一种采用复合菌株发酵制备i+g的方法

文档序号：1900862 发布日期：2021-11-30 浏览：17次 >En<

阅读说明：本技术 一种采用复合菌株发酵制备i+g的方法 (Method for preparing I + G by fermenting compound strains ) 是由孔凡明吴涛高鹏常利斌龚华李岩赵津津于 2021-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种采用复合菌株发酵制备I+G的方法,利用了解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens G10和B.amyloliquefaciens 8311,以及大肠杆菌工程菌株AP-03,步骤包括S1.斜面培养；S2.一级种子培养；S3.二级种子培养；S4.复合培养；S5.大肠杆菌培养；S6.转化。本发明通过采用两株解淀粉芽孢杆菌菌株复合发酵同时生产肌苷和鸟苷,进一步通过大肠杆菌酶转化生成IMP和GMP,且通过控制合适的接种比、温度阶段控制策略,将发酵液中IMP和GMP比例控制在合适的水平,简化了常规I+G生产工艺和工序投入,省时省力,极大降低生产过程的设备投入和生产成本,经济效益显著。(The invention discloses a method for preparing I + G by adopting composite strain fermentation, which utilizes Bacillus amyloliquefaciens strains B.amyloliquefaciens G10 and B.amyloliquefaciens8311 and an escherichia coli engineering strain AP-03 and comprises the steps of S1. slant culture; s2, primary seed culture; s3, secondary seed culture; s4, performing composite culture; s5, culturing escherichia coli; and S6, converting. According to the invention, two bacillus amyloliquefaciens strains are adopted for composite fermentation to simultaneously produce inosine and guanosine, IMP and GMP are further generated through enzyme conversion of escherichia coli, and the proportion of IMP and GMP in the fermentation liquor is controlled at a proper level by controlling a proper inoculation ratio and a temperature stage control strategy, so that the conventional I + G production process and process investment are simplified, time and labor are saved, the equipment investment and production cost in the production process are greatly reduced, and the economic benefit is remarkable.)

一种采用复合菌株发酵制备I+G的方法

技术领域

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本发明涉及一种I+G的制备方法，尤其涉及一种采用复合菌株发酵制备I+G的方法。

背景技术

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呈味核苷酸二钠是核苷酸类食品增鲜剂，由肌苷酸二钠和鸟苷酸二钠按一定比例混合而成，可直接加入到食品中，起到增鲜作用。通过试验发现呈味核苷酸二钠在使用过程中会呈现相乘效应，即将两种鲜味剂混合使用时，其鲜味程度远远大于将两种鲜味剂单独使用时产生的鲜味总和。在当今社会中，呈味核苷酸已经成为人们日常生活中必不可少的调味料之一。利用呈味核苷酸而制成的鲜味调味品种类也在不断增加，如味精、鸡精、鸡粉、特鲜味精等，这些食品调味剂在食品加工制造方面有着十分重要的作用。在实际应用过程中，这两种物质通常会以钠盐的形式出现，并以特定比例进行混合使用，进而形成呈味核苷酸二钠(I+G)。

目前呈味核苷酸的生产方法有酶解法和发酵法，其中酶解法包括酶解RNA法和菌体自溶法，发酵法包括直接发酵法和发酵-转化法。酶解RNA法和菌体自溶法生产呈味核苷酸工艺简单、原料来源丰富、成本低廉、酶反应收率较高且生产核苷酸能一次得到四种核苷酸的混合物。但后提取过程中，分离纯化得到四种高纯度产品难度大，导致生产周期长，提取工艺繁琐，产品纯度不高。直接发酵法生产核苷酸不仅要考虑核苷酸代谢过程反馈抑制的解除，而且还要考虑如何改变细胞对肌苷酸的通透性，存在生产周期长，产量提升困难等问题。由于菌体中普遍存在有将核苷酸降解成核苷的核苷酸酶，并且核苷可以直接通过细胞膜，基本不会对嘌呤合成过程造成反馈抑制。利用发酵法生产肌苷或鸟苷再通过后续磷酸化成为生产呈味核苷酸的重要来源。

