阅读说明：本技术 一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法 (Method for preparing 5' -guanylic acid by enzyme method ) 是由 张玲 夏海洋 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法,属于食品加工技术领域。所述制备方法包括：以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酸性磷酸转移酶突变体纯酶为催化剂,添加到含有鸟苷和焦磷酸钠的pH为3.6～9.0的反应溶液中,在25～60℃条件下进行催化反应,反应结束后,获得含5’-鸟苷酸的混合液,再经分离纯化获得5’-鸟苷酸。本发明选用的酸性磷酸转移酶突变体具有磷酸转移酶活性高,水解酶活性低,底物特异性高的优点；方法工艺环保,反应条件温和,成本低,得到的目标产物收率高,制备方法简单,适用于5’-鸟苷酸的工业化生产,应用前景广阔。(The invention discloses a method for preparing 5' -guanylic acid by an enzymatic method, belonging to the technical field of food processing. The preparation method comprises the following steps: adding pure acid phosphotransferase mutant enzyme with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO.1 as a catalyst into a reaction solution containing guanosine and sodium pyrophosphate and having a pH value of 3.6-9.0, carrying out catalytic reaction at 25-60 ℃, obtaining a mixed solution containing 5 '-guanylic acid after the reaction is finished, and separating and purifying to obtain the 5' -guanylic acid. The acid phosphotransferase mutant selected by the invention has the advantages of high phosphotransferase activity, low hydrolase activity and high substrate specificity; the method has the advantages of environment-friendly process, mild reaction conditions, low cost, high yield of the obtained target product, simple preparation method, suitability for industrial production of 5' -guanylic acid and wide application prospect.)

一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法。

背景技术

5’-鸟苷酸(Guanosine-5’-monophosphate即5’-GMP)是广泛应用于食品的核苷酸类调味料，在食品加工过程中，将其与谷氨酸钠搭配使用，构成食品基本的调味料，具有显著增鲜效果，因此也被称为呈味核苷酸。目前呈味核苷酸的生产方法主要有四种：化学合成法、微生物发酵法、酶解法、生物催化法。

化学合成法主要是利用核苷为原料进行磷酸酯化反应。常用的磷酸化试剂主要是磷酸或焦磷酸的活性衍生物，如焦磷酸酰氯、双-对硝基苯焦磷酸、磷酸的一氯和二氯衍生物等，而工业上广泛采用的是三氯氧化磷。要在核苷的5’位羟基上导入磷酸基而得到5’-核苷酸，需在磷酸化反应前预先用保护基保护核苷上核糖的2’和3’位羟基，待磷酸化完成后脱去保护基。因采用了保护、去保护步骤使得此种方法的反应整体产率下降。化学合成法所用到的试剂即昂贵又有毒性，因此一般用于生产一些有特殊用途的5’-核苷酸及其衍生物，用于工业化生产有一定的难度。

微生物发酵法分为一步法和二步法。一步法即直接发酵法：利用微生物发酵直接生产5’-肌苷酸和5’-黄苷酸。二步法指发酵法和化学法相结合的方法：先采用微生物发酵生产核苷，再经化学法使之磷酸化，最后得到5’-肌苷酸和5’-鸟苷酸。微生物发酵法副产物少，成本低，但其应用受到微生物特性的很大限制。

酶解法已成为制备各种天然核苷酸的经典方法，此法历史最长、技术也最成熟，目前大部分的核苷酸是采用酶解法来生产的。酶解法制备核苷酸一次即可以得到4种核苷酸的混合物，酶的利用率较高，但是在后期要提取得到4种高纯度产品的难度很大，使得生产周期长，分离纯化工艺繁琐，产品纯度不高。

生物催化法：生物催化核苷磷酸化法，主要是利用生物酶催化。目前，可用于催化5’-鸟苷酸合成的酶主要是激酶、酸性磷酸转移酶(AP/PTase)等。

激酶是一类可将来自ATP的磷酸基转移到别的磷酸受体的磷酸转移酶，可用于合成多种5’-核苷酸，反应式为：ATP+核苷＝ADP+5’-核苷酸。此方法的不足之处是在催化过程中需要一直消耗ATP，所以必须同时培养可再生反应中消耗的ATP的微生物或者添加大量的价格较高的ATP来完成反应，成本较高，使得此法受到限制。

