一种降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法
阅读说明：本技术 一种降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法 (Method for reducing seawater pearl shell heterograft immune rejection ) 是由 喻达辉 王培� 白丽蓉 李素萍 郭颖 郑玉斯 翟子钦 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法,属于海水珍珠养殖技术领域。包括以下步骤：S1.将星型孢菌素溶解于细胞处理液中,得到免疫抑制剂溶液；S2.制作供体贝外套膜小片,将汞溴红溶液滴加在外套膜小片表面充分浸润；S3.然后将免疫抑制剂溶液滴加在外套膜小片表面充分浸润；S4.将供体贝珠核浸润于免疫抑制剂溶液；S5.将外套膜小片和珠核植入受体贝插核部；S6.进行养殖育珠。该方法以大珠母贝、珠母贝、企鹅珍珠贝等为外套膜小片供体贝,以合浦珠母贝为插核受体贝,将星型孢菌素作为免疫抑制剂应用于海水珍珠养殖生产中,可以降低海水珍珠贝异种移植过程中产生的免疫排斥反应,促进珍珠囊的形成,培育高质量珍珠。(The invention provides a method for reducing seawater pearl oyster xenograft immune rejection, and belongs to the technical field of seawater pearl culture. The method comprises the following steps: s1, dissolving staurosporine in cell treatment fluid to obtain an immunosuppressant solution; s2, manufacturing small pieces of the mantle of the donor shellfish, and dropwise adding a mercurochrome solution on the surfaces of the small pieces of the mantle to fully soak the small pieces of the mantle; s3, then dropwise adding an immunosuppressant solution on the surfaces of the small pieces of the outer casing membrane for full infiltration; s4, infiltrating the nucleus of the donor shell pearl into an immunosuppressant solution; s5, implanting the mantle piece and the pearl nucleus into a receptor shell nucleus insertion part; s6, breeding and culturing the pearl. The method takes large nacre, penguin pearl shell and the like as mantle piece donor shells, takes Pinctada martensii shells as nucleus insertion receptor shells, and takes star spore as immunosuppressant to be applied to seawater pearl culture production, so that immunological rejection reaction generated in the process of seawater pearl shell xenotransplantation can be reduced, the formation of pearl sacs is promoted, and high-quality pearls are cultured.)
技术领域
