脂肪来源干细胞在局限性硬皮病中的用途
阅读说明：本技术 脂肪来源干细胞在局限性硬皮病中的用途 (Use of adipose derived stem cells in localized scleroderma ) 是由 龙笑 王晓军 陈洁 李竹君 崇煜明 张文超 王晨羽 俞楠泽 夏泽楠 黄久佐 于 2020-05-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了脂肪来源干细胞在制备辅助脂肪移植治疗局限性硬皮病的产品中的用途。发明人通过构建博来霉素硬皮病裸鼠模型,研究脂肪干细胞+脂肪移植可降低硬皮病组小鼠的TGF-β1含量及Ⅲ型胶原含量,减轻硬皮病的症状。(The invention discloses application of adipose-derived stem cells in preparation of a product for assisting adipose transplantation in treating limited scleroderma. The inventor researches that the content of TGF-beta 1 and the content of type III collagen of mice in a scleroderma group can be reduced by constructing a bleomycin scleroderma nude mouse model and performing adipose stem cell and adipose transplantation so as to relieve the symptoms of scleroderma.)
技术领域
本发明涉及技术领域，具体涉及脂肪来源干细胞在局限性硬皮病中的用途。
背景技术
硬皮病是以皮肤和组织器官纤维化、硬化为特征的胶原性疾病，局限性于皮肤者称局限性硬皮病(Lcalized scleroderma，LS)，又称硬斑病(Morphea)，弥漫性皮肤累积伴多内脏器官系统称系统性硬皮病(Systemic scleroderma,SSc)。硬皮病的早期治疗主要针对免疫、血管及胶原的异常，以抗炎、免疫抑制、免疫调节、改善血循环和减少纤维化为基础。后期遗留皮肤硬化、皮下脂肪萎缩、局部凹陷等畸形，常常需要整形科治疗。局部凹陷畸形的整形外科治疗目前包括带血管蒂的自体组织移植及不带血管蒂的自体脂肪移植。带血管蒂的组织移植手术创伤大,显微缝合风险高等，自体脂肪移植因手术创伤小，成为最受患者及整形科医师欢迎的治疗方案。
自体脂肪移植手术操作简单，手术创伤小，术后基本不遗留手术瘢痕，不增加额外供区损失，来源广，无排斥反应，可重复注射，且采用自体同类脂肪组织缺损填充，其形态质感与周围组织一致，因而成为目前治疗局限性硬皮病引起的面部凹陷畸形最常用的手术方法，尤其是轻中度的局限性硬皮病患者尤其适用。针对局限性硬皮病患者的脂肪移植，许多学者发表了自己治疗中的体会，对手术方式和手术效果进行了详细的描述，我们科也在长期应用脂肪移植治疗局限性硬皮病的中积累了一些经验：如在组织黏连紧密的颏区、刀劈状凹陷区以及红唇等活动区域，脂肪存活率较低，多需5-6次的注射移植才能获得较为满意的效果；对于组织黏连紧密区域，应采用小针刀贴近真皮深面充分松解黏连，以增加脂肪颗粒存活的空间，并利于脂肪的塑形；另将脂肪颗粒尽可能多点多层次注射于深层的组织内，随之在分离的腔隙内注射适量的脂肪颗粒，以减少再次黏连。这些手术方式使手术效果得到了一定了改善，但是脂肪存活率低、需要多次手术仍是目前临床最常碰到的问题。
