一种适合工业化生产应用的雨生红球藻藻种选育方法
阅读说明：本技术 一种适合工业化生产应用的雨生红球藻藻种选育方法 (Haematococcus pluvialis strain breeding method suitable for industrial production and application ) 是由 翁冬青 陈显锐 于 2021-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种适合工业化生产应用的雨生红球藻藻种选育方法,包括以下步骤：包括以下步骤：原始藻种选择→原始藻种纯化→藻种扩培→建立藻种系列→藻种初筛→藻种复筛→藻种库建立与保种→藻种生产应用试验→优良藻种的确定。本发明提供的方法筛选得到的原始藻种用于工业化大规模的雨生红球藻的养殖,育种周期短,用于生产虾青素的效率高；此外所得藻种不易退化,老化,遗传稳定,在生长周期内均保持很好的活力,色素体饱满,死亡率低,且利用生产条件进行定向选育,成功率高、所获得藻种可直接应用于生产,避免了普通藻种由于适应性所带来的大生产风险,所获得藻种遗传稳定、产物安全,提高对生产过程的控制。(The invention discloses a haematococcus pluvialis strain breeding method suitable for industrial production and application, which comprises the following steps: the method comprises the following steps: selecting original algae seeds → purifying original algae seeds → expanding culture of algae seeds → establishing algae seed series → primary screening of algae seeds → secondary screening of algae seeds → establishment and conservation of algae seed → production and application test of algae seeds → determination of excellent algae seeds. The original algae seeds obtained by screening by the method provided by the invention are used for industrial large-scale culture of haematococcus pluvialis, the breeding period is short, and the efficiency for producing astaxanthin is high; in addition, the obtained algae seeds are not easy to degenerate, age and stable in heredity, keep good activity in a growth period, are full in chromoplast and low in mortality, and are directionally bred by using production conditions, so that the success rate is high, the obtained algae seeds can be directly applied to production, the large production risk caused by adaptability of common algae seeds is avoided, the obtained algae seeds are stable in heredity and safe in product, and the control on the production process is improved.)
技术领域
本发明涉及微藻生物养殖技术领域，尤其涉及一种适合工业化生产应用的雨生红球藻藻种选育方法。
背景技术
