具体实施方式

参照附图对本发明做进一步说明。

与第二代生物传感技术相似,氧气作为葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖的自然媒介体,不可避免地参与葡萄糖的催化氧化,成为葡萄糖监测的一个重要的干扰因素。虽然通过直接电化学对葡萄糖的催化氧化效率大大高于葡萄糖氧化酶通过其自然媒介体氧气的催化氧化效率,要从根本上消除氧气的影响，还必须在葡萄糖生物传感器上涂布一层能有效地消除氧气干扰的选择性滲透膜。另外，由于直接电化学对葡萄糖检测的高灵敏度,这个选择性滲透膜也必须能够有效地调控葡萄糖。更重要的是，这个选择性滲透膜必须有高度的生物相容性，否则就会严重地制约植入式持续葡萄糖监测系的使用寿命。这也是为什么虽然植入式持续葡萄糖监测系已经经过20多年的发展，大多数的植入式持续葡萄糖监测系统的使用寿命还不尽人意。也就是说，这个选择性滲透膜必须是双功能的-一方面，应该大大地提高葡萄糖生物传感器的生物相容性(寿命)，另一方面必须有效地调控氧气和葡萄糖。我们通过选择具有高度生物相容性的材料作为制备生物相容性膜(选择性滲透膜)的原料，并对它们进行优化组合，进而大大地提高葡萄糖生物传感器的生物相容性。通过调节选择性生物相容性膜的组分和各组分之间的比例，例如疏水和亲水组分的种类和配比，可以实现同时对氧气和葡萄糖的调控。另外,通过制备单一组分(无交联剂)的生物相容性膜,可以大大地改善生物相容性膜溶液的稳定性和使用寿命，从而使我们能够制备出具有高度一致性的植入式持续葡萄糖监测系统。

我们经过详细的研究和实验发现在基于第三代生物传感技术发展起来的含有电化学活化的葡萄糖氧化酶的生物传感器上覆盖上本发明研制的嵌段聚合物型生物材料-生物相容性膜，可以圆满地实现葡萄糖生物传感器的高度生物相容性，并同时实现对氧气和葡萄糖的精确地调控。这个生物相容性膜除了有高度的生物相容性之外，只需要能够有效地调控葡萄糖就满足要求了。我们经过详细的研究和实验发现在含有电化学活化的葡萄糖氧化酶的生物传感器上覆盖上本发明研制的嵌段聚合物型生物材料膜，如图1所示,这个嵌段聚合物是由疏水骨架、亲水基团(葡萄糖调节基团)和生物相容性基团等三个功能部分组成。

具体如下所述：

嵌段聚合物，包括如下组份：

疏水骨架化合物 10～200g

亲水基团有机化合物 2～40g

生物相容性基团有机化合物 2～50g

其中，疏水骨架化合物包括芳香烯烃类化合物或烯烃酸酯类化合物；亲水基团有机化合物包括溴代聚乙二醇或溴代聚环氧丙烷；生物相容性基团有机化合物包括甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、带有乙烯基或乙酰基的氨基酸、3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯、带有乙烯基或乙酰基的胆碱和乙烯吡咯烷酮中的一种或两种以上。芳香烯烃类化合物或烯烃酸酯类化合物包括丙烯酸酯、苯乙烯、乙烯吡啶、乙酸乙烯酯和丁烯酸酯中的一种或两种以上。

溴代聚乙二醇由以下方法制备：

1)将2～100重量份的聚乙二醇溶于5～500重量份的二氯甲烷和2～50重量份的三乙胺中，冰浴至零度，逐滴加入0.2～8重量份的二溴代异丁酰溴，30～50℃反应过夜，得到反应液；。

2)将反应液倒入100～2000重量份的冰乙醚中，得到沉淀物，用50～500重量份的冰乙醚洗涤沉淀物多次，60～80℃真空干燥22～26小时，得到溴代聚乙二醇；产率为80～90％。

具体实施例：溴代聚乙二醇由以下方法制备：

1)将50克聚乙二醇溶于250毫升二氯甲烷和25毫升的三乙胺中，冰浴至零度，逐滴加入4毫升的二溴代异丁酰溴，30～50℃反应过夜，得到反应液；。

2)将反应液倒入2升的冰乙醚中，得到沉淀物，用500毫升重量份的冰乙醚洗涤沉淀物多次，60～80℃真空干燥22～26小时，得到溴代聚乙二醇；产率为89％。

生物相容性功能的进一步优化和调节也可以通过直接加入亲水性好并具有高度生物相容性的高分子量的聚合物，即嵌段聚合物的组份还包括聚环氧乙烷、含有聚环氧乙烷的共聚物、聚环氧丙烷、含有聚环氧丙烷的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乳酸、透明质酸及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、纤维素及其衍生物、海藻酸及其衍生物。

