一种血小板功能测试装置、试剂盒及其应用
阅读说明：本技术 一种血小板功能测试装置、试剂盒及其应用 (Platelet function testing device, kit and application thereof ) 是由 任宏超 陈堃 于 2021-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种血小板功能测试装置、试剂盒及其应用,涉及血液功能测试技术领域。其包括底板,在底板上预制有样本室、样本通路、搅拌室和血流通路。在搅拌室的内壁上具有血小板诱导物涂层,血流通路的内壁具有细胞外基质蛋白涂层。上述血小板功能测试装置没有复杂的取样系统和运动控制系统,消除了取样潜在的交叉污染风险和测试不确定性。而且该测试装置可以完全模拟血管内环境,提高了测试的准确性、一致性和可靠性。此外,血小板功能测试装置设计简单,大大降低了测试系统的购置和维护成本,具有很好的可维护性。(The invention provides a platelet function testing device, a kit and application thereof, and relates to the technical field of blood function testing. The device comprises a bottom plate, wherein a sample chamber, a sample passage, a stirring chamber and a blood flow passage are prefabricated on the bottom plate. The inner wall of the stir chamber has a platelet-inducer coating thereon and the inner wall of the blood flow path has an extracellular matrix protein coating thereon. The platelet function testing device has no complex sampling system and motion control system, and eliminates the potential cross contamination risk and testing uncertainty of sampling. And the testing device can completely simulate the environment in the blood vessel, and improves the accuracy, consistency and reliability of the test. In addition, the platelet function testing device is simple in design, greatly reduces the purchase and maintenance cost of the testing system, and has good maintainability.)
技术领域
本发明涉及血液功能测试技术领域，具体而言，涉及一种血小板功能测试装置、试剂盒及其应用。
背景技术
目前的生化试验，血凝检测和血小板功能检测设备普遍使用的是分立的样品杯、试剂杯和反应杯。样品和试剂分别贮存在样品杯和试剂杯中，在进行生化试验时，用取样装置分别吸取样本和试剂，并将它们移到反应杯中，在反应杯中反应。
而在血凝和血小板测试中，普遍采用的是凝固法和光学比浊法(LTA)。其核心就是利用光学方法检测血样跟试剂反应过程中的生成物，通过检测散射光信号的变化来记录血液凝固过程，得出凝固曲线。其中，光学比浊法的检测原理是将血液通过离心方法获得富含血小板的血浆(PRP)，采用不同浓度的一系列血小板诱导剂(花生四烯酸、二磷酸腺苷、肾上腺素)刺激富含血小板的血浆后，由于血小板聚集、沉淀，血浆浊度下降，经光源照射，其透光率增加，从而测定激活血小板间的聚集程度。
