具体实施方式

下面参考附图描述示例实施例。在不脱离本公开的精神和教导的情况下，许多不同的形式和实施例是可能的，并且因此本公开不应被解释为限于本文阐述的示例实施例。相反，提供这些示例实施例是为了使本公开将是全面和完整的，并将本公开的范围传达给本领域技术人员。在附图中，为了清楚起见，层和区域的尺寸和相对尺寸可能被放大。在整个说明书中，相同的附图标记指代相同的元件。

除非另有定义，否则本文使用的所有术语（包括技术和科学术语）具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。还应当理解，术语（诸如在常用词典中定义的那些术语）应当被解释为具有与它们在本申请和相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且不应当以理想化或过度正式的意义来解释，除非在本文中明确定义。在本文中在本发明的描述中使用的术语仅仅是为了描述特定的实施例的目的，并且不是为了限制本发明。虽然在本公开的实践中可以使用与本文描述的方法和材料相似或等同的数种方法和材料，但是本文仅描述了某些说明性的材料和方法。

本文提及的所有公开、专利申请、专利或其他参考文献通过引用整体并入本文。在术语有冲突的情况下，以本说明书为准。

本公开的各个方面，包括装置、系统、方法等，可以参考一个或多个说明性实施方式来说明。如本文所使用的，术语“示例性”和“说明性”意味着“用作示例、实例或说明”，并且不应该被解释为比本文公开的其他实施方式更优选或更有利。另外，对本公开或发明的“实施方式”或“实施例”的引用包括对其一个或多个实施例的具体引用，并且反之亦然，并且旨在提供说明性示例而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求而不是由以下描述来指示。

应当注意的是，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物，除非内容另有明确规定。因此，例如，对“片状材料（tile）”的引用包括一个、两个或更多个片状材料。类似地，除非内容和/或上下文另有明确指示，否则对多个指代物的引用应被解释为包括单个指代物和/或多个指代物。因此，提及“片状材料”不一定需要多个这样的片状材料。相反，应理解，独立于连接词；本文考虑了一个或多个片状材料。

此外，如本文所使用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当在替代方案中解释时缺少组合（“或”）。

如本申请通篇所使用的，词语“可以”和“可”在许可的意义上使用（即，意味着具有……的可能性），而不是强制意义（即，意味着必须）。另外，术语“包括”、“具有”、“涉及”、“包含”、“特征在于”及其变型（例如，“包括”、“具有”、“涉及”、“包含”等）、以及包括权利要求在内的如本文中使用的类似术语应该是包含性的和/或开放式的，应该具有与单词“包括”及其变型相同的含义（例如，“包括”和“包含”），并且说明性地不排除附加的、未列举的元件或方法步骤。

如本文所使用的，方向和/或任意术语，诸如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“内”、“外”、“内部”、“外部”、“内部的”、“外部的”、“近”、“远”、“前”、“后”等，可以仅用于指示相对方向和/或取向，并且不旨在以其他方式限制本公开的范围，包括说明书、发明和/或权利要求。

应当理解，当元件被称为“耦合到”、“连接到”或“响应于”另一个元件或“在另一个元件上”时，它可以直接耦合到、连接到或响应于另一个元件或在另一个元件上，或者也可以存在中间元件。相反，当元件被称为“直接耦合到”、“直接连接到”、“直接响应于”或“直接在”另一个元件上时，不存在中间元件。

本发明概念的说明性实施例在本文中参考横截面图示进行描述，该横截面图示是示例性实施例的理想化实施例（和中间结构）的示意图。这样，由于例如制造技术和/或公差的原因，可以预期图示形状的变化。因此，本发明概念的示例性实施例不应被解释为限于本文所示区域的特定形状，而是包括例如由制造导致的形状偏差。因此，附图中所示的区域本质上是示意性的，并且它们的形状不旨在图示装置区域的实际形状，且不旨在限制示例实施例的范围。

应当理解，尽管术语“第一”、“第二”等在本文中可以用于描述各种元件，但是这些元件不应被这些术语所限制。这些术语仅用于区分一种元件与另一种元件。因此，“第一”元件可以被称为“第二”元件，而不脱离本实施例的教导。