目前，较多生产厂家采用对肌苷和鸟苷化学磷酸化方法生产呈味核苷酸，即对肌苷和鸟苷先通过化学磷酸化法转化成IMP/GMP，将生成的IMP/GMP进一步纯化并按一定比例混合制备I+G成品。其优势虽然在于专一性强、副产物少和磷酸化产率高，但过程所用到的原料成本较高且对人体及环境有较大危害，在发酵、提取纯化等工序也存在大量能源和人工成本的投入。

近几年，随着环保观念的普及和人们对绿色发展的不断关注，酶转化法生产核苷酸日益受到科技工作者的广泛关注，能用于核苷磷酸化生产核苷酸的酶主要为酸性磷酸酶。目前对酶转化法生产呈味核苷酸的研究较多，主要集中在产酶工程菌株的构建及酶转化工艺优化等方面。但较多工艺仍集中于单个呈味核苷酸的研究，得到IMP/GMP单个成品后再按比例复配形成I+G，这个过程存在部分工艺重合使得生产成本和设备投入仍有较大优化空间。在倡导节能减排绿色发展背景下，通过对现有I+G生产工艺的改进，提高生产水平的同时，进一步缩短生产工序，降低对能源需求的限制，对于I+G产品国际竞争力的提升具有非常重要的意义。

发明内容

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本发明的目的在于提供一种采用复合菌株发酵制备I+G的方法，通过采用两株解淀粉芽孢杆菌菌株复合发酵同时生产肌苷和鸟苷，进一步通过大肠杆菌酶转化生成IMP和GMP，且通过控制合适的接种比、温度阶段控制策略，将发酵液中IMP和GMP比例控制在合适的水平，以简化常规I+G生产工艺和工序投入。

本发明由如下技术方案实施：一种采用复合菌株发酵制备I+G的方法，将两株生产肌苷和鸟苷解淀粉芽孢杆菌菌株和一株用于肌苷/鸟苷磷酸化的大肠杆菌工程菌株进行如下处理，其中：

菌株信息如下：两株生产肌苷和鸟苷解淀粉芽孢杆菌菌株，编号分别为B.amyloliquefaciens G10和B.amyloliquefaciens 8311，一株用于肌苷/鸟苷磷酸化的大肠杆菌工程菌株，其编号为AP-03，以上菌株均受赠于廊坊梅花生物技术开发有限公司，廊坊梅花生物技术开发有限公司与申请人均为隶属于梅花生物科技集团股份有限公司的子公司，廊坊梅花生物技术开发有限公司主要负责菌种的研发。

处理步骤如下：S1.斜面培养；S2.一级种子培养；S3.二级种子培养；S4.复合培养；S5.大肠杆菌培养；S6.转化；其中：

S1.斜面培养：将两株解淀粉芽孢杆菌菌株以及一株大肠杆菌菌株分别接种于斜面培养基，斜面培养基组成为：酵母膏2-5g/L，蛋白胨5-10g/L，氯化钠5-10g/L，琼脂粉15-20g/L，pH＝7.0-7.2；于35-37℃培养箱内培养24-30h；该步骤用于微生物菌种的纯化和活化，保证菌种能从保藏状态尽快复苏恢复活性。

S2.一级种子培养：从S1.斜面培养完成的两种斜面培养基上刮取一环菌分别接种于两个摇瓶中，摇瓶内液体培养基30-100ml，液体培养基组成为：胰蛋白胨3-10g/L，酵母抽提物2-5g/L，氯化钠2-10g/L，pH＝7.0-7.2；培养条件为转速100-300rpm，温度35-37℃，待OD₆₀₀＝10-15时完成；该步骤是菌种少量放大扩培过程。

S3.二级种子培养：将S2.一级种子培养中得到的两株解淀粉芽孢杆菌一级种子液，按接种量5-10vol％(即种子体积占总发酵体积的百分比)分别接入两个二级种子罐中培养，二级种子所用培养基组成为：葡萄糖20-100g/L、酵母浸粉2-10g/L、玉米浆3-10g/L、蛋白胨1-5g/L、谷氨酸钠2-5g/L、硫酸镁1.0-2.5g/L、尿素0.5-2.0g/L、磷酸氢二钾0.2-1.0g/L、消泡剂0.2-0.5mL/L；二级种子罐培养条件为：罐压0.05-0.1Mpa，通气量10-15L/min，培养温度为35-37℃，转速200-500rpm，待OD₆₀₀＝20-40时完成；该步骤是菌种大量放大扩培过程。

