一株产油小球藻zm-5及其应用
阅读说明：本技术 一株产油小球藻zm-5及其应用 (Oil-producing chlorella ZM-5 and application thereof ) 是由 赵昕悦 孟祥伟 白舜文 刘妍 陈俊彤 李春艳 李备 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：一株产油小球藻ZM-5及其应用,它涉及产油小球藻。它要解决现有藻种对养猪废水的净化效果不佳的问题。它已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为：CCTCC No:M20211015,保藏时间2021年8月10日,保藏地址为武汉市武汉大学,它为小球藻(Chlorella sorokiniana)ZM-5。本发明采用PRECI SCS单细胞分选仪对特定微藻进行单细胞分选,方法简单,实现单个藻类细胞的分离,不破坏细胞结构,保证后续单细胞的扩大培养及研究。小球藻ZM-5对养猪废水有着高效的COD、TN、TP净化能力,适合大规模推广使用,对废水的污染治理及资源化具有重大意义。小球藻ZM-5应用于净化养猪废水。(An oil-producing chlorella ZM-5 and application thereof, relating to oil-producing chlorella. It aims to solve the problem that the purification effect of the existing algae species on the pig raising wastewater is not good. It has been preserved in China center for type culture Collection with the preservation numbers: CCTCC No. M20211015, preservation time 2021, 8 months and 10 days, preservation address is Wuhan university in Wuhan City, which is Chlorella (Chlorella sorokiniana) ZM-5. The invention adopts the PRECI SCS single-cell sorter to carry out single-cell sorting on the specific microalgae, has simple method, realizes the separation of single algae cells, does not damage the cell structure, and ensures the subsequent expanded culture and research of the single cells. The chlorella ZM-5 has high-efficiency COD, TN and TP purification capacity on the pig raising wastewater, is suitable for large-scale popularization and use, and has great significance on the pollution treatment and reclamation of the wastewater. The chlorella ZM-5 is applied to purifying the pig-raising wastewater.)
技术领域
本发明属于环境微生物学领域，具体涉及一株产油小球藻ZM-5及其应用。
背景技术
微藻具有个体小、比表面积大等优势，使其能高效的从外界环境中获取营养物质。微藻不但可以吸收分解营养物质，还可以利用这些营养物质合成油脂、蛋白、碳水化合物等高经济价值的生物质。基于微藻如上的生理特征，人们可以在利用微藻治理养猪废水污染的同时，实现废水的资源化利用。由于微藻净化养猪废水的效率较依赖微藻本身的生长，所以，筛选出对于养猪废水具有高效净化效果的藻种，将在污水治理方面有重大的研究意义。
现如今，应用最广泛、最传统的细胞分选方式是平板分选方法。由于需要多次进行三区画线操作，使染菌风险大大提高。而且对于某些复杂环境样本，传统分选方法并不适用，局限性很大。例如，人工湿地中常因水体有机质含量高而广泛分布颤藻等藻株，利用传统分选方法从这样复杂的样本中分选出小球藻难度极大。此外，传统的细胞分选方法的分选结果具有极大的随机性，尤其是针对微藻种类丰富的样本，很难分选出目标微藻，所以，选择可替代性分选方式迫在眉睫。目前，有部分研究使用流式细胞荧光分选技术(FACS) 进行细胞的分离和筛选。其中，细胞或者细胞样颗粒物是FACS的检测分析对象，最终结果的准确性与样品的制备息息相关。然而在将组织解离为单细胞的过程中，FACS可能会对细胞结构产生破坏，使单细胞后续无法培养或培养难度增大。
发明内容
本发明目的是提供一株产油小球藻ZM-5及其应用，解决现有藻种对养猪废水的净化效果不佳的问题。
一株产油小球藻ZM-5，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCNo: M20211015，保藏时间为2021年8月10日，保藏地址为中国武汉武汉大学，它为小球藻(Chlorella sorokiniana)ZM-5。