本发明涉及海水珍珠养殖技术领域，具体涉及一种降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法。
背景技术
合浦珠母贝是我国海水珍珠养殖的主要母贝，其育苗、养殖和插核育珠技术十分成熟、操作容易，但所产珍珠层薄、颗粒较小，商品价值不高。大珠母贝、珠母贝和企鹅珍珠贝是养殖大型优质珍珠的重要母贝，所产珍珠质量好、珠层厚、光泽亮，以粒论价，经济价值极高，但它们的插核育珠技术难度大，有的甚至育苗和养成都很困难，至今未能实现规模化生产。
因此，如果能将大珠母贝、珠母贝、企鹅珍珠贝等的外套膜小片移植入合浦珠母贝体内进行借腹育珠，则可避其育珠难和养成难的问题，生产出高品质珍珠，从而大大提高合浦珠母贝的珍珠养殖效益。但这种种间移植育珠的免疫排斥非常严重，至今未能实现产业化生产。因此，降低珍珠贝插核过程中免疫排斥，是珍珠养殖产业中亟待解决的关键问题。申请号为CN201811164622.2的发明专利公开一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，通过将免疫抑制剂霉酚酸酯带入受体贝体内。申请号为CN201811164623.7的发明专利公开一种降低受体贝移植免疫排斥的方法，通过将免疫抑制剂环孢霉素A带入受体贝体内。均促进珍珠囊形成，从而提高珍珠产量。但是均属于同种育珠，排斥反应相对较小，要想将大珠母贝、珠母贝、企鹅珍珠贝等的外套膜小片插入合浦珠母贝体内进行借腹育珠，排斥反应更大，采用以上两种方法，并不能解决异种移植所面临的免疫排斥严重和存活率低的问题。
发明内容
本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法，将星型孢菌素作为免疫抑制剂应用于海水珍珠养殖生产中，可以降低海水珍珠贝异种移植过程中产生的免疫排斥反应，促进珍珠囊的形成，实现借腹育珠，培育高质量珍珠。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法，包括以下步骤：
S1.将星型孢菌素溶解于细胞处理液中，得到免疫抑制剂溶液。
S2.制作供体贝外套膜小片，将汞溴红溶液滴加在外套膜小片表面充分浸润。
S3.然后将免疫抑制剂溶液滴加在步骤S2得到的外套膜小片表面充分浸润。
S4.将供体贝珠核浸润于免疫抑制剂溶液。
S5.将步骤S3和S4得到的外套膜小片和珠核植入受体贝插核部。
S6.进行养殖育珠。
优选的，所述供体贝为大珠母贝、珠母贝或企鹅珍珠贝。
优选的，所述受体贝为合浦珠母贝。
优选的，所述免疫抑制剂溶液含有为体积比为0.35％～0.55％的星型孢菌素。
优选的，所述细胞处理液以每升磷酸盐缓冲液中溶解1％-2％聚乙烯吡咯烷酮，葡萄糖2～4g，蚌肉多糖5～8g，复合维生素20～45g，牛磺酸4～6g，酵母聚糖4～8g，姜黄素0.2～0.3g，头孢呋辛钠0.3g，制霉菌素0.002g，链霉素1g，庆大霉素80万单位，青霉素100万单位，诺氟沙星0.04g，甲硝唑0.15g。
优选的，所述磷酸盐缓冲液以每升双蒸水中溶解磷酸二氢钾1.08g，氯化钾1.08g，氯化钠25.22g，碳酸氢钠0.45g，磷酸氢二钠0.15g，调节pH至7.1，巴氏灭菌30min。
复合维生素为维生素A、维生素C、维生素E和其他几种维生素的复配物，其质量比为5:8:5:2。
优选的，所述汞溴红溶液为汞溴红粉末溶于过滤海水中，质量浓度为2％。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法，将免疫抑制剂星型孢菌素应用于海水珍珠贝异种移植育珠生产，利用其对受体贝的免疫抑制作用，降低海水珍珠贝植核初期的免疫排斥反应，促进受体贝免疫耐受的形成，降低受体贝吐核率和死亡率，促进珍珠囊形成，以提高珍珠质量及产量。
2.本发明的降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法，以大珠母贝、珠母贝、企鹅珍珠贝等为外套膜小片供体贝，以合浦珠母贝为插核受体贝，采用星型孢菌素作为抑制剂，可以实现借腹育珠。星型孢菌素(Staurosporine，STS)是从微生物代谢物中提取得到的吲哚[2，3-α]咔巴唑类生物碱。是一种强效的、ATP竞争性激酶抑制剂，能有效抑制蛋白激酶C(PKC-α、PKC-δ、PKC-ζ)的活性。除此之外，星型孢菌素还可抑制蛋白激酶A、蛋白激酶G和酪氨酸蛋白激酶和钙调蛋白激酶II等酶活性。
附图说明
