BSA，0.09％NaCl₃，100μg/mL小鼠IgG，pH 7.8]或包含抗-IgM抗体的反应溶液。类似地，游离AIM级分(编号14和15)采取各10μL，以将总共20μL添加至200μL的反应溶液或包含抗-IgM抗体的反应溶液。关于抗-IgM抗体，HBR-1、HBR-3、HBR-6、HBR-9、HBR-20、HBR-21、HBR-23或HBR-26都基于反应溶液调节至50μg/mL并应用。HBR-6和HBR-20是抗-IgM单克隆抗体。

2)向溶液中添加25μL的、用珠稀释剂[50mM HEPES，100mM NaCl，0.1％Tween 20，1mM EDT-4Na，0.5％BSA，0.09％NaN₃，pH 7.8]稀释为0.5mg/mL的浓度的抗体号2-结合的磁珠，并在30℃反应9分钟(第一反应)。

随后，用磁体捕获磁珠，提取反应管中的液体，并用350μL的洗涤液[50mmol/LTris HCl，0.01％(W/V)Tween 20，0.15mol/L NaCl，pH 7.5]洗涤磁珠两次，以去除抗原-抗体反应之外的非特异性结合物质(BF分离)。

3)随后，添加200μL的，用对于钌的稀释液[50mM HEPES，50mM NaCl，0.05％Tween20，1mM EDT-4Na，0.5％BSA，0.09％NaN₃,100μg/mL小鼠IgG,pH 7.8]稀释至0.6μg/mL浓度的钌-标记的抗体号1，并在30℃反应9分钟(第二反应)。

用磁体捕获反应后的磁珠，提取反应管中的液体，并用350μL的洗涤液洗涤磁珠两次，以去除抗原-抗体反应之外的非特异性结合物质(BF分离)。

4)随后，将300μL的三丙胺置于反应管中并与磁珠混合。通过在此状态施加电能，钌络合物发光，并通过检测器检测发光强度。

在向反应管添加磁珠的操作后，这在自动钌络合物发光测定仪Picolumi III上进行。

5.结果

结果示于图1。当F6+F7的计数比低于基准时，抗体与复合体AIM的非特异性反应可能更受抑制。当F14+F15的计数比低于基准时，抗体对游离AIM的灵敏度可能更降低。相对于对其不添加抗-IgM抗体的测定系统，在对其添加抗-IgM抗体的测定系统中，F6+F7的计数比是94.3％、88.3％、87.6％、92.3％、81.8％、91.2％、91.3％或91.0％。因此，在对其添加抗-IgM抗体的任一测定系统中，抗体与复合体AIM的非特异性反应被抑制。

[实施例2：通过在本发明的测定系统中添加抗-人IgM抗体抑制非特异性反应的效果的确认]

应用ECL法，通过下列程序验证通过在本发明的测定系统中添加抗-人IgM抗体抑制非特异性反应的效果。

1.抗体-结合的磁珠的制备

程序与实施例1相同。

2.钌标记的抗体的制备

程序与实施例1相同。

3.用游离AIM-特异性抗体测定游离AIM量和IgM-AIM量

1)通过与实施例1相同的程序，将健康人血清样品分离成级分，并且用反应溶液[50mM HEPES,50mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM EDT-4Na,0.5％BSA,0.09％NaN₃,100μg/mL小鼠IgG,50μg/mL抗-人IgM抗体,pH 7.8]将包含IgM-AIM的级分和包含游离AIM的级分稀释至1/10，以制备样本稀释液。随后，将100μL的反应溶液置于反应管中，并添加2μL的样本稀释液。

2)向溶液中添加25μL的、用珠稀释剂[50mM HEPES,100mM NaCl,0.1％Tween 20,1mM EDT-4Na,0.5％BSA,0.09％NaN₃,pH 7.8]稀释为0.5mg/mL的浓度的抗体号2-结合的磁珠，并在30℃反应9分钟(第一反应)。

随后，用磁体捕获磁珠，提取反应管中的液体，并用350μL的洗涤液[50mmol/LTris HCl，0.01％(W/V)Tween 20，0.15mol/L NaCl，pH 7.5]洗涤磁珠两次，以去除抗原-抗体反应之外的非特异性结合物质(BF分离)。