S4.复合培养：将S3.二级种子培养中得到的两株解淀粉芽孢杆菌二级种子液按5-15vol％的接种比例接入发酵罐进行复合培养，复合发酵培养基组成为：葡萄糖30-100g/L、玉米浆5-30g/L、酵母浸粉2-15g/L、玉米浆水解液2-10g/L、硫酸铵3-15g/L、谷氨酸钠2-10g/L、硫酸镁1.0-4.0g/L、磷酸氢二钾1.0-4.0g/L、磷酸二氢钾0.5-2g/L、氯化钙0.5-2g/L、生物素0.02-0.1g/L、VB1 0.01-0.05g/L、硫酸锰0.001-0.005g/L、硫酸亚铁0.001-0.005g/L、消泡剂0.2-0.5mL/L；发酵条件控制：pH6.6-7.2，温度30-37℃，罐压0.05-0.1MPa，通气量10-30L/min，搅拌200-800rpm，通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌，使溶氧维持在30-40％，过程通过流加糖将底糖浓度控制在10-15g/L，培养60-80h，得到含有肌苷和鸟苷的发酵液；本专利流加糖为由50-80g/L葡萄糖配置而成、培养过程通过流加方式补充培养基中碳源的一种培养方式。底糖浓度应该为过程培养基质中的葡萄糖浓度，通过SBA--50生物传感器分析仪检测葡萄糖含量；该步骤将两株解淀粉芽孢杆菌接入同一发酵罐进行复合培养，由于不同菌株产苷代谢方式的不同，在培养过程会逐步积累各自代谢产物肌苷和鸟苷。

复合培养时，两种菌种接种量按接种比例与接种OD₆₀₀乘积确定，乘积之比为1：1左右。OD₆₀₀可间接反应发酵液中菌数含量，由于过程较难控制接种OD₆₀₀一致，因此需要调整接种比例保证所接菌种数量上基本相同。

S5.大肠杆菌培养：从大肠杆菌斜面培养基上刮取一环接种于摇瓶中，摇瓶内液体培养基30-100ml，液体培养基组成为：胰蛋白胨2-10g/L，酵母抽提物1-5g/L，氯化钠2-10g/L，pH＝7.0-7.2；培养条件为转速100-300rpm，温度32-35℃；当OD₆₀₀＝10-15时，将摇瓶接种至发酵罐中进行培养，培养基组成为：葡萄糖20-100g/L、酵母浸粉2-10g/L、玉米浆5-30g/L、硫酸铵1-5g/L、磷酸氢二钾1.0-4g/L、硫酸镁0.1-0.6g/L、生物素0.02-0.1g/L、VB10.01-0.05g/L、消泡剂0.2-0.5mL/L；发酵条件控制：pH 6.6-7.2，温度28-35℃，罐压0.05-0.1MPa，通气量10-20L/min，搅拌200-500rpm，通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌，使溶氧维持在40-50％；当OD₆₀₀＝20-30时通过加入IPTG诱导进行酸性磷酸化酶的表达，OD₆₀₀＝80-120结束发酵，得到大肠杆菌发酵液；IPTG，全称异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，是一种作用较强的诱导剂，其可诱导酶/蛋白的表达。本专利中可诱导酸性磷酸化酶的表达。

IPTG储备液的制备：2gIPTG溶于10ml蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1ml/份，-20℃保存备用；

该步骤中，大肠杆菌为工程菌，其在IPTG诱导后能产生核苷磷酸化酶。

S6.转化：将S4.复合培养中得到的含有肌苷和鸟苷的发酵液接入发酵罐中，调节pH至3.5-5.5；而后在发酵罐中按肌苷和鸟苷总重量的1-3倍添加多聚磷酸盐，最后在发酵罐中按10-20vol％接种比例接入S5.大肠杆菌发酵液，28-37℃转化10-15h，使肌苷与鸟苷转化成肌苷酸与鸟苷酸，得到含有I+G的转化液；该步骤中，大肠杆菌工程菌产生的核苷磷酸化酶能将多聚磷酸盐上的磷酸基团转移到肌苷和鸟苷上形成肌苷酸和鸟苷酸。

