一种用于修复损伤组织的细胞外囊泡生物光敏凝胶及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种用于修复损伤组织的细胞外囊泡生物光敏凝胶及其制备方法和应用 (Extracellular vesicle bio-photosensitive gel for repairing damaged tissues and preparation method and application thereof ) 是由 唐俊楠 张金盈 沈德良 崔小林 张增磊 徐彦彦 郭嘉城 刘刚琼 张力 路永政 秦 于 2021-07-14 设计创作，主要内容包括：一种用于修复损伤组织的细胞外囊泡生物光敏凝胶及其制备方法和应用。所述细胞外囊泡生物光敏凝胶包括细胞外囊泡、甲基丙烯酸酐化明胶和光引发剂。所述细胞外囊泡生物光敏凝胶的制备方法包括甲基丙烯酸酐化明胶的制备、细胞外囊泡的制备以及细胞外囊泡生物光敏凝胶的制备。所述细胞外囊泡生物光敏凝胶是通过喷洒和原位交联的方式来释放细胞外囊泡,以提高细胞外囊泡在损伤组织中的滞留率。将细胞外囊泡生物光敏凝胶喷洒到损伤组织表面,再用可见光照射30秒,可以实现作用效果增强的局部靶向治疗,这种策略将开启细胞外囊泡生物光敏凝胶在组织修复治疗的潜力。(An extracellular vesicle bio-photosensitive gel for repairing damaged tissues and a preparation method and application thereof. The extracellular vesicle biological photosensitive gel comprises extracellular vesicles, methacrylic acid anhydridized gelatin and a photoinitiator. The preparation method of the extracellular vesicle biological photosensitive gel comprises the steps of preparing methacrylic anhydridized gelatin, preparing extracellular vesicles and preparing the extracellular vesicle biological photosensitive gel. The extracellular vesicle bio-photosensitive gel releases extracellular vesicles in a spraying and in-situ crosslinking mode so as to improve the retention rate of the extracellular vesicles in damaged tissues. The extracellular vesicle biological photosensitive gel is sprayed on the surface of the damaged tissue and then irradiated by visible light for 30 seconds, so that local targeted therapy with enhanced effect can be realized, and the strategy can open the potential of the extracellular vesicle biological photosensitive gel in tissue repair therapy.)
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于修复损伤组织的细胞外囊泡生物光敏凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