还应当理解，在不脱离本公开的范围的情况下，本文描述的各种实施方式可以与描述或公开的任何其他实施方式结合利用。因此，在不脱离本公开的范围的情况下，根据本公开的某些实施方式的产物、构件、元件、装置、设备、系统、方法、过程、组合物和/或试剂盒可以包含、并入或以其他方式包括在本文公开的其他实施方式（包括系统、方法、设备和/或类似物）中描述的性质、特征、部件、构件、元件、步骤和/或类似物。因此，与一个实施方式相关的特定特征的引用不应被解释为仅限于该实施方式内的应用。

本文使用的标题仅用于组织目的，并且不意味着用于限制说明书或权利要求的范围。为了便于理解，在可能的情况下，使用相同的附图标记来表示附图中相同的元件。此外，在可能的情况下，在各种图中使用了相同的元件编号。此外，特定元件的替代配置可以各自包括附加到元件编号的单独字母。

本文使用的术语“大约”是指近似、在……的区域内、大致或大约。当术语“大约”与数值范围结合使用时，它通过将边界延伸到所述数值之上和之下来修饰该范围。一般而言，术语“大约”在本文中用于修饰高于和低于所述值5%方差的数值。当表达这样的范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“大约”将值表达为近似值时，将理解的是特定值形成另一个实施例。还将理解的是，范围中的每一个的端点既关于另一个端点重要，且独立于另一个端点重要。

如本文使用的词语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。

“样品”意指动物；来自动物的组织或器官；细胞（在受试者体内、直接取自受试者、或保持在培养物中的细胞、或取自培养的细胞系的细胞）；细胞裂解物（或裂解物部分）或细胞提取物；含有来源于细胞、细胞材料或病毒材料的一种或多种分子的溶液（例如，多肽或核酸）；或者含有非天然存在的核酸、药物或药品和药物加工前体的溶液（例如，生物制品、药物、注入剂、生物反应器部件等），其可以如本文所述进行测定。样品也可以是任何体液或排泄物（例如，但不限于，血液、尿液、粪便、唾液、眼泪、胆汁或脑脊液），其可以包含或不包含宿主或病原体细胞、细胞成分或核酸。样品还可包括环境样品，诸如但不限于土壤、水（淡水、废水等）、空气监测系统样品（例如，空气过滤介质中捕获的材料）、表面拭子和载体（例如，蚊子、蜱、跳蚤等）。

如本文使用的短语“核酸”是指天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是DNA或RNA或DNA-RNA杂交体、单链或双链、有义或反义的，其能够通过沃森-克里克碱基配对与互补核酸杂交。本发明的核酸还可以包括核苷酸类似物（例如，BrdU）和非磷酸二酯核苷间键（例如，肽核酸（PNA）或硫代二酯键）。特别地，核酸可以包括但不限于，DNA、RNA、mRNA、rRNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或它们的任何组合。

“探针”、“引物”或“寡核苷酸”意指具有限定序列的单链核酸分子，其可以与含有互补序列的第二个核酸分子（“靶”）碱基配对。所得杂交体的稳定性取决于长度、GC含量和发生碱基配对的程度。碱基配对的程度受参数影响，所述参数诸如是探针和靶分子之间的互补程度和杂交条件的严格性程度。杂交严格性的程度受诸如温度、盐浓度和有机分子（诸如甲酰胺）的浓度的参数的影响，并由本领域技术人员已知的方法确定。探针、引物和寡核苷酸可以通过本领域技术人员熟知的方法进行放射性、荧光或非放射性的可检测地标记。dsDNA结合染料可用于检测dsDNA。应当理解，“引物”被特定地配置成由聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸”可以或可以不如此配置。

“dsDNA结合染料”意指当与双链DNA结合时比当与单链DNA结合或在溶液中游离时发出不同荧光的染料，通常是通过发出更强的荧光。虽然参考了dsDNA结合染料，但是应当理解，本文可以使用任何合适的染料，其中一些非限制性的说明性染料在美国专利号7,387,887有所描述，其通过引用并入本文。其他产生信号的物质可以用于检测核酸扩增和解链，说明性地，如本领域已知的酶、抗体等。