上述一株产油小球藻ZM-5的应用：它应用于净化处理养猪废水。
本发明的小球藻ZM-5，其菌株的形态特征：呈现单细胞，规则球形，淡绿色，表面光滑。
本发明的小球藻ZM-5，其菌株的理化性质：它为产油脂微藻，其产物中油脂占比40.29％，多糖占比22.04％，蛋白质占比37.67％；小球藻ZM-5可高效降解养猪废水。
本发明的小球藻ZM-5，其菌株的分子生物学鉴定结果：18SrRNA序列GenBank注册号为MZ557824，与Chlorella sorokiniana序列相似度达到99.47％，亲源关系最近；小球藻ZM-5为一新种微藻。
本发明采用PRECI SCS单细胞分选仪对特定微藻进行单细胞分选，该单细胞分选方法简单，过程易于控制，实现单个藻类细胞的分离，不破坏细胞结构；PRECI SCS单细胞分选仪基于激光诱导向前转移技术(Laser-Induced Forward Transfer，LIFT)，具显微成像有可视化特点，可实现单个藻类细胞的分离，保证单细胞微藻纯度以及分选的准确性，防止杂菌污染；其原理是利用脉冲激光与透明玻片上的薄层材料相互作用，使其产生形变，进而将附着在薄层材料上的单个细胞推到下方的接收容器中，实现样品中单细胞的免标记、非接触性分离；由于激光与待分离细胞无直接相互作用，分选过程不会损伤藻类；同时分离过程不依赖于荧光等标记，避免外源标记对细胞活性的影响。因此，分选出来的藻可以真实反应原位状态下的活性与功能，保证后续单细胞的扩大培养及后续研究。
本发明从中国黑龙江省哈尔滨周边某养猪场附近人工湿地水体中快速的分选出产油小球藻ZM-5，它对养猪废水有着高效的COD、TN、TP净化能力，将其接种到养猪废水配水中，经检测小球藻ZM-5对于养猪废水COD、TN和TP的降解率分别为86.66％、88.75％和84.59％；可见采用本发明产油小球藻ZM-5单一藻种进行养猪废水的净化处理，即可达到良好的处理效果，降低环境污染，更节约成本，小球藻ZM-5是一株产油微藻，其积累的油脂通过提取和转染过程可以转化为一种清洁能源--生物柴油，具有较好的经济价值，适合大规模推广使用，对废水的污染治理及资源化具有重大意义。
本发明中产油小球藻ZM-5适用于净化养猪废水。
附图说明
图1为本发明中小球藻ZM-5的可视化成像(A部分)及单细胞分选(B部分)的示意图；
图2为本发明中小球藻ZM-5的平板形态特征图(A部分)及在100X光学显微镜的形态特征图(B部分)；
图3为本发明中小球藻ZM-5的系统发育树谱图；
图4为本发明中小球藻ZM-5的生长曲线图；
图5为本发明中小球藻ZM-5的理化性质分布图；
图6为本发明中小球藻ZM-5对养猪废水中COD、TN、TP的降解的柱状图，其中a 表示COD，b表示TP，c表示TN。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一株产油小球藻ZM-5，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC No:M20211015，保藏时间为2021年8月10日，保藏地址为中国武汉武汉大学，它为小球藻(Chlorella sorokiniana)ZM-5。
上述一株产油小球藻ZM-5，它的分选和培养过程如下：
一、使PRECI SCS单细胞分选仪达到无菌状态；取中国黑龙江省哈尔滨周边某养猪场附近人工湿地水体作为样品，摇匀后取5μl置于分选芯片上，采用PRECI SCS单细胞分选仪拍摄分选前样品的显微成像图，然后在显微成像中根据藻类形态定位目标微藻的单细胞并进行分选，收集微藻单细胞，并拍摄分选后显微成像图；
二、将上述收集的微藻单细胞转移到灭菌的含有3g/L葡萄糖的BG-11液体培养基的细胞培养管中，置于振荡培养箱中进行培养，获得混浊的淡绿色培养液，然后转移到灭菌的含有3g/L葡萄糖的BG-11液体培养基的无菌锥形瓶中，置于振荡培养箱中进行扩大培养，再将扩大培养成功的藻液转移至BG-11固体培养基中进行平板稀释涂布，筛选单藻落；
其中所述BG-11液体培养基组分：NaNO3 1.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.036g/L，C6H8O70.006g/L，C6H8FeNO7 0.006g/L，EDTA0.001g/L，Na2CO3 0.02g/L，H3BO3 0.00286g/L，MnCl2·H2O 0.00181g/L，ZnSO4·7H2O0.000222g/L， CuSO4·5H2O 0.000079g/L，Na2MoO4·2H2O 0.00039g/L，Co(NO3)2·6H2O0.000049g/L和余量的蒸馏水；
所述培养条件均为：每日光照24h，光照强度6000lux，培养温度为30±2℃，振荡速度为180r/min，每四天补充一次BG-11液体培养基。
本实施方式步骤一中所述采用PRECI SCS单细胞分选仪拍摄分选前样品的显微成像图和分选后显微成像图分别参见图1中A和B部分，此为微藻单细胞的可视化成像及单细胞分选。
本实施方式步骤二中筛选所得单藻落，挑取单藻落，并在光学显微镜下观察其微观形态：肉眼观察单藻落的形态特征，藻落呈绿色规则圆形，表面光滑；在100×光学显微镜下观察，藻落形态呈现单细胞，规则球形，淡绿色，初步鉴定为小球藻属(图2)。
本实施方式步骤二中筛选所得单藻落，三代纯化后挑取BG-11固体培养基中单藻落，采用18S rRNA测序技术进行藻种鉴定：