心血管疾病是世界上主要的死亡原因。心肌梗死(MI,也称为心脏病发作)是心血管病最常见的类型之一，它会对心肌造成损害，从而导致心力衰竭(HF)并影响患者的寿命。干细胞治疗有其固有的局限性，如肿瘤致瘤风险、免疫不耐受、低保留和移植率，以及靶向给药等，并不能到达满意的临床结果。科学家发现，干细胞修复心脏的主要机制之一是旁分泌效应。细胞外囊泡作为干细胞的衍生物，其内含有RNA、蛋白等生物活性物质，在抑制梗死后心肌细胞凋亡、促进细胞增殖、促进血管生成等方面发挥着重要作用。事实上，在大量的体外研究和动物实验中，从不同细胞来源的细胞外囊泡已被报道具有保护心脏的作用，且显示出了良好的治疗效果。细胞外囊泡在心脏修复中的应用日益普及，但由于传递技术的缺陷，使细胞外囊泡不能充分发挥其效能。目前，心肌局部低保留率的问题是细胞外囊泡应用中所面临的最大的问题。虽然水凝胶或其他生物材料被用作载体，以实现局部给药，同时提高滞留率，但给药方法通常涉及心肌内多点注射。心肌注射面临必然开胸手术，操作难度大、易产生心肌损伤的难题。静脉注射等替代输送方法需要细胞外囊泡的表面修饰，增加了生产成本，且静脉注射的靶向效率尚不清楚。由于细胞外囊泡在全身循环，它们可能在非目标组织中积累，导致滞留在梗死组织中的细胞外囊泡数量不足。
发明内容
为此，本发明提供一种用于修复损伤组织的细胞外囊泡生物光敏凝胶及其制备方法和应用，采用无注射的方式提高细胞外囊泡在损伤心脏组织中的滞留率，以解决现有细胞外囊泡在心脏修复中不能充分发挥其作用的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明第一方面提供的一种用于修复损伤组织的细胞外囊泡生物光敏凝胶，所述细胞外囊泡生物光敏凝胶包括细胞外囊泡、甲基丙烯酸酐化明胶和光引发剂。
进一步的，所述细胞外囊泡是由啮齿类的骨髓间充质基质细胞中提取而成。
进一步的，所述光引发剂包括0.5mM的钌和5mM的过硫酸钠。
根据本发明第二方面提供的一种上述用于修复损伤组织的细胞外囊泡生物光敏凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
步骤一，甲基丙烯酸酐化明胶的制备
按体积比将明胶溶解到pH＝7.3的磷酸盐缓冲液中，充分搅匀后加热至50℃；完全溶解后，加入甲基丙烯酸酐，搅拌，50℃反应1小时；反应结束后，利用MilliQ水透析净化5天，每天更换一次，最终溶液即为纯化的甲基丙烯酸酐化明胶，将纯化的甲基丙烯酸酐化明胶，用0.22μm的过滤器进行过滤除菌，冻干，得纯化得甲基丙烯酸酐化明胶冻干粉；
步骤二，细胞外囊泡的制备
1)将鼠的骨髓间充质基质细胞培养在含有10％胎牛血清的基础培养基中培养，待细胞覆盖率达80％时用pH＝7.3磷酸盐缓冲液冲洗3次，换无胎牛血清培养基，培养箱中继续培养24h后，更换新的新鲜的无胎牛血清培养基继续培养48h；
2)收集培养基上清液，在3000g、4℃的条件下，用5810R离心机离心15min，取离心上清液于无菌容器内，以5:1的比例加入ExoQuick-TC混匀，在4℃冷藏12h，得ExoQuick-TC/上清液混合物；取所述ExoQuick-TC/上清液混合物于4℃下1500g离心30min，富集得到细胞外囊泡，用pH＝7.3的磷酸盐缓冲液重悬细胞外囊泡，得含有细胞外囊泡的磷酸盐缓冲液；
步骤三，细胞外囊泡生物光敏凝胶的制备
将100mg的纯化的甲基丙烯酸酐化明胶溶于1000μL超纯水中，用0.22μm的过滤器进行过滤，将过滤后的甲基丙烯酸酐化明胶与钌、过硫酸钠、含有细胞外囊泡的磷酸盐缓冲液以50:1:1:48的体积比例进行均匀混合，得细胞外囊泡生物光敏凝胶前体，在30mW cm-2的可见光激发形成细胞外囊泡生物光敏凝胶。
进一步的，所述步骤一中，所述按体积比是指明胶与磷酸盐缓冲液的体积比为1：10。
进一步的，所述步骤一中，所述加入甲基丙烯酸酐的量为每1g明胶中加入0.6g甲基丙烯酸酐。
进一步的，所述培养的培养条件均为5％CO2、37℃的培养箱。
进一步的，所述步骤二中，所述富集得到的细胞外囊泡中的蛋白总浓度为18mg/mL。
根据本发明第三方面提供的一种上述用于修复损伤组织的细胞外囊泡生物光敏凝胶的可用于制备修复损伤组织药物中的应用。
进一步的，所述细胞外囊泡生物光敏凝胶的使用方法是在30mW cm-2的可见光激发下将前体溶液喷在组织表面，交联30秒可形成铺在组织器官表面细胞外囊泡生物光敏凝胶，发挥作用。
本发明具有如下优点：
1)本发明通过喷洒和原位交联的方式来释放细胞外囊泡，以提高细胞外囊泡在损伤组织中的滞留率，同时避免了肌内注射带来的损伤。2)本发明在可见光照射30秒后,细胞外囊泡凝胶喷洒到心肌梗死区域表面，细胞外囊泡可以被物理捕获到甲基丙烯酸酐化明胶网络中，实现了浓度可控和作用时间增强的局部靶向给药，这种策略将可开启细胞外囊泡生物光敏凝胶在组织修复治疗的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为细胞外囊泡的特征分析，其中，A为本发明提供的无注射输送的细胞外囊泡的透射电镜下形态示意图；B为细胞外囊泡的原子力显微镜下形态示意图；C为细胞外囊泡的直径分布检测示意图；其中，比例尺为100nm。
图2为本发明提供的细胞外囊泡生物光敏凝胶的扫描电镜图；其中，比例尺为20μm。
图3为本发明提供的GelMA光敏凝胶核磁共振氢谱分析。
图4为GelMA光敏凝胶在3D打印心脏表面交联测试示意图。