此检验的检测操作流程如图1所示：以含3.2％柠檬酸钠抗凝剂的全血为标本，通过离心获得富含血小板的血浆(PRP)(存储于反应杯1中)和去除血小板的血浆(PPP)(存储于反应杯2中)，经光学系统测量反应杯2中PPP光强值作为100％血小板聚集率的目标值，然后测量反应杯1中的PRP，加入血小板诱导剂产生反应，记录反应过程，反应终止时对比PPP光强值计算血小板聚集率。在整个操作过程当中，血浆和试剂是贮存在不同的样品杯中。反应是在反应杯中完成。待测样品和试剂通过取样机构移到反应杯中进行测试。试剂的加样可以是手工加样或自动加样。在全自动凝血仪系统中，此测试流程的完成是通过样本取样系统，试剂取样系统，运动控制系统共同配合完成的。系统的设计非常复杂，维护和调试比较繁琐。
现有的全自动血凝测试技术和试剂虽然已经得到了很广泛的应用，但其最显著的缺点就是设备系统复杂，操作繁琐，成本高，而且测试过程不能完全模拟血管环境。利用凝固法或光学比浊法测试存在凝固时间，测试时间长，容易造成交叉污染，测试的结果一致性也有待提高。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血小板功能测试装置、试剂盒及其应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种血小板功能测试装置，其包括底板，在底板上预制有样本室、样本通路、搅拌室和血流通路，样本室通过样本通路与搅拌室连通，搅拌室与血流通路连通；在样本室和搅拌室的内壁上具有血小板诱导物涂层、血小板诱导物微珠或微粒，血流通路的内壁具有细胞外基质蛋白涂层。
发明人基于现有技术存在的问题，提供了一种一体化的用于血小板功能测试装置。此功能测试装置能够模拟体内的血流动力学环境，包括血小板诱导、与细胞外基质(ECM)底物粘附、聚集诱导的流动停止等,从而可以提供与临床结果比较一致的诊断结果。
具体地，通过在搅拌室的内壁上设置血小板诱导物涂层，通过搅拌室的搅拌作用从而使得搅拌室涂覆的血小板诱导物迅速溶解到从样本室来的血液中，从而对血小板进行诱导，模拟体内的血小板激活或抑制的情形。在搅拌室提供搅拌动力的基础上，血液流入分布有细胞外基质蛋白涂层的血流通路，从而模拟细胞外基质(ECM)底物粘附、血小板聚集导致止血阻塞的全过程。从而导致微流体逐渐停止流动，这样通过血液流经的血流通路的迁移距离(MD，Migration distance)判断血小板的功能。
与现有技术相比，本发明提供的血小板功能测试装置没有复杂的取样系统和运动控制系统，消除了取样潜在的交叉污染风险和测试不确定性。而且该测试装置可以完全模拟血管内环境，提高了测试的准确性、一致性和可靠性。此外，血小板功能测试装置设计简单，大大降低了测试系统的购置和维护成本，具有很好的可维护性。采用本发明提供的血小板功能测试装置无需等待凝固，直接上样即可进行血小板功能测试，具有测试时间短的优势。
上述搅拌室可以设置有搅拌叶片或搅拌棒，也可以是液体传送带、传送板或旋转水车，只要能满足血液的传输递送的装置均可以安装在搅拌室中。搅拌的作用在于提供血液流动的动力。在一种可选的实施方式中，为了实现自动化，可以在相应的搅拌叶片或搅拌的传动端设置电机以满足动力的传输。
在一种实施方式中，设置一个带有磁性的搅拌棒，通过在搅拌棒下面设置的电机带动具有相反磁极的叶轮转动，实现搅拌，并为血液流动提供动力。
需要说明的是，上述血流管路内壁的涂层可以根据需要在不同位置设置涂层，例如可以选择间隔一定的距离设置涂层，也可以选择连续性涂层，设置表面涂层可以模拟损伤的血管环境。
涂层的制备是通过如下方法来制备。涂层是通过定量控制的器具滴注到微型管道上，自然干燥，如此涂敷在管道上。微球涂层结构通过专用挤压工艺实现。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述血小板诱导物选自血小板聚集促进剂和/或血小板聚集抑制剂；
血小板聚集促进剂选自如下的至少一种物质：
ADP、肾上腺素和TXA2；