(1)使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取微藻DNA；
(2)采用聚合酶链反应(PCR)从微藻总DNA中扩增18S rRNA基因，采用18S rRNA 通用引物18SF(5’-CCTGGTTGATCCTGCCAG-3’)和18SR (5’-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3’)扩增目标藻样18S序列；PCR产物由北京六合华大基因科技有限公司(中国大连)进行测序(参见SEQID No：3)；利用BLAST程序将序列与NCBI数据库中可用的序列进行比较；
(3)PCR反应体系如下：模板DNA 1ng，15μL Taq酶混合液，1μL引物18SF，1μL 引物18SR，加入无菌去离子水至30μL；
PCR扩增条件：96℃预变性5min，96℃变性20S，56℃退火20S，72℃延伸20S，循环35次，72℃延伸10min。
采用18S rRNA通用引物18SF(5’-CCTGGTTGATCCTGCCAG-3’)和18SR (5’-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3’)扩增目标藻样18S序列，再利用高通量测序技术进行测序，进行分子鉴定；最后通过NCBI数据库比对，基于分子生物学手段判断目标藻样品的种属水平分类学信息。
鉴定结果显示(见图3)：18SrRNA序列GenBank注册号为MZ557824，与Chlorellasorokiniana序列相似度达到99.47％，亲源关系最近；命名为小球藻(Chlorellasorokiniana)ZM-5。
试验1：小球藻ZM-5的生长：将小球藻ZM-5接种于养猪废水配水中，每隔2h取样一次；使用分光光度计于波长为600nm测定吸光度，绘制生长曲线(见图4)，根据生长曲线显示，小球藻ZM-5在养猪废水(COD＝400mg/L)中的生命周期为40h，接种4h后进入对数生长期，持续22h；26h后进入稳定期，持续8h。
试验2：小球藻ZM-5的理化性质：
(1)油脂测定：用移液枪吸取20ml扩大培养成功的藻液于离心管中；在转速8000r/min下离心10min后弃掉上清液；用去离子水反复清洗3次后收集藻样；向藻样中加2ml氯仿、4ml甲醇，混合均匀后超声破碎10min(超声条件：功率400w、工作5s、间歇2s)；在转速为4500r/min下，离心10min，将上清液收集在新的10ml离心管中，2mL 1％的NaCl溶液，静置分层；针对剩余藻样反复进行上述操作，直至藻样颜色变白；称取空白试管重量记为m1，吸取静置后的下层液体于称重后的试管中，65℃水浴蒸干至恒重；称取蒸干后的试管重量记为m2；油脂含量为m2-m1。
(2)多糖测定：将微藻细胞冷冻干燥制成藻粉；称取0.1g藻粉，按照1:25加入4％的NaOH混合均匀；80w超声提取20min后冰浴10min，重复提取3次；在80℃的水浴锅中水浴2h，冷却后在4800r/min转速下离心10min，取上清液；用去离子水清洗2次，合并上清液；向上清液中加入三倍体积的无水乙醇，混匀后于4℃冰箱中静置过夜；冷冻离心后取沉淀，向沉淀中加入3％的TCA至沉淀不再溶解。经过0.45um过滤膜过滤后，再次加入三倍体积无水乙醇沉淀上清液；4℃离心后取沉淀，冷冻干燥后得到粗多糖粉末。用去离子水溶解粗多糖粉末；取1mL于试管中，加入4mL的蒽酮-硫酸溶液。混匀后沸水浴10min，冰浴后于620nm下测吸光值。
(3)蛋白质产量测定：将微藻细胞用1×PBS稀释，按照Bradford法蛋白质定量检测试剂盒(中国生工生物工程有限公司)说明书操作。
测定结果显示(见图5)，小球藻ZM-5产物中油脂占比40.29％，多糖占比22.04％，蛋白质占比37.67％；所以，小球藻ZM-5为产油脂微藻。
具体实施方式二：本实施方式一株产油小球藻ZM-5的应用：它应用于净化处理养猪废水。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是，所述应用的过程：将扩大培养成功的藻液经过8000r/min离心10min后弃上清液，并接种到养猪废水配水中，在400r/min，30℃条件下培养40h，即完成；所述小球藻ZM-5的接种量为0.01g/ml养猪废水配水；所述养猪废水中所含成分(g/L)：NaCl 0.0620464g/L，CaCl2·2H2O 0.234872g/L，MgSO4 0.151662g/L，NH4Cl 1.019244g/L，K2HPO4 0.05239g/L，NaNO3 0.16014g/L， C6H12O60.3768g/L；所述养猪废水的水质指标(mg/L)：COD 400mg/L；TN 9.315mg/L； TP293.147mg/L。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
试验3：小球藻ZM-5降解养猪废水：
扩大培养成功的藻液经过8000r/min离心10min后弃上清液，并接种到养猪废水配水中(接种量为0.01g/ml养猪废水配水)，每隔4h取样品一次。分别采用重铬酸钾-硫酸法测定养猪废水COD含量；采用钼锑抗分光光度法测定养猪废水TP含量；采用碱性过硫酸钾法测定养猪废水TN含量。
测定结果显示(见图6)：通过计算得到小球藻ZM-5对于养猪废水COD、TN和TP 的降解率分别为86.66％、88.75％和84.59％。