微藻作为地球上的初级生产力，自身能够合成多种特殊生物活性物质，如脂肪酸、糖类、色素、毒素等，其中很多物质是其它生物所不能合成而仅通过食物链最终从微藻中获得的。通过对微藻进行大规模培养，从中获得有价值的次级代谢产物一直以来都是藻类研发的重点。
雨生红球藻属于绿藻门单细胞淡水微藻，能够在逆境胁迫下大量积累虾青素，细胞由绿色变为红色，简称绿色细胞阶段和红色细胞阶段，人工给予胁迫促进细胞转红的过程简称催红。变为红色的雨生红球藻细胞内富集了大量的虾青素，虾青素是细胞内类胡萝卜素合成的最高级别产物，具有最强的抗氧化活性，是目前发现的最强天然抗氧化剂，可广泛应用于食品、保健品、饲料、化妆品等，是一种新兴的藻类来源的活性物质。
在对微藻进行研究、开发应用的过程中，藻种是开展所有工作的基础，决定了后续工作的成败和效率。纯净、优良的藻种不仅能保证结果的稳定性、可靠性和可重复性，还能够从根本上保障有价值的正向结果的获得。通常微藻的选育种方法包括选择育种、诱变育种、基因工程育种和少量细胞融合育种。其中，选择育种是所有育种方法的基础，虽然育种周期较长，但简单易行、不改变藻种的原始性状，安全性高，避免了不确定、不可控的因素和风险。目前在雨生红球藻的育种上，基本上采用的都是选择育种，但是现有技术中一般的雨生红球藻藻种选育方法中存在育种周期长，用于生产虾青素的效率低，所得藻种易退化，老化，遗传不稳定，死亡率高，不能工业化生产等缺陷，为此，我们提出了一种适合工业化生产应用的雨生红球藻藻种选育方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合工业化生产应用的雨生红球藻藻种选育方法，解决了上述问题。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种适合工业化生产应用的雨生红球藻藻种选育方法，包括以下步骤：原始藻种选择→原始藻种纯化→藻种扩培→建立藻种系列→藻种初筛→藻种复筛→藻种库建立与保种→藻种生产应用试验→优良藻种的确定，其中：
S1、原始藻种的选择：通过野外采集、交流或购买、在生产应用实践中保留下来的表现突出的样本作为选育种的原始藻种；
S2、原始藻种的纯化：根据藻种的污染程度对原始藻种进行纯化；
S3、藻种扩培：在独立育种室的光照培养架上进行细胞培养，培养基采用无菌BBM培养基；
S4、建立藻种系列：将S2中纯化后得到的藻种进行扩培，达到一定体积和细胞密度后，建立可用于在特定生产条件下开展选育种工作的系列；
S5、藻种初筛：对经过扩培的不同系列的藻种，利用缺氮的虾青素诱导条件进行初步筛选；
S6、藻种复筛：在工业化生产条件下对藻种进行定向筛选；
S7、种质库建立与保种：对经过模拟实验筛选到的优良藻种进行保种和建库；
S8、藻种生产应用试验：对S7中的种质库的藻种进行试验，检测虾青素含量和干重指标；
S9、优良藻种的确定：确定适用于工业生产的雨生红球藻藻种。
优选的，S1中野外采集时选取原生态环境可实现人工生产的、藻种在原生境已经形成优势生长的样本进行采集；交流、购买时选择具备以下特点的藻种作为选育种的出发藻种，包括：细胞生长快速、分裂旺盛、活力强、色素体饱满、细胞个体普遍较大、抗逆性强、在有其它生物的情况下可形成优势生长。
优选的，S2中对于较为纯净的原种，不需要专门进行纯化，只需通过逐量更换新鲜无菌的BBM培养基进行复壮即可；对一般程度污染的藻种，包括有微生物、原生动物污染但无其它藻类或其它生物污染，采用离心清洗和固体平板分离的纯化方法；对于污染程度较重，样本中存在杂质和多种生物的样本，采用过滤稀释等前处理后，以毛细管显微操作的方法获得纯藻细胞；对于一般污染程度的原种采用固体平板分离的纯化方法，具体步骤如下：
a对原始藻种进行低速离心，离心转速不超过5000rpm，时长3.0min，去除上清液，保留底部沉淀，向离心管中加入新鲜无菌培养液或缓冲液，重悬分散藻泥进行清洗后再次离心，收集沉淀，清洗操作次数可视原种污染情况2-3次不等，最终获得藻泥用无菌培养液重悬，镜检并粗略计数；
b对步骤a得到的藻液进行稀释，使最终细胞密度约500-1000cells/ml，备用；
c向常规BBM液体培养基中按1.5％比例加入琼脂粉，灭菌后待培养基冷却时加入抗生素，抗生素由制霉菌素和氯霉素组成，浓度为80ppm，混合均匀，立刻倒平板；
d取步骤b的细胞稀释液100μL接入平板，用涂布棒轻轻涂布均匀，倒转培养皿，放入恒温光照箱进行培养；
e平板培养至长出肉眼可辩的藻落时，利用接种环挑取单藻落接入试管继续培养，逐步扩增，藻落视情况可于固体培养基中二次划线接种分离；对于污染较为严重的原种，采用毛细管显微操作的方法进行纯化，具体步骤如下：