影响脂肪注射移植存活率的相关因素众多，包括供区的选择、血供、受区活动度及黏连情况，以及脂肪颗粒的获取方式、抽吸技术、脂肪颗粒的纯化和患者的全身因素等。技术层面上，在抽取脂肪、清洗和移植中，凡有可能对脂肪颗粒造成破坏的物理、化学等因素均应避免。同时，为促进脂肪颗粒的存活，在移植中，我们应尽量使脂肪颗粒与组织有更大的接触面。因此，多层次、多隧道、多点移植已成为脂肪移植技术上的共识。但以往研究针对的大部分都是正常的脂肪标本，硬皮病患者研究比较少，局限性硬皮病患者的脂肪移植同正常人群的脂肪移植有所不同，即使遵循上述脂肪移植技术上的原则，硬皮病患者的脂肪存活率仍明显低于正常人群的脂肪移植，可能与局限性硬皮病病变区域组织萎缩粘连，局部血液供应差，局部炎性微环境等因素有关，同时局限性硬皮病患者自体供区脂肪有无生物学改变也需要验证。
有研究显示：脂肪干细胞(Adipose derived stem cells ADSCs)能够明显提高脂肪存活率，改善局部组织的血供，具有免疫调节作用，同时脂肪干细胞能显著降低TGF-β的表达、Collagen Ⅰ表达，抑制成纤维细胞增生，干细胞的这些特点刚好能弥补自体脂肪移植治疗局限性硬皮病患者面部凹陷畸形的不足。这些关于局限性硬皮病及ADSCs的相关研究，为我们应用脂肪移植治疗局限性硬皮病提供了新的思路。
发明内容
本发明的一方面提供脂肪来源的干细胞在制备治疗局限性硬皮病的细胞制剂中的用途。
为实现上述目的，本发明首先提供了脂肪来源干细胞在制备辅助脂肪移植治疗局限性硬皮病的细胞制剂中的用途。
优选的，所述产品为干细胞制剂。
优选的，所述脂肪来源干细胞免疫表型为CD34、CD45为阴性，CD29、CD44为阳性。
优选的，所述脂肪来源干细胞辅助脂肪移植不仅可提高脂肪存活率，同时还可减轻硬皮病患者的皮肤胶原沉积。
优选的，所述脂肪来源干细胞降低硬皮病患者的TGF-β1含量及Ⅲ型胶原含量。
进一步地，本发明提供了一种辅助脂肪移植治疗局限性硬皮病的干细胞制剂，所述干细胞制剂为脂肪来源干细胞制剂。
优选的，每单位所述的干细胞制剂包含1×105至1×106个脂肪来源干细胞。
优选的，所述的干细胞制剂为静脉注射剂。
更进一步地，本发明提供了所述的干细胞制剂在制备治疗局限性硬皮病的药物中的应用。
优选的，所述药物还包括其他治疗局限性硬皮病的药物。
有益效果
脂肪干细胞除了可提高脂肪存活率，还发现了脂肪干细胞辅助脂肪移植后硬皮病裸鼠的皮肤胶原含量明显降低。发明人通过构建博来霉素硬皮病裸鼠模型，研究脂肪干细胞+脂肪移植可降低硬皮病组小鼠的TGF-β1含量及Ⅲ型胶原含量，减轻硬皮病的症状。
附图说明
图1正常裸鼠与博来霉素硬皮博裸鼠大体观察及组织学切片，造模组皮肤皮肤增厚，变硬，胶原纤维增粗、增多、排列紊乱，显示造模成功；
图2无论正常裸鼠还是硬皮病裸鼠，CAL组存活率均较单纯的脂肪移植存活率高；
图3移植脂肪HE染色；
图4Masson染色显示正常裸鼠及硬皮病裸鼠脂肪移植或CAL后皮肤改变；
图5TGF-β1免疫指数：正常裸鼠经脂肪移植或脂肪干细胞+脂肪移植后无明显改变。但对于硬皮病小鼠，脂肪移植或者CAL可降低硬皮病组小鼠的TGF-β1含量，尤其是CAL效果更加明显；
图6III型胶原免疫指数：正常裸鼠经脂肪移植或脂肪干细胞+脂肪移植后无明显改变。但对于硬皮病小鼠，脂肪移植或者CAL可降低硬皮病组小鼠的III型胶原含量，尤其是CAL效果更加明显。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1脂肪来源干细胞的培养及扩增
脂肪组织取自北京协和医院整形外科，吸脂术后的废弃脂肪组织，取得患者知情同意。
1、脂肪干细胞提取
(1)将吸脂所得脂肪每20ml加入50ml的离心管中，加入D.hangks到40ml，800r离心3min；
(2)吸掉底部的液体，将脂肪转到新的离心管内，D.hangks洗2遍，800r离心3min；
(3)向管内加入胶原酶，体积为脂肪体积的1/3-1/4，37℃摇床，200rpm，30min；
(4)摇床取出后，100nm的滤网过滤(将Dhangks湿润滤网，有利于过滤)；
(5)滤过液1500r离心8min；