序 列 表
<110> 东北农业大学，哈尔滨工业大学，长春长光辰英生物科学仪器有限公司
<120> 一株产油小球藻ZM-5及其应用
<160> 3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<223>人工序列
<220>
<223> 引物18SF的核苷酸序列
<400> 1
cctggttgat cctgccag 18
<210> 2
<211>20
<212> DNA
<223>人工序列
<220>
<223> 引物18SR的核苷酸序列
<400> 2
ttgatccttc tgcaggttca 20
<210> 3
<211> 1712
<212> 18S rRNA
<223> 小球藻Chlorella sorokiniana
<400> 3
attagccatg catgtctaag tataaactgc tttatactgt gaaactgcga atggctcatt 60
aaatcagtta tagtttattt gatggtacct actactcgga tacccgtagt aaatctagag 120
ctaatacgtg cgtaaatccc gacttctgga agggacgtat ttattagata aaaggccgac 180
cgggctctgc ccgactcgcg gtgaatcatg ataacttcac gaatcgcatg gccttgtgcc 240
ggcgatgttt cattcaaatt tctgccctat caactttcga tggtaggata gaggcctacc 300
atggtggtaa cgggtgacgg aggattaggg ttcgattccg gagagggagc ctgagaaacg 360
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agtgacaata aataacaata ctgggccttt tcaggtctgg taattggaat gagtacaatc 480
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tggggcctgc cggtccgccg tttcggtgtg cactggcagg gcccaccttg ttgccgggga 660
cgggctcctg ggcttaattg tccgggactc ggagtcggcg ctgttacttt gagtaaatta 720
gagtgttcaa gcaggcctac gctctgaata cattagcatg gaataacacg ataggactct 780
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cgtatttcat tgtcagaggt gaaattcttg gatttatgaa agacgaacta ctgcgaaagc 900
atttgccaag gatgttttca ttaatcaaga acgaaagttg ggggctcgaa gacgattaga 960
taccgtccta gtctcaacca taaacgatgc cgactaggga tcggcggatg tttcttcgat 1020
gactccgccg gcaccttatg agaaatcaaa gtttttgggt tccgggggga gtatggtcgc 1080
aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggcgtggagc ctgcggctta 1140
atttgactca acacgggaaa acttaccagg tccagacata gtgaggattg acagattgag 1200
agctctttct tgattctatg ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt gggttgcctt 1260
gtcaggttga ttccggtaac gaacgagacc tcagcctgct aaatagtcac ggttggttct 1320
ccagccggcg gacttcttag agggactatt ggcgactagc caatggaagc atgaggcaat 1380
aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc gcgctacact gatgcattca 1440
acgagcctag ccttgaccga gaggtccggg taatctttga aactgcatcg tgatggggat 1500
agattattgc aattattaat cttcaacgag gaatgcctag taagcgcaat tcatcagatt 1560
gcgttgatta cgtccctgcc ctttgtacac accgcccgtc gctcctaccg attgggtgtg 1620
ctggtgaagt gttcggattg gcgaccgggg gcggtctccg ctctcggccg ccgagaagtt 1680
cattaaaccc tcccacctag aggaagagaa gt 1712
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