：图1为星型孢菌素处理组和对照组合浦珠母贝植核后不同时间的血细胞免疫相关基因表达量比较；具体为蛋白激酶C-δ(protein kinase C delta type，PKC-δ)相对表达量(相同字母代表差异不显著，不同字母代表差异显著)；
图2为星型孢菌素处理组和对照组合浦珠母贝植核后不同时间的血细胞免疫相关基因表达量比较；具体为同种异体炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1，AIF-1)相对表达量(相同字母代表差异不显著，不同字母代表差异显著)；
图3为合浦珠母贝植核后48h免疫抑制剂处理组(左)和对照组(右)大珠母贝外套膜小片表面的血细胞对比图(黑色箭头代表小片表面的血细胞)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
时间：2019年10月22日插核，在插核后第1d、3d、6d、10d、15d、22d、30d统计受体贝死亡率和存活率
地点：海南省陵水县新村
一种降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法，以大珠母贝为供体贝，以合浦珠母贝为受体贝。包括以下步骤：
S1.将星型孢菌素溶解于细胞处理液中配成0.35％的免疫抑制剂溶液。
S2.制作大珠母贝外套膜小片，将汞溴红溶液滴加在大珠母贝外套膜小片表面充分浸润5分钟；用灭菌脱脂棉或灭菌吸水纸吸附外套膜小片多余汞溴红溶液；
S3.然后将免疫抑制剂溶液滴加在步骤S2得到的外套膜小片表面充分浸润；
S4.将供体贝珠核浸润于免疫抑制剂溶液；
S5.将步骤S3和S4得到的外套膜小片和珠核植入受体贝插核部；
S6.按常规方法进行养殖育珠。
细胞处理液以每升磷酸盐缓冲液中溶解1％聚乙烯吡咯烷酮(所述百分比为体积比)，葡萄糖2克，蚌肉多糖5克，复合维生素20克，牛磺酸4克，酵母聚糖4克，姜黄素0.2克，头孢呋辛钠0.3克，制霉菌素0.002克，链霉素1克，庆大霉素80万单位，青霉素100万单位，诺氟沙星0.04克，甲硝唑0.015克配置而成。
上述磷酸盐缓冲液以每升双蒸水中溶解磷酸二氢钾1.08克，氯化钾1.08克，氯化钠25.22克，碳酸氢钠0.45克，磷酸氢二钠0.15克，调节pH至7.1，巴氏灭菌30min。上述复合维生素为维生素A、维生素C、维生素E和其他几种维生素的复配物，其质量比为5:8:5:2。
试验设计：免疫抑制剂处理组和对照组(常规插核方式，不使用星型孢菌素，直接用细胞处理液代替免疫抑制剂溶液)分别插核300只，小片制作和插核均由同一组人员进行，在上述时间点分别收集血细胞和外套膜小片，并统计插核贝死亡率和存活率。血细胞用荧光定量PCR技术检测免疫相关基因PKC-δ和AIF-1在植核早期的相对表达量；外套膜小片于4％多聚甲醛溶液中固定，用于组织切片和HE染色技术观察小片表面的血细胞。
结果：如图1和图2所示合浦珠母贝植核24h后，星型孢菌素处理组的PKC-δ和AIF-1基因表达量与对照组相比显著降低；图3所示植核后48h免疫抑制剂处理组大珠母贝外套膜小片表面的血细胞与对照组相比明显较少；这说明免疫抑制剂处理后的受体贝小片和供体贝可显著降低植核过程中产生的免疫排斥反应。
如表1所示，与对照组相比，合浦珠母贝移植大珠母贝外套膜小片早期，免疫抑制剂星型孢菌素处理组的受体贝存活率明显较高。
表1各组育珠数据比对
实施例2
时间：2019年11月10日插核，每隔30天统计一次受体贝死亡率和存活率
地点：广西合浦县白龙村
一种降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法，以大珠母贝为供体贝，以合浦珠母贝为受体贝。包括以下步骤：
S1.将星型孢菌素溶解于细胞处理液中配成0.4％的免疫抑制剂溶液。
S2.制作大珠母贝外套膜小片，将汞溴红溶液滴加在大珠母贝外套膜小片表面充分浸润5分钟；用灭菌脱脂棉或灭菌吸水纸吸附外套膜小片多余汞溴红溶液；
S3.然后将免疫抑制剂溶液滴加在步骤S2得到的外套膜小片表面充分浸润；
S4.将供体贝珠核浸润于免疫抑制剂溶液；
S5.将步骤S3和S4得到的外套膜小片和珠核植入受体贝插核部；
S6.按常规方法进行养殖育珠。
上述细胞处理液以每升贝类磷酸盐缓冲液中溶解1.5％聚乙烯吡咯烷酮(所述百分比为体积比)，葡萄糖2克，蚌肉多糖5克，复合维生素35克，牛磺酸4克，酵母聚糖4克，姜黄素0.2克，头孢呋辛钠0.3克，制霉菌素0.002克，链霉素1克，庆大霉素80万单位，青霉素100万单位，诺氟沙星0.04克，甲硝唑0.015克配置而成；上述贝类专用磷酸盐缓冲液以每升双蒸水中溶解磷酸二氢钾1.08克，氯化钾1.08克，氯化钠25.22克，碳酸氢钠0.45克，磷酸氢二钠0.15克，调节pH至7.1，巴氏灭菌30min。上述复合维生素为维生素A、维生素C、维生素E和其他几种维生素的复配物，其比例为5:8:5:2，所述比例为质量比。