a对原始藻种进行过滤去除杂质和部分污染物，过滤采用筛绢或滤膜，藻液低速离心(5000rpm，3.0min)后保留底部沉淀，向离心管中加入新鲜无菌培养液或缓冲液，均匀分散藻泥进行清洗后再次离心，收集沉淀，清洗次数视原种污染情况3-5次不等，最终获得藻泥用无菌培养液重悬，镜检并粗略计数；
b对步骤a得到的藻液进行稀释，使最终细胞密度约300-500cells/ml，备用；
c利用酒精喷灯高温拉制毛细玻璃管，毛细管孔径约为40-100um；
d将步骤b的稀释藻液以微滴形式滴到事先灭菌的载玻片上，微滴大小以视野能全部覆盖为准，迅速进行镜检，确定目标细胞，目标细胞应健康、色素饱满，个体较大；
e利用c拉制的玻璃毛细管在显微镜下吸取目标细胞，并转移入装有灭菌培养基的24孔细胞培养板中，重复操作，挑取多个细胞放入培养板中，每孔放入一个；
f将细胞板置于暗光下培养，期间补充培养基挥发，至肉眼可见颜色时，转移到试管中进行培养并由小体积开始逐步培养扩增获得纯化后藻种。
优选的，S3中加入培养基后每L藻液中含有以下浓度的营养盐：硝酸钠1.5-2.0×10-3g、磷酸氢二钾7.5-10.0×10-3g、磷酸二氢钾1.75-2.25×10-2g、氯化钠2.5-3.5×10-2g、硫酸镁3.7-4.7×10-2g、氯化钙1.9-2.5×10-2g、硼酸1.10-1.50×10-2g、硫酸锌8.70-9.50×10-3g、氯化锰1.40-1.60×10-3g、钼酸钠1.2-1.4×10-3g、硫酸铜1.50-1.80×10-3g、硝酸钴4.9-5.3×10-4g、乙二胺四乙酸二钠5.0-6.0×10-2g、氢氧化钾3.0-5.0×10-2g、硫酸铁4.9-5.5×10-3g，光源为LED白光灯管，光照强度根据细胞密度的高低而调节，光周期L:D＝12:12，pH值控制为7.0～7.5，温度控制24～26℃，5L培养体积以下为摇瓶培养，5L以上体积为通气培养，通入气体为经过除菌过滤的压缩空气和二氧化碳的混合气体。
优选的，S4的具体操作为：对经过复制的来源纯净的原始藻种，扩培达到1L体量、细胞密度达到25x104cells/ml时，用新鲜培养基将藻液稀释50倍至细胞密度为5x103cells/ml时，将藻液分装入多个三角瓶中继续培养，扩增至2.5L体积、藻密度15x104cells/ml左右时，作为筛选用藻种系列备用，对上述系列进行编号并建立档案。
优选的，S5的具体操作方法为：将各系列扩培后的2.5L藻液经过沉降、过滤、清洗，去除原培养基干扰后，用缺氮培养基重悬细胞，并分装到3个1L三角瓶中，每瓶750ml，每个藻种做3个平行；所有三角瓶放入培养架上，保持条件一致，所述条件为：培养基采用缺氮培养基，即在常规BBM培养基中剔除硝酸盐成份，光源为可发出以下特定光谱的雨生红球藻催红专用LED灯管，特定光谱包括波长为370-420nm的第一LED发光芯片、波长为400-495nm的第二LED发光芯片、波长为615-700nm的第三LED发光芯片，第一LED发光芯片、第二LED发光芯片、第三LED发光芯片的能量比为0～1：32～50：66～70，灯管安装在培养架上下，光照强度15000Lux，光周期L:D＝16:8，PH值控制为8.5～9.0，温度控制27～29℃，通过初筛得出虾青素积累快、同样时间内虾青素积累量高、细胞干重高、细胞死亡率低、培养体系干净的藻种系列。
优选的，S6中由于工业设备体积庞大，不适合用于藻种筛选实验，因此首先需建立模拟生产条件，S6的具体操作方法为：根据工业生产所采用的内置光源的垂直式光生物反应器的形状、配件和相关设备等，制作小型模拟光生物反应器，提供与生产所采用的雨生红球藻催红诱导条件最大程度一致的实验条件，模拟光生物反应器具有以下特点：容量由工业设备的1000L缩小为15L，材质由不锈钢改为亚克力管，根据生产用光源光径，模拟反应器内置1根雨生红球藻专用催红LED灯管，此外，模拟反应器的通气系统、温度、PH等的监测调控系统同工业设备，多个模拟反应器统一安装和固定在支架上，各容器包有反光膜进行光的隔绝，保证各容器条件一致。
优选的，S7中采用的藻液为实验藻或实验前的对应藻液，S7具体操作方法为：对藻种编号并登记在册，注明该藻种的原始来源、初筛结果、生产性模拟实验结果以及藻种的其它相关性状，藻种保存分为三级，一级保种采用固体形式，包括固体平板和斜面，二级保种采用液体小体积保种，包括试管和150ml以下小三角瓶，三级保种为250-500ml三角瓶，其中，一级保种封口后存放于冰箱-20℃，二级保种存放于冰箱4℃，三级保种置于光照培养箱中或培养架上，藻种看护周期为：一级种6个月，二级种3个月，三级种45天诱导剂的含量为0.1-0.2g/L。