血小板聚集抑制剂选自抗血小板药；优选地，抗血小板药选自血栓素A2抑制剂、ADP-P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5-羟色胺(5-HT)受体拮抗剂、血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)IIb/IIIa受体抑制剂、或磷酸二酯酶抑制剂。
血栓素A2(TXA2)抑制剂选自如下物质的至少一种：阿司匹林、花生四烯酸(AA)和前列地尔(PGE1)。在其他实施方式中，血小板聚集抑制剂也可选自其他的血栓素合酶抑制剂，诸如双嘧达莫、吡考他胺、特波格雷、达曲班、塞曲司特、SQ-29548和雷马曲班；以及血栓素受体拮抗剂，诸如特波格雷和特鲁曲班。
二磷酸腺苷(ADP)-P2Y12受体拮抗剂作用机理在于拮抗P2Y12蛋白，从而防止ADP与P2Y12受体结合。这导致血小板聚集减少，从而阻止了血栓形成。P2Y12受体是在血小板上发现的表面结合蛋白。它们属于G蛋白偶联嘌呤能受体(GPCR)，并且是ADP的化学受体。ADP-P2Y12受体抑制剂的示例包括但不限于噻吩并吡啶，诸如氯吡格雷、普拉格雷和噻氯匹啶或其盐；以及核苷酸/核苷类似物/受体拮抗剂，诸如坎格雷洛、依诺格雷、替格瑞洛、苏拉明钠和2-MeSAMP。
凝血酶受体拮抗剂包括不限于Vorapaxar(SCH-530348)、Atopaxar(E5555)。
5-羟色胺(5-HT)受体拮抗剂包括不限于沙格雷酯、西酞普兰。
糖蛋白IIb/IIIa也称为整合素αIIbβ3，是在血小板上发现的整合素复合物。它是纤维蛋白原和血管性血友病(von Willebrand)因子的受体，并且有助于血小板活化。糖蛋白IIb/IIIa抑制剂可以用于防止血凝块，以降低心脏病发作或中风的风险。糖蛋白IIb/IIIa的示例包括但不限于阿昔单抗、依替巴肽(也称为整联蛋白)、奥波非班、洛曲非班、罗西非班、西拉非班和替罗非班(也称为艾卡特)或其盐。优选的糖蛋白IIb/IIIa抑制剂是依替巴肽和替罗非班或其盐。
磷酸二酯酶抑制剂包括不限于：双嘧达莫、西洛他唑、三氟柳、米力农、阿那格雷、茶碱或待匹力达(Dipyridamole)。磷酸二酯酶的抑制剂可以通过抑制磷酸二酯酶的降解来延长或增强由cAMP或cGMP介导的生理过程的作用，从而抑制血小板的功能。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述细胞外基质蛋白选自如下蛋白中的至少一种：纤维蛋白原、胶原蛋白、血管性血友病因子(vWF)、组织因子(TFs)、凝血酶原、组织凝血致活素、加速球蛋白、血清凝血酶、抗血友病因子、血浆凝血致活素成分、血浆凝血致活素前质、接触因子或纤维蛋白稳定因子。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述搅拌室的数目与血流通路的数目相同。例如，搅拌室可以设置2个、3个、4个或者5个，从而满足血小板多功能的检测，相应的设置2个、3个、4个或者5个血流通路。
当搅拌室为两个时，样本通路从一个样本室引出分为两个分支样本通路，且两个分支样本通路分别与两个搅拌室连通，两个血流通路分别与两个搅拌室连通。
两个搅拌室沿样本室的中轴线对称分布，两个血流通路沿样本室的中轴线对称分布。样本室的中轴线可以是样本室的中心对称轴线。
在一种实施方式中，上述分支样本通路和血流通路均可以是由底板上设置的凹槽组成的通路。在其他实施方式中，也可以选自将管状的结构固定在底板上作为样本通路或血流通路，例如将管的外壁粘贴(外壁点胶)、卡接或栓接在底板上。管的材质可以是塑料、玻璃等材质。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述血流通路内周壁设置有多个微球，微球具有中空的微孔；微球的平均粒径为5μm，多个微球的形成的铺设厚度40μm-50μm；且多个微球与血流通路内壁的细胞外基质蛋白涂层固定连接。
使用中空的微球形成狭窄的通道，血液流过中间的微球微孔。由此可以模拟动脉粥样硬化性狭窄的血管血栓形成的过程。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述血流通路呈盘管状。在实际实施中，可以根据需要设置盘管的长度、弯曲角的角度和弯曲角的数目、盘管的管径。