(6)离心后，吸掉上层油脂，剩下的D.hangks倒掉(轻轻倒)；
(7)用10ml的D.hangks将细胞吹起，加入倒一个新的离心管中；
(8)向其中加入D.hangks直至40ml，1500r离心8min；
(9)将离心液的上清倒掉，得到沉淀的细胞，此即富含脂肪干细胞的SVF；
(10)向细胞中加入培养基(含58％DMEM/F12+40％MCDB-201、2％胎牛血清(FCS)、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF、1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovineserum albumin，LA-BSA)，50μMβ巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素)，混匀，种到T75培养瓶中，放到37℃培养箱培养(每10ml脂肪种一瓶)，长满细胞约5×106个细胞。
2、细胞重悬
将前一天培养的细胞用移液枪吹打后，将培养基吸到另一个新的离心管中；1000r离心5min；离心好后，将上清液倒掉，按2个培养瓶重悬1个培养瓶细胞；原瓶用D.hangks洗1-2遍，向其中加入新鲜培养基；2个T75重悬1个，加原来2个，共得到3个T75。(脂肪干细胞贴壁生长，血细胞、内皮细胞等悬浮生长，换液重悬过程可洗去血细胞、内皮细胞，留下贴壁生长的脂肪干细胞)。
3、细胞传代
将T75内的旧培养基倒掉，用PBS清洗1-2遍，(注意不要将液体吹到细胞上)；取新的干净离心管配置0.25％的胰酶；将每个T75内加入5ml已配好的胰酶，消化1-2min；在显微镜下观察大部分细胞由贴壁的长条形变成悬浮的园形，加入血清终止消化；用移液枪吹打，加入离心管中；1000r离心5min；将沉淀细胞弹散，加入培养基，接种到T75中；一传二，原3个T75获得6个T75(此处为1代细胞)。
4、细胞冻存
将T75内旧的培养基倒掉，用D.hangks清洗1-2遍；加入配好的0.25％胰酶5mk消化，消化1-2分钟；在显微镜下观察大部分细胞由贴壁的长条形变成悬浮的园形，加入血清终止消化；用移液枪吹打，加入离心管中；1000r离心5min；将沉淀细胞弹散，加入冻存液(DMSO：血清＝1：9)，每1个T75对应一个冻存管，每管加入1ml冻存液；将其放入冻存盒，放-20℃2小时，再放入-80℃冰箱冻存。
5、流式细胞分析仪检测细胞周期
取接近融合的第3代ADSCs，70％冷乙醇40℃固定过夜；PBS液洗涤两次；加入的RNA酶(10μg/mL)37℃孵育30min；再加入50μg/mL碘化丙啶(PI)4℃避光孵育15min；用流式细胞仪检测细胞周期。
流式细胞仪检测ADSCs细胞内的DNA含量显示，大部分细胞处于静止期(GO/G1期：85.65％)，只有少部分处于分裂期(G2/M+S期：11.22％，其中G1/G2期：3.13％)。
6、流式细胞仪检测细胞表面标志
(1)取第3代ADSCs制成单细胞悬液，800r/min离心5min；(2)PBS洗2次；(3)调整细胞密度至106/ml，分装入试管中，每管0.1ml；(4)分别加入5μl结合有FITC标记的小鼠抗人CD34,CD45，CD29,CD44；(5)4℃避光孵育30min，空白对照组加入等量PBS；(6)孵育完毕后，PBS洗涤2次；(7)最后用lmLPBS重悬细胞；(8)流式细胞仪检测细胞表面标志。
结果显示，流式细胞仪检测第3代ADSCs的表面标志显示CD34(1.51％)、CD45(0.85％)，呈阴性表达；CD44+(99.1％)、CD29+(97.8％)，呈阳性表达。
实施例3脂肪干细胞辅助脂肪移植治疗硬皮病裸鼠模型
1、博莱霉素硬皮病裸鼠造模