经转化后得到的含有I+G的转化液，经过后续的进一步分离提取，可得到I+G成品。

进一步的，所述S6.转化中，用盐酸或硫酸中调节含有肌苷和鸟苷的发酵液的pH值。

进一步的，所述S6.转化中，多聚磷酸盐为焦磷酸钠、三聚磷酸钠、六偏磷酸钠中的任意一种或组合。

本发明的优点：

1、本发明替代了传统化学磷酸化法生产呈味核苷酸过程，简化了常规I+G生产工艺，也解决了现有发酵工艺中存在的如下问题：科研人员通过诱变育种或工程菌改造等方式，获得可大量积累某一种呈味核苷酸或核苷的生产菌株，而后经过一系列发酵工艺、转化条件和提取工艺优化，获得纯度较高的单一核苷或核苷酸成品，最后按照一定比例将两种呈味核苷酸予以混合得到含有I+G的转化液。在上述生产过程中，IMP和GMP经过发酵工艺优化、单一成品的提取分离、核苷磷酸化及成品混合等诸多过程。整体工艺相对冗长复杂、在资源和设备等方面投入较大，不利于I+G产品国际竞争力的提升。

2、本发明利用了呈味核苷酸IMP和GMP主体代谢途径基本相同的特点，生产的菌种均为解淀粉芽孢杆菌突变株，采取混菌培养的方式，同时培养两种能生产肌苷和鸟苷生产菌株，配以合适的发酵和转化控制工艺，就可以实现在发酵液中同时积累两种核苷的目的，进一步通过大肠杆菌对核苷酶法转化就可得到相应的核苷酸。这一生产方法的好处是简化常规I+G生产工艺，降低了单独生产过程中工序的投入，节省大量人工和资源成本，为开发I+G生产新工艺创造了可能，带来可观的经济效益。

附图说明

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为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例3得到的转化液的液相峰图；

图2为实施例3得到的转化液的晶体结构图(x60倍)。

具体实施方式

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下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中，首先配备两株解淀粉芽孢杆菌菌株的种子液和大肠杆菌发酵液；

两株解淀粉芽孢杆菌菌株的种子液的制备方法是先将两株解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens G10和B.amyloliquefaciens 8311分别接种于斜面培养基，斜面培养基组成为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，pH＝7.0-7.2；于35-37℃培养箱内培养25h；而后在两种斜面培养基上刮取一环菌分别接种于两个摇瓶中，摇瓶内液体培养基50ml，液体培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0-7.2；培养条件为转速200rpm，温度35-37℃，培养25h，测OD₆₀₀＝12，两株解淀粉芽孢杆菌一级种子液按接种量10vol％分别接入两个二级种子罐中培养，二级种子所用培养基组成为：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、玉米浆10g/L、蛋白胨5g/L、谷氨酸钠5g/L、硫酸镁2.5g/L、尿素2.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、消泡剂0.3mL/L；二级种子罐培养条件为：罐压0.08MPa，通气量12L/min，培养温度为35-37℃，转速300rpm，培养15h测OD₆₀₀＝34，得到两株解淀粉芽孢杆菌菌株的种子液，待用。其中，消泡剂为美国陶氏DF-103聚醚消泡剂。

大肠杆菌发酵液的制备方法是：将一株大肠杆菌菌株接种于斜面培养基，斜面培养基组成为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，pH＝7.0-7.2；于35-37℃培养箱内培养25h；从大肠杆菌斜面培养基上刮取一环接种于摇瓶中，摇瓶内液体培养基50ml，液体培养基组成为：胰蛋白胨5g/L，酵母抽提物3g/L，氯化钠5g/L，pH＝7.0-7.2；培养条件为转速200rpm，温度32-35℃；当OD₆₀₀＝13时，将摇瓶接种至发酵罐中进行培养，培养基组成为：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、玉米浆30g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾4g/L、硫酸镁0.6g/L、生物素0.1g/L、VB1 0.05g/L、消泡剂0.3mL/L，其余为水。发酵条件控制：pH 7.0，温度35℃，罐压0.05-0.1MPa，通气量10-20L/min，搅拌300rpm，通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌，使溶氧维持在45％。当OD₆₀₀＝25加入IPTG降温至30℃进行酸性磷酸化酶的诱导表达，分别到OD₆₀₀＝80、100、120、150结束发酵，得到OD₆₀₀＝80、100、120、150的四种大肠杆菌发酵液待用。