优选的，S8中的操作方法为：从S7中已建立的种质库中选取藻种，扩增至藻液体积30L、细胞密度50x104cells/ml左右，接种入1000L大型生产用光生物反应器中，打开内置光源，调节PH设置8.5～9.0，光强15000Lux，光周期L:D＝16:8，温度控制27～29℃，气体流量3m3/h，对细胞进行催红诱导，每日镜检细胞变化，第10日开始分析虾青素含量和干重指标至第15日，对比实验结果。
优选的，S9中适用于工业生产的雨生红球藻藻种具备以下特点：(1)细胞在绿色扩增阶段分裂旺盛，生长速率快；(2)细胞大小普遍较大，绿色细胞阶段大于25μm的占比80％，红色阶段大于4μm的占比80％；(3)细胞色素体饱满，绿色阶段颜色浓重，红色阶段颜色深红；(4)细胞在催红诱导条件下能够迅速转红，较早开始虾青素的累积；(5)细胞在受到催红诱导条件时死亡率较低，排除正常衰亡外死亡率低于10％；(6)细胞在催红诱导条件下可以继续增大，最终采收干重超过0.75g/L；(7)细胞累积虾青素迅速，在同样诱导条件下，虾青素累积量达到同样值所需的时间更短；(8)细胞采收的虾青素含量超过4.5％；(9)藻种遗传稳定，表现为生产应用中表现稳定，批次生产实验数据结果接近；还包括S10、后续工作：在后续生产中随时监控藻种表现、定期开展藻种活化工作、防止藻种老化和性状退化。
本发明的有益效果：
1.通过本发明提供的方法筛选得到的原始藻种用于工业化大规模的雨生红球藻的养殖，育种周期短，用于生产虾青素的效率高；此外所得藻种不易退化，老化，遗传稳定，在生长周期内均保持很好的活力，色素体饱满，死亡率低。
2.利用生产条件进行定向选育，成功率高、所获得藻种可直接应用于生产，避免了普通藻种由于适应性所带来的大生产风险；
3.采用自然选择方法进行选育，未引入任何不安全、不确定因素，所获得藻种遗传稳定、产物安全，保证了批次生产间的确定性和产品的品质；
4.藻种选育过程经过初筛、复筛的谨慎过程，所得结果可靠，藻种的性状和表现有据可查，利于生产者掌握其特性，提高对生产过程的控制；
5.本方法操作简便、技术门槛不高，可以在大规模生产中由具有一般藻类学知识的操作者掌握；
6.本方法可与生产同步实现，如原种的一个重要来源为在大生产中表现突出的样本，节约了专门育种的时间，提高了生产效率；
7.通过本方法可以从藻种源头上保证大生产过程的稳定性、高效性，使藻类的养殖实现真正的工业化过程。
8.利用本方法生产单位可以同时建立起多样性丰富的种质资源库，在生产上形成藻种储备，预防生产中出现的突发情况，并保持持续高品质的生产；
本发明为工业化生产提供了一种简易、高效、实用的藻种选育方法。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
请参阅图1，一种适合工业化生产应用的雨生红球藻藻种选育方法，包括以下步骤：原始藻种选择→原始藻种纯化→藻种扩培→建立藻种系列→藻种初筛→藻种复筛→藻种库建立与保种→藻种生产应用试验→优良藻种的确定，其中：
S1、原始藻种的选择：通过野外采集、交流或购买、在生产应用实践中保留下来的表现突出的样本作为选育种的原始藻种；
S2、原始藻种的纯化：根据藻种的污染程度对原始藻种进行纯化；
S3、藻种扩培：在独立育种室的光照培养架上进行细胞培养，培养基采用无菌BBM培养基；
S4、建立藻种系列：将S2中纯化后得到的藻种进行扩培，达到一定体积和细胞密度后，建立可用于在特定生产条件下开展选育种工作的系列；
S5、藻种初筛：对经过扩培的不同系列的藻种，利用缺氮的虾青素诱导条件进行初步筛选；
S6、藻种复筛：在工业化生产条件下对藻种进行定向筛选；
S7、种质库建立与保种：对经过模拟实验筛选到的优良藻种进行保种和建库；
S8、藻种生产应用试验：对S7中的种质库的藻种进行试验，检测虾青素含量和干重指标；
S9、优良藻种的确定：确定适用于工业生产的雨生红球藻藻种。
本实施例中，S1中野外采集时选取原生态环境可实现人工生产的、藻种在原生境已经形成优势生长的样本进行采集；交流、购买时选择具备以下特点的藻种作为选育种的出发藻种，包括：细胞生长快速、分裂旺盛、活力强、色素体饱满、细胞个体普遍较大、抗逆性强、在有其它生物的情况下可形成优势生长。