以酸性磷酸转移酶催化鸟苷与磷酸基团供体合成5’-鸟苷酸，具有简单、高效、周期短、成本低、符合环保要求等特点，适合工业化生产，相对以上公开的制备5’-鸟苷酸的工艺展现了较大的发展潜力。目前，我国发酵法生产鸟苷技术成熟，已经实现工业化，以此为基础进一步开发生产5’-鸟苷酸的关键是如何实现酶催化鸟苷的特异性磷酸化。因此，急需一种操作简便、安全，成本低廉，产物纯度高且环境友好的生产工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够特异性催化鸟苷磷酸化的酸性磷酸转移酶，用于酶法制备5’-鸟苷酸，并提供一种操作简单、安全、反应条件温和，生产成本低，收率和纯度高，适于工业化生产的生产工艺。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酸性磷酸转移酶突变体在催化鸟苷制备5’-鸟苷酸中的应用。

所述酸性磷酸转移酶突变体是对来源于Morganella morganii的酸性磷酸转移酶(AP/PTase)进行改造后获得，具体改造方法为：以Genebank公布的酸性磷酸转移酶原始氨基酸序列(Genebank索取号P28581)，去除前20个氨基酸序列，并对其中的2个氨基酸位点进行定点突变(G72D、I151T)。

本发明研究表明，经改造后的酸性磷酸转移酶突变体对催化鸟苷表现出较高的底物特异性，而且具有磷酸转移酶活性高，水解酶活性低的特点，能够有效转化鸟苷合成5’-鸟苷酸。其反应式如下：

反应式中，Acid Phosphotransferase为酸性磷酸转移酶；Acid Phosphatase为酸性磷酸水解酶。所述的酸性磷酸转移酶突变体具有双向作用。

本发明还提供了所述酸性磷酸转移酶突变体的编码基因，根据大肠杆菌密码子频率进行密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法，包括：以氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的酸性磷酸转移酶突变体纯酶为催化剂，添加到含有鸟苷和焦磷酸钠的pH为3.6～9.0的反应溶液中，在25～60℃条件下进行催化反应，反应结束后，获得含5’-鸟苷酸的混合液，再经分离纯化获得5’-鸟苷酸。

作为优选，在反应体系中，鸟苷的浓度为1～20mg/mL，焦磷酸钠的浓度为150～300mg/mL，酸性磷酸转移酶突变体纯酶的浓度为20～120μg/mL。更为优选，在反应体系中，鸟苷的浓度为1mg/mL，焦磷酸钠的浓度为150mg/mL，酸性磷酸转移酶突变体纯酶的浓度为20μg/mL，此条件下鸟苷的摩尔转化率达到97％。

作为优选，所述反应溶液中采用pH为3.6～5.8的乙酸钠缓冲液作为反应介质。

更为优选，所述反应介质为pH为4.0的乙酸钠缓冲液。研究表明，所述酸性磷酸转移酶突变体催化5’-鸟苷酸合成速率最快的pH条件为4.0，此pH值为该酶最适反应pH。

作为优选，催化反应的温度为25～40℃。更为优选，催化反应的温度为35℃。研究表明，所述酸性磷酸转移酶突变体催化5’-鸟苷酸合成速率最快的温度条件为35℃。

作为优选，催化反应的时间为6～8h。研究表明，催化反应的初始阶段，随着反应时间的延长，反应产物5’-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，到达6～8h时，5’-鸟苷酸的浓度达到最高。

作为优选，所述酸性磷酸转移酶突变体纯酶的制备方法，包括：以含酸性磷酸转移酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，25℃诱导10～12h，收集菌体，再经超声破碎获得细胞裂解液，离心取上清液，进一步分离纯化获得所述酸性磷酸转移酶突变体纯酶。

本发明的方法不仅适用于5’-鸟苷酸的制备，还可通用于5’-单磷酸核苷酸酯类化合物的制备。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明通过采用新的酶法工艺制备5’-鸟苷酸，成功解决了现有工艺中存在的技术问题，选用的酸性磷酸转移酶突变体具有磷酸转移酶活性高，水解酶活性低，底物特异性高的优点；制备方法简单，大大简化了5’-鸟苷酸工业化生产步骤，成功解决了现有化学合成工艺中存在的原料毒性、工艺复杂等技术问题。

(2)原料来源广泛，对设备要求低。

(3)本发明的方法工艺环保，反应条件温和，成本低，得到的目标产物收率高，适用于5’-鸟苷酸的工业化生产，应用前景广阔。

附图说明

图1为酸性磷酸转移酶纯化电泳图，其中M为蛋白Marker，泳道1为全细胞，泳道2为细胞破碎后上清液，泳道3为细胞破碎后沉淀，泳道4为纯化后的蛋白。

图2为pH值对酸性磷酸转移酶催化性能的影响。

图3为温度对酸性磷酸转移酶催化性能的影响。

图4为不同底物浓度下磷酸转移酶活性研究。

图5为10mg/mL、20mg/mL鸟苷浓度下磷酸转移酶活性放大研究。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明技术方案及其效果做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明的内容，并不用于限制本发明的保护范围。应用本发明的构思对本发明进行的简单改变都在本发明要求保护的范围内。