试验设计：免疫抑制剂处理组和对照组(常规插核方式)分别插核1000只，小片制作和插核均由同一组人员进行。育珠周期为期6个月，每个月统计一次死亡率和存活率。
结果：与对照组相比，免疫抑制剂组的受体贝存活率明显较高。
表2各组育珠数据比对
实施例3
时间：2019年11月11日插核，每隔30天统计一次受体贝死亡率和存活率
地点：广西合浦县白龙村
一种降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法，以珠母贝为供体贝，以合浦珠母贝为受体贝。包括以下步骤：
S1.将星型孢菌素溶解于细胞处理液中配成0.4％的免疫抑制剂溶液。
S2.制作大珠母贝外套膜小片，将汞溴红溶液滴加在大珠母贝外套膜小片表面充分浸润5分钟；用灭菌脱脂棉或灭菌吸水纸吸附外套膜小片多余汞溴红溶液；
S3.然后将免疫抑制剂溶液滴加在步骤S2得到的外套膜小片表面充分浸润；
S4.将供体贝珠核浸润于免疫抑制剂溶液；
S5.将步骤S3和S4得到的外套膜小片和珠核植入受体贝插核部；
S6.按常规方法进行养殖育珠。
上述细胞处理液以每升磷酸盐缓冲液中溶解2％聚乙烯吡咯烷酮(所述百分比为体积比)，葡萄糖4克，蚌肉多糖6克，复合维生素45克，牛磺酸5克，酵母聚糖6克，姜黄素0.3克，头孢呋辛钠0.3克，制霉菌素0.002克，链霉素1克，庆大霉素80万单位，青霉素100万单位，诺氟沙星0.04克，甲硝唑0.015克配置而成；上述磷酸盐缓冲液以每升双蒸水中溶解磷酸二氢钾1.08克，氯化钾1.08克，氯化钠25.22克，碳酸氢钠0.45克，磷酸氢二钠0.15克，调节pH至7.1，巴氏灭菌30min。上述复合维生素为维生素A、维生素C、维生素E和其他几种维生素的复配物，其比例为5:8:5:2，所述比例为质量比。
试验设计：免疫抑制剂组和对照组(常规插核方式)分别插核1000只，小片制作和插核均由同一组人员进行。育珠周期为期6个月，于每月统计育珠贝存活率。
结果：与对照组相比，免疫抑制剂组的受体贝存活率明显较高。
表3各组育珠贝存活率统计
实施例4
时间：2019年11月12日插核，每隔30天统计一次受体贝死亡率和存活率
地点：广西合浦县白龙村
一种降低海水珍珠贝异种移植免疫排斥的方法，以企鹅珍珠贝为供体贝，以合浦珠母贝为受体贝。包括以下步骤：
S1.将星型孢菌素溶解于细胞处理液中配成0.55％的免疫抑制剂溶液。
S2.制作大珠母贝外套膜小片，将汞溴红溶液滴加在大珠母贝外套膜小片表面充分浸润5分钟；用灭菌脱脂棉或灭菌吸水纸吸附外套膜小片多余汞溴红溶液；
S3.然后将免疫抑制剂溶液滴加在步骤S2得到的外套膜小片表面充分浸润；
S4.将供体贝珠核浸润于免疫抑制剂溶液；
S5.将步骤S3和S4得到的外套膜小片和珠核植入受体贝插核部；
S6.按常规方法进行养殖育珠。
上述细胞处理液以每升磷酸盐缓冲液中溶解2％聚乙烯吡咯烷酮(所述百分比为体积比)，葡萄糖4克，蚌肉多糖8克，复合维生素25克，牛磺酸6克，酵母聚糖8克，姜黄素0.3克，头孢呋辛钠0.3克，制霉菌素0.002克，链霉素1克，庆大霉素80万单位，青霉素100万单位，诺氟沙星0.04克，甲硝唑0.015克配置而成。
上述磷酸盐缓冲液以每升双蒸水中溶解磷酸二氢钾1.08克，氯化钾1.08克，氯化钠25.22克，碳酸氢钠0.45克，磷酸氢二钠0.15克，调节pH至7.1，巴氏灭菌30min。上述复合维生素为维生素A、维生素C、维生素E和其他几种维生素的复配物，其比例为5:8:5:2，所述比例为质量比。
试验设计：星型孢菌素组和对照组(常规插核方式)分别插核1000只，小片制作和插核均由同一组人员进行。育珠周期为期6个月，于每月统计育珠贝存活率。
结果：与对照组相比，免疫抑制剂组的受体贝存活率明显较高。
表4各组育珠贝存活率统计
通过以上实施例，可以得出结论，在合浦珠母贝的异种移植实验中，将免疫抑制剂对供体贝和受体贝进行处理，可显著降低植核初期的免疫排斥反应，促进受体贝免疫耐受的形成，降低受体贝吐核率和死亡率，从而提高珍珠质量及产量。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
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