本实施例中，S2中对于较为纯净的原种，不需要专门进行纯化，只需通过逐量更换新鲜无菌的BBM培养基进行复壮即可；对一般程度污染的藻种，包括有微生物、原生动物污染但无其它藻类或其它生物污染，采用离心清洗和固体平板分离的纯化方法；对于污染程度较重，样本中存在杂质和多种生物的样本，采用过滤稀释等前处理后，以毛细管显微操作的方法获得纯藻细胞；对于一般污染程度的原种采用固体平板分离的纯化方法，具体步骤如下：
a对原始藻种进行低速离心，离心转速不超过5000rpm，时长3.0min，去除上清液，保留底部沉淀，向离心管中加入新鲜无菌培养液或缓冲液，重悬分散藻泥进行清洗后再次离心，收集沉淀，清洗操作次数可视原种污染情况2-3次不等，最终获得藻泥用无菌培养液重悬，镜检并粗略计数；
b对步骤a得到的藻液进行稀释，使最终细胞密度约500-1000cells/ml，备用；
c向常规BBM液体培养基中按1.5％比例加入琼脂粉，灭菌后待培养基冷却时加入抗生素，抗生素由制霉菌素和氯霉素组成，浓度为80ppm，混合均匀，立刻倒平板；
d取步骤b的细胞稀释液100μL接入平板，用涂布棒轻轻涂布均匀，倒转培养皿，放入恒温光照箱进行培养；
e平板培养至长出肉眼可辩的藻落时，利用接种环挑取单藻落接入试管继续培养，逐步扩增，藻落视情况可于固体培养基中二次划线接种分离；对于污染较为严重的原种，采用毛细管显微操作的方法进行纯化，具体步骤如下：
a对原始藻种进行过滤去除杂质和部分污染物，过滤采用筛绢或滤膜，藻液低速离心(5000rpm，3.0min)后保留底部沉淀，向离心管中加入新鲜无菌培养液或缓冲液，均匀分散藻泥进行清洗后再次离心，收集沉淀，清洗次数视原种污染情况3-5次不等，最终获得藻泥用无菌培养液重悬，镜检并粗略计数；
b对步骤a得到的藻液进行稀释，使最终细胞密度约300-500cells/ml，备用；
c利用酒精喷灯高温拉制毛细玻璃管，毛细管孔径约为40-100um；
d将步骤b的稀释藻液以微滴形式滴到事先灭菌的载玻片上，微滴大小以视野能全部覆盖为准，迅速进行镜检，确定目标细胞，目标细胞应健康、色素饱满，个体较大；
e利用c拉制的玻璃毛细管在显微镜下吸取目标细胞，并转移入装有灭菌培养基的24孔细胞培养板中，重复操作，挑取多个细胞放入培养板中，每孔放入一个；
f将细胞板置于暗光下培养，期间补充培养基挥发，至肉眼可见颜色时，转移到试管中进行培养并由小体积开始逐步培养扩增获得纯化后藻种。
本实施例中，S3中加入培养基后每L藻液中含有以下浓度的营养盐：硝酸钠1.5-2.0×10-3g、磷酸氢二钾7.5-10.0×10-3g、磷酸二氢钾1.75-2.25×10-2g、氯化钠2.5-3.5×10-2g、硫酸镁3.7-4.7×10-2g、氯化钙1.9-2.5×10-2g、硼酸1.10-1.50×10-2g、硫酸锌8.70-9.50×10-3g、氯化锰1.40-1.60×10-3g、钼酸钠1.2-1.4×10-3g、硫酸铜1.50-1.80×10-3g、硝酸钴4.9-5.3×10-4g、乙二胺四乙酸二钠5.0-6.0×10-2g、氢氧化钾3.0-5.0×10-2g、硫酸铁4.9-5.5×10-3g，光源为LED白光灯管，光照强度根据细胞密度的高低而调节，光周期L:D＝12:12，pH值控制为7.0～7.5，温度控制24～26℃，5L培养体积以下为摇瓶培养，5L以上体积为通气培养，通入气体为经过除菌过滤的压缩空气和二氧化碳的混合气体。
本实施例中，S4的具体操作为：对经过复制的来源纯净的原始藻种，扩培达到1L体量、细胞密度达到25x104cells/ml时，用新鲜培养基将藻液稀释50倍至细胞密度为5x103cells/ml时，将藻液分装入多个三角瓶中继续培养，扩增至2.5L体积、藻密度15x104cells/ml左右时，作为筛选用藻种系列备用，对上述系列进行编号并建立档案。
本实施例中，S5的具体操作方法为：将各系列扩培后的2.5L藻液经过沉降、过滤、清洗，去除原培养基干扰后，用缺氮培养基重悬细胞，并分装到3个1L三角瓶中，每瓶750ml，每个藻种做3个平行；所有三角瓶放入培养架上，保持条件一致，所述条件为：培养基采用缺氮培养基，即在常规BBM培养基中剔除硝酸盐成份，光源为可发出以下特定光谱的雨生红球藻催红专用LED灯管，特定光谱包括波长为370-420nm的第一LED发光芯片、波长为400-495nm的第二LED发光芯片、波长为615-700nm的第三LED发光芯片，第一LED发光芯片、第二LED发光芯片、第三LED发光芯片的能量比为0～1：32～50：66～70，灯管安装在培养架上下，光照强度15000Lux，光周期L:D＝16:8，PH值控制为8.5～9.0，温度控制27～29℃，通过初筛得出虾青素积累快、同样时间内虾青素积累量高、细胞干重高、细胞死亡率低、培养体系干净的藻种系列。
