一种用于培养产dha油脂海洋微藻的培养基质及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种用于培养产dha油脂海洋微藻的培养基质及其制备方法和应用 (Culture medium for culturing marine microalgae producing DHA (docosahexaenoic acid) grease as well as preparation method and application of culture medium ) 是由 赵祥颖 张华秋 刘建军 张家祥 刘丽萍 姚明静 田延军 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于培养产DHA油脂海洋微藻的培养基质及其制备方法和应用,属于农产品深加工技术领域。本发明采用相关工艺方法制备得到的小麦淀粉糖浆含有丰富的营养成分,经试验证明,采用其作为培养基质原料,并辅以相应辅料成分,不仅能够有效促进裂殖藻生长,还能有效提高海洋微藻DHA的油脂合成及DHA含量,且不再需要使用人工海水,从而极大提高生产效率并显著降低生产成本,因此具有良好的实际应用之价值。(The invention provides a culture medium for culturing marine microalgae producing DHA grease, and a preparation method and application thereof, and belongs to the technical field of deep processing of agricultural products. The wheat starch syrup prepared by the related process method contains rich nutrient components, and experiments prove that the wheat starch syrup is used as a culture medium raw material and is supplemented with corresponding auxiliary material components, so that the growth of schizophyllum can be effectively promoted, the lipid synthesis and DHA content of marine microalgae DHA can be effectively improved, artificial seawater is not needed any more, the production efficiency is greatly improved, the production cost is remarkably reduced, and the wheat starch syrup has good value in practical application.)
技术领域
本发明属于农产品深加工技术领域，具体涉及一种用于培养产DHA油脂海洋微藻的培养基质及其制备方法和应用。
背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。DHA，二十二碳六烯酸，俗称“脑黄金”，是人体所必需的多不饱和脂肪酸之一，具有促进人体的脑部发育、防治心血管疾病、抗炎以及抗癌等重要的生理功能。目前DHA产品的多来源于深海鱼油，从鱼油中提取DHA，工艺复杂、产品得率低，鱼腥味仍难以除去，极大地限制了此高附加值产品在食品行业中的应用。鱼油中DHA含量会因鱼类品种、捕捞季节、气候、地点的不同而存在明显差异，产品品质波动较大，同时，过度捕捞，会对海洋生态造成不可逆转的损害。研究表明，深海鱼油中的DHA成分来源于海洋微藻。利用海洋微藻通过发酵法生产DHA不受原料、产地限制，无季节、气候依赖性，同时可以有效减少过度捕捞导致的环境危害。相比于鱼油制品，不含胆固醇，且不会有重金属等污染的风险。因此利用海洋微藻通过发酵培养生产DHA油脂是未来产业发展的方向。我国2011年就已发布了食品添加剂二十二碳六烯酸油脂(发酵法)国家食品安全标准GB26400-2011，推荐采用的生产(DHA)油脂所的海洋微藻有裂壶藻(Schizochytrium sp.)、吾肯氏壶藻(Ulkenia amoeboida)或者寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)等异养微藻。采用微藻通过发酵法生产DHA油脂，主要是采用人工合成培养基进行细胞培养，培养基的组成对培养液中细胞的浓度和胞内DHA油脂积累有重要影响，目前一般微藻细胞培养主要是以葡萄糖为主要原料，通常还需要添加酵母浸出物、谷氨酸、铵盐等作为单元和营养成分，其他无机离子由人工海水提供。原料成本约占总生产成本的大约50-60％。
谷朊粉生产是小麦主要的深加工方式之一，小麦中蛋白含量大约12-13％，淀粉含量65-70％，因此，在生产谷朊粉的过程中会联产大量的小麦淀粉。小麦淀粉根据颗粒大小的不同分为A淀粉和B淀粉，A淀粉颗粒较大，分离精制相对容易，可以进一步加工成商品淀粉出售。B淀粉是颗粒较小的淀粉，生产中通常和小麦淀粉浆中戊聚糖、残余蛋白等非淀粉成分混在一起很难分离，该组分含干物中淀粉成分大约占80％，目前主要用于酒精发酵或是干燥后作为饲料出售，产品附加值比较低。