用磷酸盐缓冲液(PBS)将博莱霉素粉剂稀释成200ug/ml，经0.22um的无菌滤膜过滤除菌后，保存备用。造模组将博莱霉素稀释液注射到裸鼠背部皮下，对照组将PBS液注射到裸鼠背部皮下，每日1次，每次0.1ml，共4周，观察背部皮肤弹性、外观等大体变化，4周时处死预实验造模组2只及对照组2只，取注射区背部皮肤置于组织固定液中固定，分别行HE染色和Masson染色，与PBS对照组小鼠比较，证实造模成功与否。
2、脂肪移植及脂肪干细胞辅助脂肪移植(Cell-assisted lipotransfer,CAL)操作
4周后，以2％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉，1ml注射器行脂肪及干细胞皮下注射。正常裸鼠及硬皮病造模裸鼠均分为三组：对照组，脂肪移植组，CAL组。对照组6例，给予0.3ml PBS皮下注射，脂肪移植组6例，给予0.3ml脂肪背部皮下注射，CAL组6例，给予0.3ml脂肪+1×106脂肪干细胞背部皮下注射。应用1ml螺旋推进注射器在受区均匀推注，采用退针时推注，防止推注中阻力的突然变化导致移植脂肪量的不准确，切勿粗暴高压注射。单点注射，使注射脂肪呈原团状，避免散在注射后与裸鼠自身脂肪组织混淆，便于术后测量。
术后1月取移植脂肪称重，切取裸鼠的注射部位皮肤，固定于甲醛液，石蜡包埋，制成组织切片，苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色观察。同时作免疫组织化学染色以测定皮肤中Ⅲ型胶原及转化生长因子TGF-β1的含量。
3、标本切片的取材
3.1标本固定
在固定液的选取上，通常使用中性10％福尔马林作为常规固定液。
3.2流水冲洗
经过福尔马林固定后，应充分用流动自来水冲洗，时间约为6～8小时。
3.3脱水
逐级从70％酒精—80％酒精—95％酒精—95％酒精—100％酒精，共历时10小时。
3.4透明
将材料放于二甲苯与无水乙醇比例为1：1的透明剂中，然后再放于二甲苯中。时间共计是2h左右即可。
3.5浸蜡
将透明后的材料放人溶解状态的普通石蜡中，使石蜡浸入组织中。
3.6包埋
先将熔化的石蜡注入包埋盒内，然后用镊子将组织块从60℃石蜡中取出立即放入包埋模具里，使切面朝下进行直立包埋，用镊子将组织固定在石蜡中央稍停片刻，使组织在蜡凝时立住，达到立埋的要求，待其慢慢冷却凝固。
3.7切片
切片时为保持蜡块硬度，可把蜡块放于冰柜中。切时取出，组织蜡块四周在切片前应修齐，大小适当。切片时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。切片的厚度以5um-10um为宜，倾斜角，一般以20°—30°为宜。
3.8贴片、烘片
将腊片正面朝上轻轻平铺在展片箱40～45℃的水面上，借水的张力和温度将略皱的蜡带自然展平。待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片上的余水。切片捞出后可待切片几乎完全干后再进行烤片。一般在烤片仪上烤片一小时或置入60～65℃恒温箱内，脱去切片中部分石蜡。
4、HE染色
苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
试剂配置
A：0.5～1％的伊红酒精溶液。称取伊红Y 0.5～1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95％酒精100毫升溶解。
B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比例减少)苏木精6g；无水乙醇100ml；硫酸铝钾150g；蒸馏水2000ml；碘酸钠1.2g；冰醋酸120ml；甘油900ml。
配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。
C：1％盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70％酒精中即可。