本实施例中，S6中由于工业设备体积庞大，不适合用于藻种筛选实验，因此首先需建立模拟生产条件，S6的具体操作方法为：根据工业生产所采用的内置光源的垂直式光生物反应器的形状、配件和相关设备等，制作小型模拟光生物反应器，提供与生产所采用的雨生红球藻催红诱导条件最大程度一致的实验条件，模拟光生物反应器具有以下特点：容量由工业设备的1000L缩小为15L，材质由不锈钢改为亚克力管，根据生产用光源光径，模拟反应器内置1根雨生红球藻专用催红LED灯管，此外，模拟反应器的通气系统、温度、PH等的监测调控系统同工业设备，多个模拟反应器统一安装和固定在支架上，各容器包有反光膜进行光的隔绝，保证各容器条件一致。
本实施例中，S7中采用的藻液为实验藻或实验前的对应藻液，S7具体操作方法为：对藻种编号并登记在册，注明该藻种的原始来源、初筛结果、生产性模拟实验结果以及藻种的其它相关性状，藻种保存分为三级，一级保种采用固体形式，包括固体平板和斜面，二级保种采用液体小体积保种，包括试管和150ml以下小三角瓶，三级保种为250-500ml三角瓶，其中，一级保种封口后存放于冰箱-20℃，二级保种存放于冰箱4℃，三级保种置于光照培养箱中或培养架上，藻种看护周期为：一级种6个月，二级种3个月，三级种45天诱导剂的含量为0.1-0.2g/L。
本实施例中，S8中的操作方法为：从S7中已建立的种质库中选取藻种，扩增至藻液体积30L、细胞密度50x104cells/ml左右，接种入1000L大型生产用光生物反应器中，打开内置光源，调节PH设置8.5～9.0，光强15000Lux，光周期L:D＝16:8，温度控制27～29℃，气体流量3m3/h，对细胞进行催红诱导，每日镜检细胞变化，第10日开始分析虾青素含量和干重指标至第15日，对比实验结果。
本实施例中，S9中适用于工业生产的雨生红球藻藻种具备以下特点：(1)细胞在绿色扩增阶段分裂旺盛，生长速率快；(2)细胞大小普遍较大，绿色细胞阶段大于25μm的占比80％，红色阶段大于4μm的占比80％；(3)细胞色素体饱满，绿色阶段颜色浓重，红色阶段颜色深红；(4)细胞在催红诱导条件下能够迅速转红，较早开始虾青素的累积；(5)细胞在受到催红诱导条件时死亡率较低，排除正常衰亡外死亡率低于10％；(6)细胞在催红诱导条件下可以继续增大，最终采收干重超过0.75g/L；(7)细胞累积虾青素迅速，在同样诱导条件下，虾青素累积量达到同样值所需的时间更短；(8)细胞采收的虾青素含量超过4.5％；(9)藻种遗传稳定，表现为生产应用中表现稳定，批次生产实验数据结果接近；还包括S10、后续工作：在后续生产中随时监控藻种表现、定期开展藻种活化工作、防止藻种老化和性状退化。
实施例1
S1、原始藻种的选择：选取在生产应用实践中表现突出的样本为原始藻种，原种生产信息如下：采收干重0.95g/L，虾青素含量6.1％，绿色阶段培养5天，催红诱导12天；截取采收阶段的藻液2L，随机取样镜检，得出结果为：藻液较干净，细胞呈圆形，个体普遍较大，约45um以上，全部细胞呈深红色，内部充满虾青素，细胞壁厚度适中，藻液中基本未见其它污染，细菌不排除、细胞自身代谢废物不排除；
S2、原始藻种的纯化：S1中的藻种较为纯净，仅细菌类微生物和细胞自身代谢废物不可排除，因此对留样的2L藻液首先进行沉降，倾倒多余液体，再加入无菌的BBM培养基进行清洗、离心，获得底部藻泥，并用培养基重悬细胞，再次清洗，反复两次；
S3、藻种扩培：将经过清洗的藻液转入5L烧瓶中，加入新鲜无菌的BBM培养基进行培养，培养条件为；培养基采用无菌BBM培养基，加入培养基每升的藻液中含有以下浓度的营养盐成分：硝酸钠1.5×10-3g、磷酸氢二钾7.5×10-3g、磷酸二氢钾1.75×10-2g、氯化钠2.5×10-2g、硫酸镁3.7×10-2g、氯化钙1.9×10-2g、硼酸1.14×10-2g、硫酸锌8.82×10-3g、氯化锰1.44×10-3g、钼酸钠1.2×10-3g、硫酸铜1.57×10-3g、硝酸钴4.9×10-4g、乙二胺四乙酸二钠5.0×10-2g、氢氧化钾3.1×10-2g、硫酸铁4.98×10-3g。光源为LED白光灯管，光照强度5000Lux，光周期L:D＝12:12，PH值控制为7.0～7.5，温度控制24～26℃，通气培养，气量3m3/h，通入气体为经过除菌过滤的压缩空气和二氧化碳的混合气体；