在一种实施方式中，可以设置血流通路和样本通路的管内径为0.5-2mm。
本发明还提供了一种血小板功能测试试剂盒，其包括上述的血小板功能测试装置。包括不限于二磷酸腺苷(ADP)和肾上腺素(EPI)组合测试盒以及花生四烯酸(AA)和ADP组合测试盒。例如，将AA涂覆于搅拌室的内壁上，将ADP和PGE1涂覆在另一搅拌室的内壁上，在血流通路上涂覆纤维蛋白原，组成AA和ADP血小板功能测试试剂盒。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述血小板功能测试包括如下至少一种的测试：
凝血检验、血小板聚集测试、出血风险评估试验、抗血小板反应试验、剪切介导的血小板聚集试验、全身止血和纤溶试验、血友病检测和抗血栓药物治疗反应评估。
在一种实施方式中，上述出血风险评估试验可以选择C/EPI血小板功能测试试剂盒，即将胶原蛋白(collagen)涂层设置在血流通路的内壁上，将肾上腺素(EPI)涂层设置在搅拌室中的测试试剂盒。
在一种实施方式中，上述血友病(vWD)检测可以选择C/ADP血小板功能测试试剂盒，即将胶原蛋白(collagen)涂层设置在血流通路的内壁上，将二磷酸腺苷(ADP)涂层设置在搅拌室中的测试试剂盒。
在一种实施方式中，上述抗血栓药物治疗反应评估可以选择阿司匹林(ASPIRIN)血小板功能测试试剂盒，即可以选择将纤维蛋白原(Fibrinogen)涂层涂覆在血流通路的内壁上，将花生四烯酸(AA)涂层设置在搅拌室中的测试试剂盒。
在一种实施方式中，上述P2Y12抑制剂反应评估可以选择P2Y12血小板功能测试试剂盒，即可以选择将纤维蛋白原(Fibrinogen)涂层设置在血流通路的内壁上，将ADP涂层和PGE1涂层涂覆在搅拌室中的测试试剂盒。
本发明还提供了一种血小板功能测试装置或血小板功能测试试剂盒在药物筛选中的应用。上述药物为抗血小板药物。抗血小板药选自血栓素A2抑制剂、ADP受体拮抗剂/P2Y12受体拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、5-羟色胺(5-HT)受体拮抗剂、血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)II b/IIIa受体抑制剂、或磷酸二酯酶抑制剂。
本发明中的名词术语解释：
AA：花生四烯酸；
ADP：二磷酸腺苷；
ECM:细胞外基质；
EPI：肾上腺素；
MD:Migration distance迁移距离；
PRP：富含血小板的血浆；
PPP：去除血小板的血浆；
RBC:红血球；
vWD:血友病；
TEG:血栓弹力图。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明提供的血小板功能测试装置没有复杂的取样系统和运动控制系统，消除了取样潜在的交叉污染风险和测试不确定性。而且该测试装置可以完全模拟血管内环境，提高了测试的准确性、一致性和可靠性。此外，血小板功能测试装置设计简单，大大降低了测试系统的购置和维护成本，具有很好的可维护性。采用本发明提供的血小板功能测试装置无需等待血液凝固，直接上样即可进行血小板功能测试，具有测试时间短的优势。
此外本发明还提供了由上述血小板功能测试装置组成的测试试剂盒，该试剂盒可以用于凝血检验、血小板聚集测试、出血风险评估试验、抗血小板反应试验、剪切介导的血小板聚集试验、全身止血和纤溶试验、血友病检测和抗血栓药物治疗反应评估。上述血小板功能测试装置或血小板功能测试试剂盒可以用于药物筛选。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为现有的血小板聚集生化试验流程图；
图2为本发明实施例1提供的测试装置的测试原理图；
图3为ADP和EPI测试盒结构示意图；
图4为AA和ADP测试盒结构示意图；
图5为模拟狭窄的血管血栓形成原理图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