疏水骨架的机械性能除了调节丙烯酸酯在共聚物中的含量，也可以在共聚物溶液中进一步加入机械性能优越的聚合物，如聚乙烯吡啶、苯乙烯和乙烯吡啶共聚物、苯乙烯和乙烯吡咯共聚物、苯乙烯和丙烯酰胺共聚物。

嵌段聚合物的制备方法，包括如下步骤：

1)将20克的溴代聚乙二醇、10克的甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱加入至250毫升的甲醇中，并经过氩气除氧20～60分钟；

2)加入10毫克的溴化亚铜和25毫克的2,2’-联吡啶，在氩气保护下进行室温反应2～4小时；

3)然后加入100毫升的丙烯酸酯，在氩气保护下进行室温反应6～24小时，得到嵌段聚合物

4)加入5升的水沉淀所述嵌段聚合物，并离心分离和50～100℃真空干燥12～24小时；

5)干燥后的嵌段聚合物加乙醇溶解，再加入5升的水沉淀，并再次离心和80℃真空干燥12～24小时，重复上述步骤3～6次；

6)最后将嵌段聚合物50～100℃真空干燥至少12小时。

如图2所示，在加入甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱以前，聚合反应体系里只有一个溴代聚乙二醇原子转移自由基聚合反应引发剂，其凝胶渗透色谱只有一个高分子色谱峰(如图2曲线1)。另一方面，当加入甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱并反应3小时后，凝胶渗透色谱清楚地显示一个高分子量的聚合物(如图2曲线2)，与此同时，溴代聚乙二醇高分子引发剂的峰几乎完全消失。当更进一步加入丙烯酸酯并反应12小时后，其凝胶渗透色谱图显示一个更高分子量的聚合物(如图2曲线3)。

生物相容性膜的涂布：将嵌段聚合物溶液(50-400毫克/毫升乙醇溶液)以滴落涂布法、旋转镀膜法、喷涂法或浸渍提拉法均匀地涂布在生物传感器上，然后在室温下干燥成膜，反复2到6次。例如我们将嵌段聚合物溶液以浸渍提拉法均匀地涂布在葡萄糖生物传感器上，然后将这些葡萄糖生物传感器在严格控制的环境中进行干燥成膜。待溶剂完全蒸发，这些葡萄糖生物传感器表面已经被一层薄薄的生物相容性膜完全地覆盖。为增加生物相容性膜的厚度，以上过程可以反复多次，通常3～4次就可以达到所需要的厚度。由于这个生物相容性膜是通过多次成膜过程而形成的，其最终的对葡萄糖的调控性能可以非常方便和有效地通过对膜的厚度(浸渍提拉次数)和嵌段聚合物溶液的配方进行优化，从而达到预期的效果。

作为优选，嵌段聚合物溶液中(即在制备嵌段聚合物溶液进行涂膜以前)还加入1～30％聚环氧乙烷、含有聚环氧乙烷的共聚物、聚环氧丙烷、含有聚环氧丙烷的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乳酸、透明质酸及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、纤维素及其衍生物、海藻酸及其衍生物中的一种或两种以上的溶液。

作为优选，嵌段聚合物溶液中(即在制备嵌段聚合物溶液进行涂膜以前)还加入1～25％聚乙烯吡啶、苯乙烯和乙烯吡啶共聚物、苯乙烯和乙烯吡咯共聚物、苯乙烯和丙烯酰胺共聚物中的一种或两种以上的溶液。

以上所有的生物相容性膜的配方都是基于合成好并经过提纯的聚合物,只要将它们溶解在合适的有机溶剂中，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、水、N,N-二甲基丙烯酰胺、二甲基亚砜、环丁砜、四氢呋喃、二氧六环等，配制好的溶液可以无限期地使用。

我们将嵌段聚合物溶液以浸渍提拉法均匀地涂布在含有电化学活化后的葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物传感器上，然后将这些葡萄糖生物传感器在严格控制的环境中进行干燥成膜。待溶剂完全蒸发，这些葡萄糖生物传感器表面已经被一层薄薄的生物相容性膜完全地覆盖。为增加生物相容性膜的厚度，以上过程可以反复多次，通常3-4次就可以达到所需要的厚度。由于这个生物相容性膜是通过多次成膜过程而形成的，其最终的对氧气和葡萄糖的调控性能可以非常方便和有效地通过对膜的厚度(浸渍提拉次数)和生物相容性膜溶液的配方进行优化，从而达到预期的效果。