S4、建立藻种系列：S3中扩培达到细胞密度25x104cells/ml左右时，用新鲜培养基稀释藻液至细胞密度约为5x103cells/ml时，将藻液分装入15个三角瓶中继续培养，扩增至2.5L体积、15x104cells/ml左右，对上述系列进行编号并建立档案；
S5、藻种初筛：经过分装、扩培的15瓶藻种定为15个系列，首先进行沉降和清洗，去除原培养基干扰，利用缺氮的虾青素诱导条件进行初步筛选，每个系列做3个平行，采用1L三角瓶进行实验，每瓶藻液750ml，所有三角瓶放入培养架上，保持条件一致：培养基采用缺氮培养基，即在常规BBM培养基中剔除硝酸盐成份，光源为可发出以下特定光谱的雨生红球藻催红专用LED灯管，灯管安装在培养架上下，光照强度15000Lux，光周期L:D＝16:8，PH值控制为8.5～9.0，温度控制27～29℃。比较得出虾青素积累快、同样时间内虾青素积累量高、细胞干重高、细胞死亡率低、培养体系干净的藻种系列进入二筛，初筛共得到5个系列；
S6、藻种复筛：对S5经过初筛的5个系列藻种进行扩培，扩培达到5L体积、30x104cells/ml左右，后经过沉降、过滤、清洗，重悬后接入模拟反应器，反应器事先经过清洗和消毒，细胞接种密度约15x104cells/ml左右，打开模拟反应器内置光源，调节PH设置8.5～9.0，光强15000Lux，光周期L:D＝16:8，温度控制27～29℃，气体流量3m3/h，气体为压缩空气和二氧化碳的混合气，二氧化碳通入量为空气体积的2％。每日镜检细胞变化，第7日开始每日分析虾青素含量和干重指标至第15日，从中选出1个系列表现最佳，结果为诱导第9天虾青素含量达到4.5％，干重0.63g/L，同日指标高于其它系列15-20％，培养第15天，虾青素含量达到6.3％，干重1.11g/L，整个诱导过程细胞死亡率较低，培养体系干净；
S7、种质库建立与保种：对经过模拟实验筛选到的这株优良藻种进行保种并编号登记，藻种编号为YZY0120180509050301。保种制作三种形式：固体平板、斜面、液体，其中液体种为500ml三角瓶3个，液体种放在指定的藻种培养架上，固体平板和斜面存于冰箱；
S8、藻种生产应用试验：将YZY0120180509050301号藻种扩增至藻液体积30L、细胞密度50x104cells/ml左右，接种入1000L大型生产用光生物反应器中，打开内置光源，调节PH设置8.5～9.0，光强15000Lux，光周期L:D＝16:8，温度控制27～29℃，气体流量3m3/h，对细胞进行催红诱导。每日镜检细胞变化，第10日开始分析虾青素含量和干重指标至第15日，结果如下表；
天数(D)
虾青素含量(％)
干重(g/L)
10
4.20
0.62
11
4.71
0.64
12
4.93
0.73
13
5.12
0.88
14
5.81
0.79
15
6.05
0.91
表1.藻种YZY0120180509050301生产数据
S9、优良藻种的确定：根据上表数据，并结合整体养殖过程，确定藻种YZY0120180509050301可以用做种质资源库保存和生产备选藻种。
实施例2
S1、原始藻种的选择：原始藻种来自野外采集，采样地点为厦门地区淡水湖泊，采样时间为2018年8月，采样地当日温度最高38℃，最低22℃，采样前10日当地天气晴朗、无雨；
S2、原始藻种的纯化：样本在当地简单镜检和处理后，带回实验室，首先进行过滤，去除大颗粒物质和杂质，转移到三角瓶中，加入减半的BBM培养基进行藻种的适应性培养，在此过程中随时监控样本的变化情况，镜检样本，水样中除红球藻细胞外，还包括多种原生动物、杂藻、微生物污染，监测雨生红球藻细胞在培养液中占据半数以上数量时，对水样进行过滤，去除大部分原生动物和丝状杂藻，过滤后藻液进行低速离心，去除大部分质量小于红球藻的杂藻和微生物污染，向离心管中加入新鲜无菌培养液，均匀分散藻泥进行清洗后再次离心，收集沉淀，最终获得藻泥用无菌培养液重悬，镜检并粗略计数，计数仅计雨生红球藻细胞，根据计数结果，对藻液进行稀释，最终细胞密度约300cells/ml，将稀释藻液以微滴形式滴到事先灭菌的载玻片上，迅速进行镜检，确定目标细胞，目标细胞应健康、色素饱满，个体较大。利用事先拉制的玻璃毛细管在显微镜下迅速吸取目标细胞，并转移入装有灭菌培养基的24孔细胞培养板中。重复操作，挑取多个细胞放入培养板中，每孔放入一个，共挑取雨生红球藻细胞50个，将细胞板置于暗光下培养，期间补充培养基挥发，至肉眼可见颜色时，转移到试管中进行培养，其中未有变化的微孔做抛弃处理，共得到11株。将此11株由小体积逐步培养扩增，其中培养失败5株，最终获得纯化后单克隆藻种6株，编号为编号为：