此外，术语“水平”、“竖直”、“悬垂”等术语并不表示要求部件绝对水平或悬垂，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是可以稍微倾斜。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例1
请参阅图2和图3所示，本实施例提供了一种血小板功能测试装置，其包括底板(底板参照图3所示)，在底板上预制有样本室、样本通路、搅拌室和血流通路，样本室通过样本通路与搅拌室连通，搅拌室与血流通路连通。
待测样本从样本室上样，在搅拌室的推力作用下，待测样本沿样本通路流入搅拌室，最后流入血流通路。本实施例中通过在搅拌室设置一个带有磁性的搅拌棒，并通过在搅拌棒下面设置的电机带动具有相反磁极的叶轮转动，实现搅拌，并为血液流动提供动力。
在搅拌室的内壁上具有血小板诱导物涂层，血液流经搅拌室，可以在搅拌的作用下，将搅拌室和样本室上的血小板诱导物迅速溶解至血液中，从而模拟血小板的激活。涂层是通过定量控制的器具滴注到微型管道上，自然干燥，如此涂敷在管道上。
流入血流通路的血液，由于血流通路的内壁具有细胞外基质蛋白涂层，从而使得血小板附着、聚集导致止血阻塞，从而模拟血小板聚集形成止血阻塞的全过程。从血液流经的距离就可以判断出血小板的性能。
图3提供了一种ADP和EPI血小板功能测试试剂盒。该试剂盒还包括配套的使用说明书、底板、包装盒。在底板上开设有3个凹槽，分别作为样本室和两个搅拌室，从样本室引出的是样本通路，分为两个分支。其中一个分支用于ADP测试，另一个分支用于肾上腺素(EPI)测试。在两个搅拌室的内壁上分别涂覆有ADP涂层和EPI涂层。在血流通路的内壁上设置胶原蛋白(collagen)涂层。
研究表明，大多数胶原蛋白/ADP测试迁移距离延长的患者在原发性止血时表现出异常，这可能会使他们在手术过程中面临风险。因此，本发明提供的试剂盒可以用于术前出血风险管理评估。
使用时，操作员只需要使用移液器取200微升左右的全血加入测试盒，4分钟左右就能完成测试，具有操作简单、方便的优势，具有很好的实施实时性。
实施例2
请参阅图4所示，本实施例提供了一种AA和ADP血小板功能测试试剂盒。
该试剂盒还包括配套的使用说明书、底板、包装盒。在底板上开设有3个凹槽，分别作为样本室和两个搅拌室，从样本室引出的是样本通路，分为两个分支。其中一个分支用于阿司匹林治疗反应评估，另一个分支用于P2Y12抑制剂反应评估。
用于阿司匹林治疗反应评估的分支的搅拌室的内壁上涂覆有花生四烯酸(AA)，另一个分支搅拌室的内壁上涂覆有ADP涂层和前列地尔(PGE1)涂层。在血流通路的内壁上设置纤维蛋白原(Fibrinogen)涂层。
研究表明，大多数服用阿司匹林的患者迁移距离延长。阿司匹林患者迁移距离的延长与阿司匹林耐药性密切相关。血小板反应性测试能够准确反映患者对于阿司匹林的耐药性反应。P2Y12试验通过测量ADP诱导的血小板粘附和聚集来检测接受P2Y12拮抗剂治疗的患者血小板P2Y12受体阻断，从而评估P2Y12抑制剂反应。
实施例3
请参阅图5所示，图5的结构是模拟动脉粥样硬化性狭窄的血管血栓形成。本实施例提供了一种血小板功能测试试剂盒。与实施例1相比，区别仅在于，血流通路内设置有45微米左右厚度的微球，微球的平均粒径为5μm，微球具有中空的微孔，使用中空的微球形成直径为0.5毫米左右的狭窄的通道，血液流过中间的微球微孔。由此可以模拟动脉粥样硬化性狭窄的血管血栓形成的过程。该试剂盒可以用于预防意外的发生和患者对药物的反应。
实施例4
与实施例1相比，区别仅在于，血小板诱导物不同，在两个搅拌室的内壁上均涂覆有ADP涂层。在血流通路的内壁上设置胶原蛋白(collagen)涂层。
实施例5
与实施例1相比，区别仅在于，血小板诱导物不同，在两个搅拌室的内壁上分别涂覆有双嘧达莫和西洛他唑涂层。在血流通路的内壁上设置组织凝血致活素涂层。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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