图5为细胞外囊泡生物光敏凝胶(Gel-E)和GelMA光敏凝胶(Gel)的质量损失(％)和溶胀率(％)对比。
图6为在小鼠心脏表面进行细胞外囊泡生物光敏凝胶光照成胶的心脏图片。
图7为小鼠心脏表面喷照细胞外囊泡生物光敏凝胶48小时后的滞留荧光显示。A：细胞外囊泡生物光敏凝胶处理组；B：细胞外囊泡处理组。
图8为荧光显微镜下观察喷照细胞外囊泡生物光敏凝胶中细胞外囊泡进入心脏组织的展示。蓝色为细胞核染色DAPI，绿色为心肌组织染色α-SA，红色为细胞外囊泡染色PKH26，比例尺，50μm。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
AFM Key Sight 7500 USA
SEM JFOL JSM-7000F USA
胎牛血清(FBS) Biological industries Israel
最低基础培养基(MEM) gibco USA
5810R离心机离心 eppendorf Germany
ExoQuick-TC 1mL/2mL SBI US
BCA蛋白测定试剂盒 PC0020 Solarbio Beijing China
磷酸盐PBS缓冲液 Biological industries Israel
立体平版印刷 Formlabs form 2
PKH26试剂盒 (Sigma,P9691)
鼠骨髓间充质基质细胞来源于中国科学院细胞库
实施例1用于修复损伤组织的细胞外囊泡生物光敏凝胶的制备
(一)细胞外囊泡的制备和分析
将鼠的骨髓间充质基质细胞培养在含有10％胎牛血清的基础培养基中，在5％CO2，37℃培养箱中静置培养，待细胞覆盖率达80％时用磷酸盐PBS缓冲液冲洗3次，继续用无胎牛血清培养基，5％CO2，37℃培养箱中培养24h后，更换新的新鲜的无胎牛血清MEM孵育48h，收集培养基上清液。收集培养基上清液后，在3000g、4℃的条件下，用5810R离心机离心15min，清除细胞及细胞碎片,取离心上清液于无菌容器内，以5:1的比例加入ExoQuick-TC混匀，在4℃冷藏过夜(至少12小时)；取ExoQuick-TC/上清液混合物于4℃下1500×g离心30分钟，收集细胞外囊泡，用pH＝7.3的磷酸盐缓冲液重悬细胞外囊泡，得含有细胞外囊泡的磷酸盐缓冲液。
用透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)图像证实“杯状”的形态(如图1A所示)和细胞外囊泡的颗粒大小(如图1B所示)，纳米颗粒跟踪系统表明，80％以上的分离细胞外囊泡直径在110-140nm之间(如图1C所示)。
(二)甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)的制备和扫描电镜形态检测
将45g的明胶溶解到450mL的pH＝7.3的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)中，充分搅匀后加热至50℃。完全溶解后，加入甲基丙烯酸酐(每1g明胶中加入0.6g甲基丙烯酸酐)，搅拌，50℃反应1小时。反应结束后，放入3升的MilliQ水透析净化5天，每1天更换一次水以保证去除未反应完全的单体，最终溶液即为纯化的甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)。收集后的GelMA过滤除菌，然后冻干保存。
(三)GelMA光敏凝胶的制备
采用100mg的甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)用1000μL的超纯水溶解，0.22μm过滤器进行过滤，形成GelMA溶液；将GelMA溶液与钌(Ru)、过硫酸钠(SPS)、磷酸盐缓冲液(PBS溶液)以50:1:1:48的体积比例进行均匀混合，即可形成GelMA光敏凝胶前体(液态)，在30mWcm-2的可见光激发下30秒内可交联成网格状结构的GelMA光敏凝胶。如图2所示，扫描电镜SEM观察GelMA光敏凝胶的结构，此结构允许细胞外囊泡释放到损伤组织。
(四)细胞外囊泡生物光敏凝胶的制备
将100mg的GelMA用1000μL的超纯水溶解，0.22μm过滤器进行过滤，形成GelMA溶液；将细胞外囊泡重悬于PBS溶液中；将GelMA溶液与Ru、SPS、含细胞外囊泡的PBS溶液以50:1:1:48的体积比例进行均匀混合，即可形成细胞外囊泡生物光敏凝胶前体(液态)，在30mWcm-2的可见光激发形成细胞外囊泡生物光敏凝胶。
实验例1用于修复损伤组织的细胞外囊泡生物光敏凝胶中GelMA光敏凝胶的核磁共振氢谱分析