发明内容
针对目前小麦谷朊粉生产过程中联产的小麦淀粉低值化利用的问题，本发明提供了一种以小麦淀粉糖浆为原料制备的用于培养积累DHA油脂的海洋微藻的培养基质。采用本发明的工艺方法制备得到的小麦淀粉糖浆含有丰富的营养成分，经试验证明，采用其作为培养基质原料，并辅以相应辅料成分，不仅能够有效促进裂殖藻生长，还能有效提高海洋微藻DHA的油脂合成及DHA含量，且不需要使用人工海水，因此具有良好的实际应用之价值。
为了实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供小麦淀粉浆在制备培养产DHA油脂海洋微藻的培养基质中的应用。
本发明的第二个方面，提供一种用于培养产DHA油脂海洋微藻的培养基质，所述培养基质包含小麦淀粉糖浆，其中，所述小麦淀粉糖浆可以为谷朊粉生产过程中产生的小麦淀粉浆制得。
具体的，所述小麦淀粉糖浆采用如下(1)-(7)中任意一种方法制备得到：
(1)取谷朊粉分离的混合淀粉浆，加水调节淀粉浆浓度，按照粉浆中淀粉含量加入液化酶进行常规淀粉液化，液化后离心分离，离心上清调整pH后加入糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆；
(2)取谷朊粉分离的混合淀粉浆，离心，上清液单独收集，沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度，按照粉浆中淀粉含量加入液化酶进行常规淀粉液化，液化后离心分离，分离的固体沉淀部分单独加工，离心上清调整pH后加糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆；
(3)取谷朊粉分离的混合淀粉浆，离心收集上清液，加入适量结晶葡萄糖溶解后即得小麦淀粉糖浆；
(4)取谷朊粉加工生产分离的A淀粉浆，加水调节淀粉浆浓度，按照常规双酶制糖工艺进行液化糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆；
(5)取谷朊粉加工生产分离的A淀粉浆，离心，分离清液，沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度，按照常规双酶制糖工艺进行液化糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆；
(6)取谷朊粉加工生产分离的B淀粉浆，加水调节淀粉浆浓度，按照粉浆中淀粉含量加入液化酶进行常规淀粉液化，离心上清调整pH后加糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆；
(7)取谷朊粉加工生产分离的B淀粉浆，离心，分离清液，沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度，按照粉浆中淀粉含量加入液化酶进行常规淀粉液化，液化后离心分离，离心上清调整pH后加糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆。
本发明的第三个方面，提供上述培养基质的制备方法，所述制备方法包括：向所述小麦淀粉糖浆中加入辅料即得。
本发明的第四个方面，提供一种产DHA海洋微藻的培养方法，所述培养方法包括：将产DHA的海洋微藻接种至上述经灭菌后的培养基质中进行发酵培养。
所述产DHA海洋微藻接种量控制为5-10％；培养至残留葡萄糖降至0.1g/L以下结束发酵培养。
所述产DHA海洋微藻包括但不限于裂壶藻、吾肯氏壶藻和寇氏隐甲藻，进一步优选为裂壶藻。
所述培养方法还包括收集发酵培养获得的产DHA海洋微藻，并分离获取DHA油脂。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
(1)小麦谷朊粉生产过程联产小麦淀粉糖浆，除含有淀粉外还含有小麦中的其他营养成分。研究发现以小麦淀粉糖浆制备的葡萄糖溶液为原料进行微藻细胞培养，与以葡萄糖为原料相比不仅可以减少其他营养物质的添加量，降低原料成本，而且可以显著提高发酵液中的细胞浓度和细胞中的油脂含量，提高生产效率。
(2)小麦淀粉因为含有小麦麸质纤维和戊聚糖等非淀粉成分，糖化后糖液黏度高、过滤困难，用来做发酵原料会增加产物的分离精制的难度和成本。海洋微藻发酵法生产DHA油脂，因为油脂存在于细胞内，发酵结束后，可以通过离心等手段先从发酵液中收集细胞，然后再进行油脂分离，因此产物的提取基本不受培养基质的性质的影响。或不进行细胞收集，发酵液也可直接用于养殖业提供动物DHA营养。将小麦淀粉用于DHA油脂的海洋微藻的培养基质，产品附加值高，可增加小麦淀粉的经济价值。
(3)采用小麦淀粉糖浆为基质进行产DHA微藻培养不需要使用人工海水，避免了人工海水对发酵培养设备的腐蚀。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明的一个具体实施方式中，提供小麦淀粉浆在制备培养产DHA油脂海洋微藻的培养基质中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于培养产DHA油脂海洋微藻的培养基质，所述培养基质包含小麦淀粉糖浆，其中，所述小麦淀粉糖浆可以为谷朊粉生产过程中产生的小麦淀粉制得。本发明研究发现，采用上述小麦淀粉糖浆作为产DHA油脂海洋微藻的培养基质，只需再加入适量辅料，用于产DHA微藻培养，即可显著提高发酵液中的产DHA油脂海洋微藻细胞浓度和细胞中的油脂含量，提高生产效率，同时极大降低原料成本。
本发明的又一具体实施方式中，所述小麦淀粉糖浆采用如下(1)-(7)中任意一种方法制备得到：