染色步骤：
(1)二甲苯(Ⅰ)15min；(2)二甲苯(Ⅱ)15min；(3)100％乙醇(Ⅰ)5min；(4)100％乙醇(Ⅱ)5min；(5)80％乙醇5min；(6)蒸馏水5min；(7)苏木精液染色5min；(8)流水稍洗去苏木精液1-3s；(9)1％盐酸乙醇1-3s；(10)稍水洗10-30s；(11)促蓝液返蓝10-30s；(12)流水冲洗10-15min；(13)蒸馏水过洗1-2s；(14)0.5％伊红液染色1-3min；(15)蒸馏水稍洗1-2s；(16)80％乙醇稍洗1-2s；(17)95％乙醇(Ⅰ)2-3s；(18)95％乙醇(Ⅱ)3-5s；(19)无水乙醇5-10min；(20)石炭酸二甲苯5-10min；(21)二甲苯(Ⅰ)2min；(22)二甲苯(Ⅱ)2min；(23)二甲苯(Ⅲ)2min；(24)中性树胶封固。
5、Masson染色
Masson染色将胶原纤维呈绿色，弹性纤维呈棕色至深棕色，肌纤维、纤维素红色，这种染色方法比HE染色法能更好的显示组织内肌肉、胶原及弹性纤维的分布，更形象的展现了组织结构特点。
试剂配制：
(1)苏木素染液(见HE染色法)；
(2)Masson复合染色液：丽春红(ponceau 2R)0.7g，酸性品红(acid fuchsin)0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸(glacial acetic acid)1ml；
(3)亮绿染色液：亮绿(light green)1g，冰醋酸(glacial acetic acid)1ml，蒸馏水99ml；
(4)1％磷钼酸水溶液：磷钼酸(phosphomolybdic acid)1g，蒸馏水加至100ml。
染色步骤：
(1)二甲苯(Ⅰ)15min；(2)二甲苯(Ⅱ)15min；(3)100％乙醇(Ⅰ)5min；(4)100％乙醇(Ⅱ)5min；(5)80％乙醇5min；(6)蒸馏水5min；(7)苏木素染液5～10min；(8)流水稍洗，1％盐酸分化；(9)流水冲洗数分钟；(10)Masson复合染色液5～10min；(11)蒸馏水稍冲洗；(12)1％磷钨酸液处理约5min；(13)不用水洗，直接用亮绿染色液(或苯胺蓝液)复染5min；(14)1％冰醋酸水处理1min；(15)80％乙醇稍洗1-2s；(16)95％乙醇(Ⅰ)2-3s；(17)95％乙醇(Ⅱ)3-5s；(18)无水乙醇5-10min；(19)石炭酸二甲苯5-10min；(20)二甲苯(Ⅰ)2min；(21)二甲苯(Ⅱ)2min；(22)二甲苯(Ⅲ)2min；(23)中性树胶封固。
6、TGF-β1及III型胶原免疫组化染色
(1)烤片：
选取组织完整的切片，70℃烤片机加热30min；
(2)脱蜡、水化：
二甲苯15min→二甲苯15min→无水乙醇3min→95％乙醇3min→85％乙醇3min→75％乙醇3min→纯水3min→3％H2O2，10min(用于阻断内源性过氧化物酶)→纯水2min；
(3)抗原修复：
加入足量抗原修复液(1×CB)加热，95℃，15min；
冷却至室温(20℃左右)；
(4)封闭：
滴加山羊血清覆盖组织→37℃温箱孵育30min；
(5)加I抗(按I抗说明书比例稀释抗体)
4℃过夜(12-16h)→恢复至室温；
(5)清洗：
1×PBS清洗三次，每次3min；
(6)加II抗：
滴加二抗试剂1→37℃孵育20min→1×PBS清洗三次，每次3min；
滴加二抗试剂2→37℃孵育20min→1×PBS清洗三次，每次3min；
(7)DAB(3-3二氨基苯联胺)显色：
稀释至1×DAB液滴加组织10s，显微镜下观察显色程度；
(8)蒸馏水冲洗：
冲洗三次，每次1min；
(9)复染：
苏木素复染5min→自来水冲洗；
(10)1％盐酸酒精溶液分化：
1％盐酸酒精溶液分化组织，10s；
(11)自来水浸泡反蓝，15min