利用核磁共振氢谱对GelMA明胶和GelMA光敏凝胶进行了分析。如图3所示，GelMA光敏凝胶中δ＝2.9ppm的峰值与赖氨酸质子相关信号。在GelMA光敏凝胶中观察到δ＝5.33ppm和δ＝5.77ppm的峰值，表明存在共轭乙烯基。
实验例2GelMA光敏凝胶在3D打印心脏表面交联测试
用3D打印心脏模型(Formlabs,form 2)来评估在心脏曲面上喷涂GelMA光敏凝胶的可行性以及交联分析。如图4所示，在可见光激发下GelMA光敏凝胶在照射30秒内完全交联并存留在喷印区域。
实验例3细胞外囊泡生物光敏凝胶(Gel-E)和GelMA生物凝胶(Gel)的质量损失(％)和溶胀率对比(％)
细胞外囊泡生物光敏凝胶的制备：
进行质量损失和溶胀比检测，以确定细胞外囊泡对GelMA光敏凝胶前体的交联不产生影响。本发明通过质量损失和溶胀比检测发现，无论是否在GelMA光敏凝胶中加入细胞外囊泡，两组的质量损失和肿胀率差异都没有统计学意义(p＞0.05)。说明细胞外囊泡的存在对GelMA光敏凝胶的交联没有影响，如图5所示。
实验例4小鼠心脏表面进行细胞外囊泡生物光敏凝胶光照成胶展示
选用C57/BL6雄性小鼠，使用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(用量40mg/kg)，剃去腋下至剑突水平、前正中线至左腋后线之间的毛发，仰卧固定于37℃恒温水浴垫上。直视下行气管插管后接小动物呼吸机通气，潮气量0.5mL，吸呼比1:2，呼吸频率80次/分。调整小鼠体位至右侧45°卧位，消毒手术区域，沿左胸第4肋间隙水平依次剪开皮肤、胸大肌、前锯肌和肋间肌，置入小鼠专用胸廓撑开器暴露心脏，剥除心包膜。将细胞外囊泡生物光敏凝胶前体(液态)加入避光喷射容器中，喷出100μL的溶液同时给予30mW cm-2的可将光对准心脏照射。如图6所示，左侧为未喷照凝胶的心脏，右侧为已喷照凝胶的心脏，红色虚线圈内可见凝胶分布在心脏组织表面。
实验例5小鼠心脏表面喷照细胞外囊泡生物光敏凝胶48小时后的滞留荧光量分析
带荧光剂的细胞外囊泡生物光敏凝胶的构建：
采用PKH26进行细胞外囊泡染色：应用PKH26荧光试剂盒进行标记。具体方法如下：用100μL PKH26试剂盒中的溶液C稀释50μL的细胞外囊泡。另取100μL的溶液C溶解0.5μL的PKH26染剂。两组液体混合均匀，室温孵育5min。孵育完成后立即使用含5％的BSA的PBS溶液终止染色。而后使用ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒按体积比1:5加入终止染色的混合样本中，吹打混匀后4℃环境下静置过夜。将静置后混合物1500g离心30min后，弃上清再次1500g离心5min，弃去上清。用50μL PBS重悬沉淀，分装入避光离心管内，染色后的细胞外囊泡于-80℃保存备用。
100mg的GelMA用1000μL的超纯水溶解，0.22μm过滤器进行过滤，形成GelMA溶液；将PKH26染色的细胞外囊泡重悬于PBS溶液中；将GelMA溶液与Ru、SPS、含染色的细胞外囊泡的PBS溶液以50:1:1:48的体积比例进行均匀混合，即可形成染色的细胞外囊泡生物光敏凝胶前体(液态)。
选用C57/BL6雄性小鼠，使用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(用量40mg/kg)，剃去腋下至剑突水平、前正中线至左腋后线之间的毛发，仰卧固定于37℃恒温水浴垫上。直视下行气管插管后接小动物呼吸机通气，潮气量0.5mL，吸呼比1:2，呼吸频率80次/分。调整小鼠体位至右侧45°卧位，消毒手术区域，沿左胸第4肋间隙水平依次剪开皮肤、胸大肌、前锯肌和肋间肌，置入小鼠专用胸廓撑开器暴露心脏，剥除心包膜。将细胞外囊泡生物光敏凝胶前体(液态)加入避光喷射容器中，喷出100μL的溶液同时给予30mW cm-2的可将光对准心脏照射。同时给予100μL的细胞外囊泡作为对照组，也喷到小鼠心脏表面。取下撑开器，正压膨胀肺叶，用8-0无损伤缝线间断缝合逐层关闭肋间隙、胸壁肌肉及皮肤。术后小鼠被放回笼中，并一直监护至完全醒转。
在小动物荧光追踪系统下观察荧光量分布情况，如图7A所示，48小时后可见荧光分布于胸腔位置，说明仍然有细胞外囊泡生物光敏凝胶在心脏的残留。并且，荧光残留量比只用细胞外囊泡处理组(图7B)多。
实验例6荧光显微镜下观察喷照细胞外囊泡生物光敏凝胶中细胞外囊泡进入心脏组织的分析
与实验例5的步骤相同，在小鼠心脏上喷出细胞外囊泡生物光敏凝胶并成胶。24小时后，取出心脏组织进行切片染色，并荧光显微镜下观察。如图8所示，可见心肌组织(绿色荧光染色)中大量PKH26染色的细胞外囊泡(红色荧光)渗透，说明光敏凝胶可以支持细胞外囊泡进入心肌组织。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。