(1)取谷朊粉分离的混合淀粉浆，加水调节淀粉浆浓度，按照粉浆中淀粉含量加入液化酶进行常规淀粉液化，液化后离心分离，离心上清调整pH后加入糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆；
(2)取谷朊粉分离的混合淀粉浆，离心，沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度，按照粉浆中淀粉含量加入液化酶进行常规淀粉液化，液化后离心分离，离心上清调整pH后加糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆；
(3)谷朊粉分离的混合淀粉浆，离心收集上清液，加入葡萄糖即得小麦淀粉浆；
(4)取谷朊粉加工生产分离的A淀粉浆，加水调节淀粉浆浓度，按照常规双酶制糖工艺进行液化糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆；
(5)取谷朊粉加工生产分离的A淀粉浆，离心，沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度，按照常规双酶制糖工艺进行液化糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆；
(6)取谷朊粉加工生产分离的B淀粉浆，加水调节淀粉浆浓度，按照粉浆中淀粉含量加入液化酶进行常规淀粉液化，离心上清调整pH后加糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆；
(7)取谷朊粉加工生产分离的B淀粉浆，离心，沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度，按照粉浆中淀粉含量加入液化酶进行常规淀粉液化，液化后离心分离，离心上清调整pH后加糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度即得小麦淀粉糖浆。
本发明的又一具体实施方式中，所述方法(1)中，加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé，离心上清调整pH至4.4-4.6；加水调整葡萄糖浓度至10-15％；进一步优选为10-12％；液化后离心分离获得的固体沉淀部分可单独加工，诸如用于小麦膳食纤维粉的加工；
本发明的又一具体实施方式中，所述方法(2)中，混合淀粉浆离心具体条件为：在4500-5500rpm(优选为5000rpm)条件下处理5-10min；沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé；离心上清调整pH至4.4-4.6；加水调整葡萄糖浓度至10-15％；进一步优选为10-12％；
本发明的又一具体实施方式中，所述方法(3)中，混合淀粉浆离心具体条件为：在4500-5500rpm(优选为5000rpm)条件下处理5-10min；加入葡萄糖调整淀粉浆内葡萄糖浓度为10-15％；进一步优选为10-12％；
本发明的又一具体实施方式中，所述方法(4)中，加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé，加水调整葡萄糖浓度至10-15％；进一步优选为10-12％；
本发明的又一具体实施方式中，所述方法(5)中，A淀粉浆离心具体条件为：在1500-2500rpm(优选为2000rpm)条件下处理3-5min；沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé，加水调整葡萄糖浓度至10-15％，进一步优选为10-12％；
本发明的又一具体实施方式中，所述方法(6)中，B淀粉浆加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé；离心上清调整pH至4.4-4.6；加水调整葡萄糖浓度至10-15％，进一步优选为10-12％；液化后通过离心的方法分离液化液中的固体基质可用于小麦膳食纤维粉的加工；
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(7)中，B淀粉浆离心具体条件为：在4500-5500rpm(优选为5000rpm)条件下处理5-10min；沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé；离心上清调整pH至4.4-4.6；加水调整葡萄糖浓度至10-15％；进一步优选为10-12％；液化后通过离心的方法分离液化液中的固体基质可用于小麦膳食纤维粉的加工；
本发明的又一具体实施方式中，所述培养基质还含有辅料，所述辅料包含谷氨酸钠、硫酸铵和酵母浸出物中的任意一种或多种，所述谷氨酸钠在培养基质中的含量为0-2％，优选为1％；
本发明的又一具体实施方式中，所述硫酸铵在培养基质中的含量为0-0.5％，优选为0.3％；
本发明的又一具体实施方式中，所述酵母浸粉在培养基质中的含量为0-2％，优选为0.5％或1％。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述培养基质的制备方法，所述制备方法包括：向所述小麦淀粉糖浆中加入辅料即得。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产DHA海洋微藻的培养方法，所述培养方法包括：将产DHA海洋微藻接种至上述经灭菌后的培养基质中进行发酵培养。