YZWFX029180805042101、YZWFX029180805042102、YZWFX029180805042103、YZWFX029180805042104、YZWFX029180805042105、YZWFX029180805042106。
S3、藻种扩培：对S2中6株藻种加入新鲜培养基进行扩培，中扩培达到藻液体积2.5L、细胞密度15x104cells/ml左右，作为筛选用藻种系列备用，藻种扩培在独立育种室的光照培养架上进行，培养基采用无菌BBM培养基，培养基配方加入后使体系每升藻液中含有如下浓度的物质：硝酸钠1.5×10-3g、磷酸氢二钾7.5×10-3g、磷酸二氢钾1.75×10-2g、氯化钠2.5×10-2g、硫酸镁3.7×10-2g、氯化钙1.9×10-2g、硼酸1.14×10-2g、硫酸锌8.82×10-3g、氯化锰1.44×10-3g、钼酸钠1.2×10-3g、硫酸铜1.57×10-3g、硝酸钴4.9×10-4g、乙二胺四乙酸二钠5.0×10-2g、氢氧化钾3.1×10-2g、硫酸铁4.98×10-3g。光源为LED白光灯管，光照强度根据细胞密度的高低而调节，光周期L:D＝12:12，PH值控制为7.0～7.5，温度控制24～26℃，5L培养体积以下为摇瓶培养，5L以上体积为通气培养，通入气体为经过除菌过滤的压缩空气和二氧化碳的混合气体；
S4、建立藻种系列：S3中扩培达到藻液体积2.5L、细胞密度15x104cells/ml左右，作为筛选用藻种系列备用，对上述系列进行编号并建立档案；
S5、藻种初筛：对经过扩培的藻种利用缺氮的虾青素诱导条件进行初步筛选，具体操作包括：将藻种YZWFX029180805042101、YZWFX029180805042103、YZWFX029180805042104、YZWFX029180805042106扩培后的2.5L藻液经过沉降、过滤、清洗，去除原培养基干扰后，用不含硝酸钠的BBM培养基重悬细胞，并分装到3个500mL三角瓶中，每瓶350ml，每个藻种做3个平行；所有三角瓶放入培养架上，保持条件一致，除培养基采用缺氮培养基外，光源为可发出以下特定光谱的雨生红球藻催红专用LED灯管，灯管安装在培养架上下，光照强度15000Lux，光周期L:D＝16:8，PH值控制为8.5～9.0，温度控制27～29℃。比较得出虾青素积累快、同样时间内虾青素积累量高、细胞干重高、细胞死亡率低、培养体系干净的藻种系列进入二筛，初筛得到2个系列：YZWFX029180805042102、YZWFX029180805042106；
S6、藻种复筛：对S5中经过初筛的2个系列藻种进行扩培，扩培达到5L体积、30x104cells/ml左右，后经过沉降、过滤、清洗，重悬后接入模拟反应器，反应器事先经过清洗和消毒，细胞接种密度约15x104cells/ml左右，打开模拟反应器内置光源，调节PH设置8.5～9.0，光强15000Lux，光周期L:D＝16:8，温度控制27～29℃，气体流量3m3/h。每日镜检细胞变化，第7日开始每日分析虾青素含量和干重指标至第15日。从中选出藻种YZWFX029180805042106表现较好，诱导第10天虾青素含量达到3.6％，干重0.58g/L，培养第15天，虾青素含量达到4.75％，干重0.68g/L，整个诱导过程细胞死亡率较低，培养体系干净；
S7、种质库建立与保种：将YZWFX029180805042106存入种质库并进行保种。保种制作三种形式：固体平板、斜面、液体，其中液体种为100ml三角瓶3个，全部存于冰箱；
S8、藻种生产应用试验：将YZWFX029180805042106号藻种扩增至30L、细胞密度50x104cells/ml左右，接种入1000L大型生产用光生物反应器中，打开内置光源，调节PH8.5～9.0，光强15000Lux，光周期L:D＝16:8，温度控制27～29℃，气体流量3m3/h，对细胞进行催红诱导。每日镜检细胞变化，第10日开始分析虾青素含量和干重指标至第15日，结果如下表：
表2.藻种YZWFX029180805042106生产数据
S9、优良藻种的确定：根据上表数据，并结合整体养殖过程，确定藻种YZWFX029180805042106可以用做种质资源库保存和生产备选藻种。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
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