我们首先利用循环伏安法对包括覆盖有生物相容性膜和含有电化学活化的葡萄糖氧化酶传感膜的生物传感器进行表征(如图3所示)。图3曲线1是只有含电化学活化的葡萄糖氧化酶传感膜的生物传感器在PBS缓冲溶液中的循环伏安图，其循环伏安图是一个典型的表面电化学现象(峰电位差仅为12毫伏，远远小于59毫伏)。当在这个PBS缓冲溶液中加入10毫摩尔/升的葡萄糖后,这个葡萄糖生物传感器循环伏安图清晰地展示了一个典型的电化学催化过程(如图3，曲线2)。以上实验结果表明电化学活化的葡萄糖氧化酶的成膜过程(包括化学反应)并没有对葡萄糖氧化酶的催化活性中心产生明显的影响，进一步的实验表明葡萄糖氧化酶不仅保持了其对葡萄糖的催化氧化性能，其通过直接电化学对葡萄糖的催化氧化效率比葡萄糖氧化酶通过氧气对葡萄糖的催化氧化效率还有显著的提高，这就为这类葡萄糖生物传感器在植入式持续葡萄糖监测系统中的应用铺平了道路。

当我们在这个葡萄糖生物传感器上通过浸渍提拉法均匀地覆盖一层生物相容性膜后，这个葡萄糖生物传感器的循环伏安图就发生了明显的变化。如图4所示，葡萄糖氧化酶传感膜的峰电位差从12毫伏显著地增加到160毫伏。显然，绝缘性的生物相容性膜给这个葡萄糖生物传感器的电子传递带来了非常大的阻力。幸运的是，虽然这个生物相容性膜大大地增加了电子传递的阻力，其通过直接电化学对葡萄糖的催化氧化的性能依然保持着，这就为发展植入式持续葡萄糖监测系统创造了条件。

另外，如图5所示，当葡萄糖生物传感器完全被生物相容性膜包裹时，随着膜的厚度(浸渍提拉次，当数)的增加，其通过直接电化学对葡萄糖的催化氧化电流呈指数型地急剧下降经过四个周期的浸渍提拉涂膜和干燥循环以后，葡萄糖生物传感器的电流减少到不到原来的1％。这一实验结果表明，我们的生物相容性膜可以非常有效地调控葡萄糖(反应在葡萄糖催化氧化电流上)。

虽然我们通过在葡萄糖生物传感器上覆盖上生物相容性膜成功地实现了对葡萄糖的确调控，要制备出准确性、重现性和稳定性好﹑可以用于植入式葡萄糖持续监测系统的葡萄糖生物传感器，我们还要保证这些传感器要有足够宽的线性响应范围和高度的稳定性，这些可以通过优化葡萄糖生物传感器上的生物相容性膜来实现。例如，当葡萄糖生物传感器在经过在生物相容性膜溶液中三个周期的浸渍提拉涂膜和干燥循环处理以后，和没有覆盖任何生物相容性膜的葡萄糖生物传感器相比，虽然其对葡萄糖的响应时间从1分钟被延长到了3分钟，其电流信号却被这层生物相容性膜很好地调控了，而且，葡萄糖生物传感器的稳定性也得到了显著的改善(如图6所示)。与此同时，葡萄糖的可监测范围从10毫摩尔/升被成功地拓展到了60毫摩尔/升(如图7所示)，完全满足了糖尿患者的葡萄糖监测需要。

虽然以上所有实验结果都证实我们的生物相容性膜在体外展示出优越的性能，其在活体监测时的性能才是对它的生物相容性的最有力的证明。因此，我们在体外工作的基础上，将覆盖有生物相容性膜的葡萄糖生物传感器应用于植入式持续葡萄糖监测系统，在连续30天的人体试验中，其中前23天结果良好，灵敏度(基线)没有明显的衰减(如图8所示)，这是迄今为止工作寿命最长的用于人体监测的葡萄糖生物传感器。从植入后的第24天开始，传感器灵敏度出现明显的衰减，其监测到的葡萄糖浓度与指血血糖检测的结果开始出现较大的差异。因此，为了保险起见，我们把这个生物相容性膜的工作寿命定为20天。

综上所述，在基于第三代生物传感技术发展起来的葡萄糖生物传感器上覆盖一层我们研制的生物相容性膜，就可以非常有效和精确地对葡萄糖进行调控，更重要的是，这个生物相容性膜的存在显著地拓展了葡萄糖的可监测范围，并大大地提高了葡萄糖生物传感器在人体中的稳定性和生物相容性，充分满足了免校正(工厂校正)植入式持续葡萄糖监测系统的要求，为免校正植入式持续葡萄糖监测系统的批量生产打下了坚实的基础。另外，这个生物相容性膜也可以应用到其它植入式持续监测系统，例如乳酸和血酮的监测。