所述产DHA海洋微藻接种量控制为5-10％；培养至残留葡萄糖降至0.1g/L以下结束发酵培养。
所述产DHA海洋微藻包括但不限于裂壶藻、吾肯氏壶藻和寇氏隐甲藻，进一步优选为裂壶藻。
本发明的又一具体实施方式中，所述培养方法还包括收集发酵培养获得的产DHA海洋微藻，并分离获取DHA油脂。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
实验材料
实验菌种：产DHA油脂的裂殖藻，上述菌种公众可以从山东省食品发酵工业研究设计院获得。
小麦淀粉培养基质制备：
培养基质Ⅰ(ABC)：取谷朊粉分离的混合淀粉浆，加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé，按照粉浆中淀粉含量加入适量液化酶进行常规淀粉液化，液化后5000rpm离心3min，收集上清液，沉淀部分，加1倍的水洗涤1次，离心，收集上清。将两次上清合并，调整pH4.4-4.6，加入适量糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度至10-12％，适量加入其他所需辅料，即得海洋微藻的培养基质。沉淀部分可用于小麦膳食纤维粉的加工。
培养基质Ⅱ(AB)：取谷朊粉分离的混合淀粉浆，5000rpm离心5min，收集沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé，按照粉浆中淀粉含量加入适量液化酶进行常规淀粉液化，液化后5000rpm离心3min，收集上清液，沉淀部分，加1倍的水洗涤1次，离心，收集上清。将两次上清合并，调整pH4.4-4.6，加入适量糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度至10-12％，适量加入其他所需辅料即得。沉淀部分可用于小麦膳食纤维粉的加工。
培养基质Ⅲ(A)：取谷朊粉分离的混合淀粉浆，1500rpm离心1秒钟，分别收集上部轻相和沉淀部分，轻相部分即为B淀粉浆，沉淀部分为A淀粉。取沉淀部分加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé，按照粉浆中淀粉含量加入适量液化酶进行常规淀粉液化，液化后调整pH4.4-4.6，加入适量糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度至10-12％，适量加入其他所需辅料即得。
培养基质Ⅳ(AC)：取谷朊粉分离的混合淀粉浆，1500rpm离心1秒钟，分别收集上部轻相和沉淀部分，，沉淀部分为A淀粉。取沉淀部分加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé，按照粉浆中淀粉含量加入适量液化酶进行常规淀粉液化，液化后调整pH4.4-4.6，加入适量糖化酶进行糖化，糖化结束后，加入B淀粉浆5000rpm离心5min的上清(C)调整葡萄糖浓度至10-12％，适量加入其他所需辅料即得。
培养基质Ⅴ(BC)：取上述B淀粉浆，按照粉浆中淀粉含量加入适量液化酶进行常规淀粉液化，液化后5000rpm离心3min，收集上清液，沉淀部分，加1倍的水洗涤1次，离心，收集上清。将两次上清合并，调整pH4.4-4.6，加入糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度至10-12％，适量加入其他所需辅料即得。沉淀部分可用于小麦膳食纤维粉的加工。
培养基质Ⅵ(B)：取B淀粉浆，5000rpm离心5min，收集沉淀部分重新加水调节淀粉浆浓度为10～15Bé，按照粉浆中淀粉含量加入适量液化酶进行常规淀粉液化，液化后5000rpm离心3min，收集上清液，沉淀部分，加1倍的水洗涤1次，离心，收集上清。将两次上清合并，调整pH4.4-4.6，加入适量糖化酶进行糖化，糖化结束后，加水调整葡萄糖浓度至10-12％，适量加入其他所需辅料即得。沉淀部分可用于小麦膳食纤维粉的加工。
培养基质Ⅶ(C)：取谷朊粉分离的混合淀粉浆，5000rpm离心5min，收集上清部分，离心去沉淀，清液用于培养基配制。
对照组培养基质(g/L)：葡萄糖120，谷氨酸钠10，硫酸铵3，酵母浸粉10，用稀释1倍的人工海水配制。
人工海水(g/L)：NaCl 11.2，KCl 0.8，MgSO4 1.9，MgCl2 2.6，CaCl2 1.2，NaHCO30.2，NaBr 0.06。
微藻细胞培养
取按上述方法制备的培养基质，对照实验采用口服葡萄糖配制。培养基质经灭菌后接入培养好的裂殖藻SFD-1502种子液，28-30℃进行发酵培养。
摇瓶培养：500ml三角瓶装液量50ml，接种量5-10％，在最佳培养条件下培养3-4天。
发酵罐发酵：发酵采用50L发酵罐培养，接种量5-10％，发酵过程中根据需求控制适当的温度和相对溶解氧浓度。培养至残留葡萄糖降至0.1g/L以下结束发酵。
种子培养基：葡萄糖50g/L，酵母浸出物10g/L，玉米浆10g/L，氯化钠5g/L，，饮用水配制，pH 7.0。
摇瓶实验结果
实验用葡萄糖为对照对上述制备的培养基质进行裂殖藻发酵生产DHA试验，考察小麦淀粉制备的培养基质对裂殖藻生长以及DHA油脂合成的影响。结果见表1：
表1培养基质培养产DHA裂殖弧菌结果
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
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