以下的实施例中，除非特别说明，所有原料均来自市售。

鸟苷购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

表达载体pET28a和大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自invitrogen公司。

实施例1酸性磷酸转移酶突变体的获得

表达酸性磷酸转移酶的重组大肠杆菌的构建：

以Genebank公布的酸性磷酸转移酶原始氨基酸序列(AP/PTase，Genebank索取号P28581)，去除前20个氨基酸序列，对其中的2个氨基酸位点(G72D、I151T)设计突变，根据大肠杆菌密码子频率并进行密码子优化，在优化后核苷酸序列通过全基因合成的方式获得到目的片段，将目标片段***表达载体pET28a上NdeI位点与BamHI位点之间构建重组表达质粒；重组表达质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达宿主中，测试目标蛋白表达。

菌体的获得：

含上述酸性磷酸转移酶重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜后，按2％接种量接种到新的含相应抗生素的LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD＝0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，25℃诱导过夜；10000rpm离心15min，收集菌体-20℃下冷冻保藏备用。

纯酶的获得:

取离心收集得到的菌体，将菌体置于pH为8.0，50mM的磷酸盐缓冲液中重悬后，进行超声破碎(在冰水浴中超声15-30min，每次超声时间为2s，间隔4s)获得细胞裂解液。12000rpm，4℃，离心10min，取上清液作为粗酶液，用Ni-NTA亲和层析一步纯化，洗脱下来的目标蛋白透析去除高浓度的盐，酸性磷酸转移酶纯化电泳图如图1所示，酸性磷酸转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。-80℃下冷冻保藏待用。

实施例2磷酸转移酶突变体底物特异性研究

向分别含2.5mg/mL鸟苷、肌苷、胞苷、腺苷、尿苷，150mg/mL焦磷酸钠的反应体系中添加实施例1制得的酸性磷酸转移酶纯酶20μg/mL，然后在30℃及pH4.0下反应10min后，2MHCl终止反应，离心取上清稀释10倍，HPLC测定相对酶活，结果如表1所示。该磷酸酶对鸟苷和肌苷具有高的底物特异性。

表1酸性磷酸转移酶对底物的特异性研究

实施例3磷酸转移酶突变体反应动力学测定

以双倒数作图法，测定实施例1制得的酸性磷酸转移酶对鸟苷、5’-鸟苷酸、肌苷、5’-肌苷酸的K_m和V_max值，结果如表2所示，结果表明该酸性磷酸酶具有较高的磷酸转移酶活性和较低的水解酶活性，有利于合成鸟苷酸。

表2酸性磷酸转移酶动力学研究

实施例4确定磷酸转移酶突变体最适反应pH值

向含2.5mg/mL鸟苷，150mg/mL焦磷酸钠的反应体系中添加实施例1制得的酸性磷酸转移酶纯酶20μg/mL，然后在30℃及不同pH(3.6-9.0)下反应10min后，2M HCl终止反应，离心取上清稀释10倍，HPLC测定5’-鸟苷酸的浓度，以检测不同pH对纯酶催化合成5’-鸟苷酸的影响。结果如图2所示，5’-鸟苷酸的合成速率最快条件pH为4.0，此pH值为该酶最适反应pH，并且显示该酶为酸性磷酸酶。

实施例5确定磷酸转移酶突变体最适反应温度

向含2.5mg/mL鸟苷，150mg/mL焦磷酸钠的反应体系中添加实施例1制得的酸性磷酸转移酶纯酶20μg/mL，然后在pH4.0及不同温度(25-60℃)下反应10min后，2M HCl终止反应，离心取上清稀释10倍，HPLC测定5’-鸟苷酸的浓度，以检测不同温度对纯酶催化合成5’-鸟苷酸的影响。结果如图3所示，5’-鸟苷酸的合成速率最快的温度条件为35℃，该温度为该酶反应最适温度。

实施例6不同底物浓度下磷酸转移酶活性研究

向分别含1mg/mL、2.5mg/mL、4mg/mL、5.5mg/mL鸟苷，150mg/mL焦磷酸钠的反应体系中添加实施例1制得的酸性磷酸转移酶纯酶20μg/mL，然后在最佳pH4.0及最佳温度35℃条件下进行催化反应，0.5h、1h、2h、4h、6h、24h取样，2M HCl终止反应，离心取上清稀释10倍，HPLC测定5’-鸟苷酸的浓度，检测结果如图4所示，0.5h-6h内，随着反应时间的延长，5’-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，到达6h，5’-鸟苷酸的浓度达到最高6h后，5’-鸟苷酸的浓度开始降低，到达24h时，5’-鸟苷酸的浓度仍保持在一定水平，表明本发明所选用的突变菌株具有较高的磷酸转移酶活性较低的水解酶活性，可用于制备5’-鸟苷酸。并且鸟苷浓度1mg/mL时，鸟苷酸的摩尔转化率达到97％。