(12)脱水+透明处理：
蒸馏水3min→75％乙醇3min→85％乙醇3min→95％乙醇3min→无水乙醇3min→二甲苯，8min→二甲苯，8min；
(13)中性树胶封片处理；
(14)镜检。
7、结果
7.1博莱霉素硬皮博裸鼠造模
太体上观察，每日博莱霉素皮下注射可诱导皮肤硬化，注射3天到1周出现急性皮肤反应及结痂，1月后注射部位皮肤出现皮肤增厚，变硬、弹性差，而PBS对照组小鼠背部皮肤未见明显以上变化。
组织学上(Masson染色)造模组显示真皮厚，胶原纤维增粗、增多、排列紊乱，真皮下层血管增粗或甚至血管闭塞，脂肪层变薄、消失，而正常真皮薄，胶原纤维排列整齐。III型胶原免疫组化指标，博莱霉素诱导的硬皮病模型裸鼠(2519.17±774.19)与正常裸鼠(623.85±113.84)相比显著升高(图1，表1)。
表1造模组与对照组III型胶原免疫指数
应用激光散斑对比成像技术(激光散斑对比成像系统，Perimed)测定正常裸鼠及硬皮博裸鼠血流，结果显示：正常裸鼠注射部位血流为251.72±43.82，硬皮病裸鼠注射部位血流为241.89±22.76，结果无显著性差异。
7.2脂肪移植与CAL的脂肪存活率比较
正常裸鼠脂肪移植组脂肪重量102.97±17.87mg，脂肪存活率为36.8％；CAL组脂肪重量135.05±27.28mg，脂肪存活率为48.2％；硬皮病裸鼠移植脂肪重量77.54±12.40mg，脂肪存活率为27.7％；CAL组脂肪重量102.48±23.16mg，脂肪存活率为36.6％。无论正常裸鼠还是硬皮病裸鼠，CAL组存活率均较单纯的脂肪移植组存活率高(表2，图2)。
表2脂肪移植及CAL脂肪存活率比较
HE染色结果显示，脂肪组织由A脂肪细胞，血管内皮细胞，成纤维细胞和结缔组织，以及巨噬细胞和淋巴细胞等构成。脂肪组织内充满体积大的脂肪细胞，并有稀少的结缔组织和丰富的毛细血管网。硬皮病组较正常组纤维化程度重，正常裸鼠CAL组脂肪细胞数量最多，境界清楚、轮廓清晰，脂肪细胞周围可见细小的纤维组织包绕，纤维化程度轻；而硬皮病脂肪移植组的脂肪细胞数量最少，多个脂肪细胞相互融合成空洞的大疱，周围纤维组织粗大，纤维化程度最重。纤维组织之间可见小的脂肪细胞，可能为新生的脂肪干细胞转化而来(图3)。
7.3脂肪移植或CAL后皮肤改变
Masson染色显示：正常裸鼠对照组、脂肪移植组、CAL组三者之间差异不明显，纤维化程度轻，胶原纤维呈蓝色，纤维组织排列整形。硬皮病造模裸鼠较正常裸鼠纤维化程度重，其中硬皮病造模裸鼠对照组真皮最厚，胶原纤维增粗、增多、排列紊乱，CAL组真皮明显较对照组明显变薄，胶原纤维含量减少，脂肪移植组介于两者之间(图4)。
对于正常裸鼠，免疫组化显示，TGF-β1含量对照组为939.34±216.92，脂肪移植组为974.98±470.18，CAL组为967.66±448.74，Ⅲ型胶原含量对照组为623.85±113.84，脂肪移植组为605.73±217.17，CAL组为599.34±89.39；对于硬皮病裸鼠，TGF-β1含量对照组为1945.95±330.77，脂肪移植组为1418.86±376.82，CAL组为1132.12±190.69，Ⅲ型胶原含量对照组2629.39±746.62，脂肪移植组为1531.74±836.41，CAL组为946.92±448.90。正常裸鼠经脂肪移植或脂肪干细胞+脂肪移植后TGF-β1含量及Ⅲ型胶原含量无明显改变(表3，图5，图6)。但对于硬皮病小鼠，脂肪移植或者CAL可降低硬皮病组小鼠的TGF-β1含量及Ⅲ型胶原含量，尤其是CAL效果更加明显。
表3正常裸鼠及硬皮病裸鼠TGF-β1含量及Ⅲ型胶原含量
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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