阅读说明：本技术 一种干细胞因子口服产品的制备方法 (Preparation method of stem cell factor oral product ) 是由 张正亮 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种干细胞因子口服产品的制备方法,涉及生物技术领域,包括以下步骤：获取原代牛脐带充质干细胞；对原代牛脐带充质干细胞进行传代培养；待P3-P5代牛脐带干细胞培养至细胞融合度达到80-90％时,采用促分泌培养液进行培养,培养48h后收集上清液,用0.1μm滤膜过滤,再超滤浓缩,获得浓缩液；所述促分泌培养液包括基础培养液和添加在基础培养液中的谷氨酰胺、去甲肾上腺素、转化生长因子、氨基葡萄糖、黄芪多糖；将浓缩液预冻,然后再经超低温冷冻干燥,得冻干粉。本发明能够有效提高脐带间充质干细胞的扩增,诱导干细胞因子的分泌,所得产品能够从细胞层面上调理身体,全面提高身体机能,改善亚健康,修复和强化免疫系统。(The invention discloses a preparation method of a stem cell factor oral product, which relates to the technical field of biology and comprises the following steps: obtaining primary bovine umbilical cord mesenchymal stem cells; carrying out subculture on the primary bovine umbilical cord mesenchymal stem cells; culturing P3-P5 generation bovine umbilical cord stem cells until the cell fusion degree reaches 80-90%, culturing with secretion promoting culture solution, collecting supernatant after culturing for 48h, filtering with 0.1 μm filter membrane, and ultrafiltering and concentrating to obtain concentrated solution; the secretion promoting culture solution comprises a basic culture solution and glutamine, norepinephrine, transforming growth factors, glucosamine and astragalus polysaccharide which are added in the basic culture solution; pre-freezing the concentrated solution, and freeze-drying at ultralow temperature to obtain the freeze-dried powder. The invention can effectively improve the amplification of umbilical cord mesenchymal stem cells, induce the secretion of stem cell factors, condition the body from the cell level, comprehensively improve the body function, improve the sub-health, and repair and strengthen the immune system.)

一种干细胞因子口服产品的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种干细胞因子口服产品的制备方法。

背景技术

脐带是哺乳动物和胎儿之间的连系结构，其形状如绳索，表面光滑透明，内含结缔组织、一支脐静脉和一对脐动脉。近年来，随着研究的不断发展，已经能够在脐带、脐血和胎盘中提取干细胞。

脐带间充质干细胞是指存在于脐带组织中的一种多功能干细胞，脐带间充质是一类低免疫原性细胞，具有多向分化潜能，有很强的免疫调节功能，且分离培养操作简便。脐带间充质干细胞一个重要的功能就是通过旁分泌形式分泌多种细胞因子和生长因子进行组织修复，如分泌神经细胞营养因子、血管新生因子、造血支持因子、免疫调节因子、抗凋亡因子和趋化因子等。

干细胞因子的药理药效明显可靠，但是体外培养间充质干细胞收集培养液或细胞裂解液，存在培养规模较小、诱导细胞因子分泌过程不够高效等问题。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种干细胞因子口服产品的制备方法，采用谷氨酰胺、去甲肾上腺素、转化生长因子、氨基葡萄糖、黄芪多糖与基础培养液复配得到的促分泌培养液，用于牛脐带间充质干细胞因子的培养，能够有效提高脐带间充质干细胞的扩增，诱导干细胞因子的分泌。

本发明提出的一种干细胞因子口服产品的制备方法，包括以下步骤：

S1、获取原代牛脐带充质干细胞；

S2、对原代牛脐带充质干细胞进行传代培养；

S3、待P3-P5代牛脐带干细胞培养至细胞融合度达到80-90％时，弃去上清液，使用PBS液清洗，然后采用促分泌培养液进行培养，培养48h后收集上清液，用0.1μm滤膜过滤，再超滤浓缩，获得浓缩液；

所述促分泌培养液包括基础培养液和添加在基础培养液中的谷氨酰胺、去甲肾上腺素、转化生长因子、氨基葡萄糖、黄芪多糖；

S4、将浓缩液预冻，然后再经超低温冷冻干燥，得冻干粉。

优选地，S3中，促分泌培养液中各组分的浓度为：谷氨酰胺3-6ng/mL、去甲肾上腺素5-10ng/mL、转化生长因子2-4ng/mL、氨基葡萄糖60-80ng/mL、黄芪多糖5-10ng/mL。