实施例7 10mg/mL鸟苷浓度下磷酸转移酶活性放大研究

向含10mg/mL鸟苷，200mg/mL焦磷酸钠的反应体系中添加实施例1制得的酸性磷酸转移酶纯酶60μg/mL，然后在最佳pH4.0及最佳温度35℃条件下进行催化反应，1h、2h、3h、4h、6h、8h、24h取样，2M HCl终止反应，离心取上清稀释10倍，HPLC测定5’-鸟苷酸的浓度，检测结果如图5所示，1h-8h内，随着反应时间的延长，5’-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，到达8h，5’-鸟苷酸的浓度达到最高为8.5mg/mL，8h后，5’-鸟苷酸的浓度开始降低，到达24h时，5’-鸟苷酸的浓度为6.7mg/mL，表明本发明所选用的突变菌株具有较高的磷酸转移酶活性较低的水解酶活性，可用于制备5’-鸟苷酸。

实施例8 20mg/mL鸟苷浓度下磷酸转移酶活性放大研究

向含20mg/mL鸟苷，250mg/mL焦磷酸钠的反应体系中添加实施例1制得的酸性磷酸转移酶纯酶120μg/mL，然后在最佳pH4.0及最佳温度35℃条件下进行催化反应，1h、2h、3h、4h、6h、8h、24h取样，2M HCl终止反应，离心取上清稀释10倍，HPLC测定5’-鸟苷酸的浓度，检测结果如图5所示，1h-8h内，随着反应时间的延长，5’-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，到达8h，5’-鸟苷酸的浓度达到最高为13.4mg/mL，8h后，5’-鸟苷酸的浓度开始降低，到达24h时，5’-鸟苷酸的浓度为10.9mg/mL，表明本发明所选用的突变菌株具有较高的磷酸转移酶活性较低的水解酶活性，可用于制备5’-鸟苷酸。

序列表

<110> 台州学院

<120> 一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Tyr

1 5 10 15

Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu Leu Pro Pro Pro

20 25 30

Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln Ala Met Tyr Glu

35 40 45

Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys Gln Ala Gln Ala

50 55 60

Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Asp Val Ala Thr Ala Phe Ser Gly Ala

65 70 75 80

Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu Leu Tyr Lys Leu

85 90 95

Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala Thr Arg Ser Ala

100 105 110

Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe Tyr Gly Thr Glu

115 120 125

Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr Asn Gly Ser Tyr

130 135 140

Pro Ser Gly His Thr Ser Thr Gly Trp Ala Thr Ala Leu Val Leu Ala

145 150 155 160

Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu Arg Gly Tyr Gln

165 170 175

Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp Gln Ser Asp Val

180 185 190

Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala Thr Leu His Ser

195 200 205

Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys Gln Glu Phe Ala

210 215 220

Gln Lys Ser Gln Lys

225

<210> 2

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaattccgg caggtaacga tgcaaccact aaaccggatc tgtactacct gaaaaacgaa 60

caggcgattg attctctgaa actgctgccg ccgccgccgg aagttggttc tatccagttc 120

ctgaacgatc aagcgatgta cgaaaaaggc cgtatgctgc gtaacactga acgtggtaaa 180

caggctcaag ctgatgctga tctggctgct ggtgatgtgg caaccgcctt ctccggtgcg 240

tttggctatc cgatcaccga aaaagattct ccggaactgt ataaactgct gactaatatg 300

atcgaagatg cgggtgatct ggcgacccgt agcgcgaaag aacattacat gcgtatccgt 360

ccgttcgcgt tctacggcac cgaaacctgc aacaccaaag atcagaaaaa actgagcacc 420

aacggcagct acccgagcgg ccacaccagc accggctggg cgaccgcgct ggttctggcg 480

gaagttaacc cggcgaacca ggatgcgatc ctggaacgtg gctaccagct gggccagagc 540

cgtgttatct gcggctacca ctggcagagc gatgttgatg cggcgcgtat cgttggtagc 600

gcggcggttg cgaccctgca cagcgatccg gcgttccagg cgcagctggc gaaagcgaaa 660

caggaattcg cgcagaaaag ccaaaaataa 690