3)随后，添加200μL的，用对于钌的稀释液[50mM HEPES，50mM NaCl，0.05％Tween20，1mM EDT-4Na,0.5％BSA,0.09％NaN₃,100μg/mL小鼠IgG,pH 7.8]稀释至0.6μg/mL浓度的钌-标记的抗体号1，并在30℃反应9分钟(第二反应)。

用磁体捕获反应后的磁珠，提取反应管中的液体，并用350μL的洗涤液洗涤磁珠两次，以去除抗原-抗体反应之外的非特异性结合物质(BF分离)。

4)随后，将300μL的三丙胺置于反应管中并与磁珠混合。通过在此状态施加电能，钌络合物发光，并通过检测器检测发光强度。

在向反应管添加磁珠的操作后，这在自动钌络合物发光测定仪Picolumi III上进行。

5)对于通过用不包含抗-人IgM抗体的反应溶液稀释健康人血清样品至1/10而制备的样本稀释液，重复操作1)至4)以获得对照。

图2显示相对于IgM-AIM检测量和游离AIM检测量的总量的、IgM-AIM检测量的百分数或游离AIM检测量的百分数。实施例2的测定系统是应用了对游离AIM特异性的单克隆抗体的抗体号2的测定系统，因此，当IgM-AIM量相对于IgM-AIM量和游离AIM量的总和的百分数越低时，由IgM-AIM引起的非特异性反应可能越降低。因此，IgM-AIM的检测量可能代表对抗体号2的由IgM-AIM引起的非特异性反应的程度。

在添加了抗-人IgM抗体的测定系统中，IgM-AIM量是IgM-AIM量和游离AIM量的总量的2.4％，并且在未添加抗-人IgM抗体的测定系统中，IgM-AIM量是IgM-AIM量和游离AIM量的总量的7.5％。因此，发现抗-人IgM抗体的添加可以抑制与游离AIM特异性结合的抗体的非特异性反应，所述非特异性反应由IgM-AIM引起。

[实施例3：本发明的测定系统和现有测定系统之间的比较]

在本发明的测定系统和现有测定系统之间，比较由IgM-AIM量引起的非特异性反应的程度。

(3-1)本发明的测定系统

通过应用与实施例2的ECL法相同的程序，对包含IgM-AIM和包含游离AIM的每一级分测定游离AIM量和IgM-AIM量。

(3-2)现有测定系统

通过应用人AIM ELISA试剂盒(CY-8080,CircuLex)，对包含IgM-AIM和包含游离AIM的每一级分测定游离AIM量和IgM-AIM量。方案遵照人AIM ELISA试剂盒的包装插页。将结果示于图3。

在本发明的测定系统中，IgM-AIM量是IgM-AIM量和游离AIM量的总量的2.5％，并且在现有测定系统中，IgM-AIM量是IgM-AIM量和游离AIM量的总量的19.7％。因此，证明本发明的测定系统具有显著低于现有测定系统的非特异性反应。

[实施例4：通过本发明的测定系统或现有测定系统检测NASH]

(4-1)本发明的测定系统

通过应用与实施例2的ECL法相同的程序，在42份NAFL患者血清样本、141份NASH患者血清样本和26份NASH-HCC患者血清样本中测定游离AIM量，以研究是否在患者间产生显著差异。

(4-2)现有测定系统

通过应用人AIM ELISA试剂盒(CY-8080,CircuLex)，在42份NAFL患者血清样本、141份NASH患者血清样本和26份NASH-HCC患者血清样本中测定游离AIM量，以研究是否在患者间产生显著差异。方案遵照人AIM ELISA试剂盒的包装插页。将结果示于图4。

在本发明的测定系统中，NASH患者血清中的游离AIM量显著高于NAFL患者血清中的游离AIM量。在现有测定系统中，NASH患者血清中的游离AIM量与NAFL患者血清中的游离AIM量处于相同水平，并且患者间未观察到显著差异。在本发明的测定系统中，对测定系统添加抗IgM抗体能够可能地抑制IgM-AIM对游离AIM特异性抗体的非特异性反应，从而在NASH患者血清中的游离AIM量和NAFL患者血清中的游离AIM量之间产生显著差异。

工业实用性

根据本发明，在包含复合体AIM和游离AIM的生物样品的免疫分析方法中，可以进一步提高与游离AIM特异性反应的抗体对游离AIM的特异性。根据本发明，可以不给患者和医务人员施加负担地诊断NASH。