优选地，基础培养基为ɑ-MEM培养液或DMEM/F12培养液。

优选地，S3中，以T75培养瓶计，接种密度为1×10⁵-2×10⁵/mL。

优选地，S4中，还包括向冻干粉中加入药剂学上可接受的助剂，将其加工成口服药物剂型。

优选地，所述口服药物剂型包括胶囊、口服液、片剂。

有益效果：本发明提出了一种干细胞因子口服产品的制备方法，是采用谷氨酰胺、去甲肾上腺素、转化生长因子、氨基葡萄糖、黄芪多糖与基础培养液复配得到的促分泌培养液，用于牛脐带间充质干细胞因子的培养；其中，谷氨酰胺、去甲肾上腺素相配合，通过促进磷酸化，活化PI3K-Akt信号通路，进而再通过磷酸化作用激活mTOR信号通路，提高细胞内WISP1水平，从而提高细胞存活率和促进细胞增殖，并添加黄芪多糖相配合，其能够清除细胞内积累的过量氧自由基，增强细胞的抗氧化能力，降低细胞体外培养损伤，进一步提高细胞体外存活和增殖活性、促进干细胞因子的分泌；添加的氨基葡萄糖能够增加细胞对葡萄糖的吸收，改变多种信号传导途径的活性，与转化生长因子相配合，能够促进细胞的粘附培养，诱导细胞因子表达。

本发明能够有效提高脐带间充质干细胞的扩增，诱导干细胞因子的分泌，所得产品能够从细胞层面上调理身体，全面提高身体机能，改善亚健康，修复和强化免疫系统，增强人体免疫力，强化体魄。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

本发明提出的一种干细胞因子口服产品的制备方法，包括以下步骤：

S1、获取胎牛脐带，用PBS液清洗，去除动静脉，用剪刀将脐带切成直径约1-2mm的组织块，加入0.4％胶原酶Ⅱ消化2h，2000r/min离心10min，收集沉淀，向其中加入2％胰酶消化30min，终止消化，2000r/min离心15min，收集沉淀；采用PBS吹打成悬液，200μm滤网过滤，1800r/min离心7min，获取牛脐带细胞；

S2、将牛脐带细胞接种到T25培养瓶中，培养瓶用纤维连接蛋白包被，加入含10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的α-MEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3d更换新鲜培养液；待细胞融合80％以上时进行传代培养；

S3、待P3代牛脐带干细胞培养至细胞融合度达到80-90％时，弃去上清液，使用PBS液清洗，然后采用促分泌培养液进行培养，接种密度为1.5×10⁵/mL，诱导培养48h后收集上清液，采用0.1μm中空纤维微滤膜进行过滤，将透过液再经超滤膜(截留分子量5kD)进行浓缩，收集截留液；

所述促分泌培养液包括基础培养液DMEM/F12，和添加在基础培养液中终浓度为5ng/mL的谷氨酰胺、8ng/mL的去甲肾上腺素、3ng/mL的转化生长因子、70ng/mL的氨基葡萄糖、8ng/mL的黄芪多糖；

S4、将截留液预冻，然后再经超低温冷冻干燥，得冻干粉；

S5、向冻干粉中加入药剂学上可接受的助剂，加工成口服液。

实施例2

与实施例1相比，区别仅在于步骤S3不同；具体如下：

S3、待P3代牛脐带干细胞培养至细胞融合度达到80-90％时，弃去上清液，使用PBS液清洗，然后采用促分泌培养液进行培养，接种密度为1.5×10⁵/mL，诱导培养48h后收集上清液，采用0.1μm中空纤维微滤膜进行过滤，将透过液再经超滤膜(截留分子量5kD)进行浓缩，收集截留液；

所述促分泌培养液包括基础培养液ɑ-MEM，和添加在基础培养液中终浓度为3ng/mL的谷氨酰胺、10ng/mL的去甲肾上腺素、2ng/mL的转化生长因子、60ng/mL的氨基葡萄糖、10ng/mL的黄芪多糖。

实施例3

与实施例1相比，区别仅在于步骤S3不同；具体如下：

S3、待P3代牛脐带干细胞培养至细胞融合度达到80-90％时，弃去上清液，使用PBS液清洗，然后采用促分泌培养液进行培养，接种密度为1.5×10⁵/mL，诱导培养48h后收集上清液，采用0.1μm中空纤维微滤膜进行过滤，将透过液再经超滤膜(截留分子量5kD)进行浓缩，收集截留液；

所述促分泌培养液包括基础培养液DMEM/F12，和添加在基础培养液中终浓度为6ng/mL的谷氨酰胺、5ng/mL的去甲肾上腺素、4ng/mL的转化生长因子、80ng/mL的氨基葡萄糖、5ng/mL的黄芪多糖。

对比例

与实施例1相比，区别仅在于S3中采用基础培养液DMEM/F12替代促分泌培养液进行培养。

采用ELISA试剂盒，对本发明实施例1-3和对比例中的截留液中的成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β)进行检测，结果如表1所示。

表1实施例1-3和对比例中细胞因子测试数据(ng/mL)

	实施例1	实施例2	实施例3	对比例
					FGF	107.14	97.57	102.73	70.02
VEGF	60.53	54.32	56.28	37.41
					TGF-β	66.79	56.68	62.39	41.18

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。