实验例1解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens G10单独发酵

将解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens G10种子液按10vol％的接种量接入发酵罐中。发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L、玉米浆30g/L、酵母浸粉15g/L、玉米浆水解液10g/L、硫酸铵15g/L、谷氨酸钠10g/L、硫酸镁4.0g/L、磷酸氢二钾4g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙2g/L、生物素0.1g/L、VB1 0.05g/L、硫酸锰0.005g/L、硫酸亚铁0.005g/L、消泡剂0.3mL/L，其余为水。发酵条件控制：pH 6.8，温度37℃，罐压0.05-0.1MPa，通气量20L/min，搅拌500rpm，通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌，使溶氧维持在35％，过程通过流加糖将底糖浓度控制在12g/L。80h发酵结束后用盐酸调节发酵液至pH至4.2，按发酵液的2倍重量添加焦磷酸钠，最后按15％接种比例将OD₆₀₀＝120大肠杆菌发酵液接入发酵罐中，30℃转化15h，得到转化液。

本实验例重复3次，发酵结束利用HPLC测定发酵液中的IMP和GMP含量，发酵指标见下表1。

实验例2解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens 8311单独发酵

将解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens 8311种子液按10％的接种量接入发酵罐中。发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L、玉米浆30g/L、酵母浸粉15g/L、玉米浆水解液10g/L、硫酸铵15g/L、谷氨酸钠10g/L、硫酸镁4.0g/L、磷酸氢二钾4g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙2g/L、生物素0.1g/L、VB1 0.05g/L、硫酸锰0.005g/L、硫酸亚铁0.005g/L、消泡剂0.3mL/L，其余为水。发酵条件控制：pH 6.8，温度37℃，罐压0.05-0.1MPa，通气量10-30L/min，搅拌200-800rpm，通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌，使溶氧维持在35％，过程通过流加糖将底糖浓度控制在12g/L。80h发酵结束后用盐酸调节发酵液至pH至4.2，按肌苷和鸟苷比例的2倍添加焦磷酸钠，最后按15％接种比例将OD₆₀₀＝120大肠杆菌发酵液接入发酵罐中，30℃转化15h，得到转化液。

本实验例重复3次，发酵结束利用HPLC测定发酵液中的IMP和GMP含量，发酵指标见下表1。

实施例3解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens G10与解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens8311复合发酵

将解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens G10与解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens 8311种子液均按10％的接种量接入同一发酵罐中，解淀粉芽孢杆菌与大肠杆菌发酵培养基及过程控制工艺与实验例1相同。80h发酵结束后用盐酸调节发酵液至pH至4.2，按肌苷和鸟苷比例的2倍添加焦磷酸钠，最后按15％接种比例将OD₆₀₀＝120大肠杆菌发酵液接入发酵罐中，30℃转化15h，得到转化液。

本实施例重复3次，发酵结束利用HPLC测定发酵液中的IMP和GMP含量，发酵指标见下表1。选取一次的转化液进行液相峰图和晶体结构检测，晶体检测手段为利用OLYMPUSCX-40显微镜进行放大观察晶体结构，检测目的为对比和区分IMP和GMP晶型大小及结构。结果如图1和图2所示。

实施例4解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens G10与解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens 8311复合发酵

将解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens G10与解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciens 8311种子液均按15％的接种量接入同一发酵罐中，解淀粉芽孢杆菌与大肠杆菌发酵培养基及过程控制工艺与实验例1相同。80h发酵结束后用盐酸调节发酵液至pH至4.2，按肌苷和鸟苷比例的2倍添加三聚磷酸钠，最后按20％接种比例将OD₆₀₀＝80大肠杆菌发酵液接入发酵罐中，32℃转化15h，得到转化液。