“特异性杂交”意指探针、引物或寡核苷酸在高严格性条件下识别并与基本互补的核酸（例如样品核酸）发生物理相互作用（即碱基配对），并且基本上不与其他核酸发生碱基配对。

“高严格性条件”意指通常发生在大约解链温度（Tm）减去5℃（即，低于探针Tm以下5℃）。在功能上，高严格性条件用于识别具有至少80%序列同一性的核酸序列。

如本文所用，术语“规范序列”（术语“共有序列”是同义的，并且也是本领域常用的）是指在序列比对中每个位置处发现的最常见核苷酸残基的计算顺序。规范序列代表多重序列比对的结果，在多重序列比对中，将相关序列相互比较，并计算相似的序列基序。本文提到的面板通常被设计成检测一组生物体。对于一面板中的每个生物体，该生物体的已知变异体在由该面板扩增的扩增子中通常具有一些序列差异。因此，对于大多数测定来讲，提及一种病原体序列通常是不准确的，因为该面板中的每种病原体代表一群密切相关的序列变异体。因此，给定生物体的扩增子代表检测群体中的所有变异体——即，规范序列。虽然术语“规范序列”通常可能更准确，但术语“病原体序列”在本文中用作同义词。虽然许多测定使用规范序列，但一些分析可能使用天然序列，特别是在特定靶序列的内含品系之间几乎没有差异的情况下。术语“规范序列”也意指包括这样的序列。

虽然PCR是本文示例中使用的扩增方法，但应理解，使用引物的任何扩增方法都是合适的。这种合适的程序包括聚合酶链式反应（PCR）；链置换扩增（SDA）；基于核酸序列的扩增（NASBA）；级联滚环扩增（CRCA），环介导等温扩增DNA（LAMP）；等温和嵌合引物引发的核酸扩增（ICAN）；基于靶的解旋酶依赖性扩增（HDA）；转录介导的扩增（TMA）等。因此，当使用术语PCR时，应理解为包括其他替代的扩增方法。对于没有离散循环的扩增方法，可以使用反应时间，其中以循环、倍增时间或交叉点（Cp）进行测量，并且在本文所述的实施例中增加附加的PCR循环时，可以增加附加的反应时间。应当理解，可能需要相应地调整方案。

如本文所使用的，术语“交叉点”（Cp）（或者，替代地循环阈值（Ct）、定量循环（Cq）或本领域中使用的同义术语）是指获得高于给定PCR产物（例如，靶或内部标准）的某个阈值的荧光信号所需的PCR循环数，如由实验确定的。每个反应上升到高于阈值的循环取决于PCR反应的开始时存在的靶（即，反应模板）量。阈值通常可以设置在产物的荧光信号高于背景荧光的可检测的点；然而，也可以采用其他阈值。作为设置某个任意阈值的替代方案，Cp可以通过计算一阶、二阶或n阶导数在其处具有其最大值的反应点来确定，这决定了扩增曲线曲率在其处最大的循环。美国专利号6,303,305教导了一种说明性的衍生方法，其全部内容通过引用并入本文。尽管如此，阈值设置在哪里或如何设置通常并不重要，只要相同的阈值用于被比较的所有反应。也可以使用本领域已知的其他点，并且在本文讨论的任何方法中，任何这样的点都可以代替Cp、Ct或Cq。

虽然本文的各种示例涉及人类靶和人类病原体，但是这些示例仅仅是说明性的。本文所述的方法、试剂盒和装置可用于检测和测序来自各种各样的样品（包括人、兽、工业和环境样品）的各种各样的核酸序列。此外，尽管本文讨论了核酸扩增，但本文描述的方法、试剂盒和装置可用于使用需要原位密封的各种器皿的各种各样的反应。

本文公开的各种实施例使用独立的核酸分析袋来说明性在单个封闭系统中测定样品中各种生物物质（说明性地抗原和核酸序列）的存在。在美国专利号8,394,608;8,895,295;和10,464,060中更详细地公开了这种系统，包括袋和与袋一起使用的仪器，其全部内容通过引用并入本文。然而，应当理解，这种袋仅仅是说明性的，并且本文讨论的核酸制备和扩增反应可以使用如本领域已知的各种核酸纯化和扩增系统在本领域已知的多种开放或封闭系统样品器皿中的任何一种中执行，包括96孔板、其它构型的板、阵列、圆盘传送带等。

虽然术语“样品孔”、“扩增孔”、“扩增容器”、“反应室”、“反应区”等在本文中使用，但这些术语旨在涵盖这些扩增系统中使用的孔、管和各种其他反应容器。在一个实施例中，袋可以是包括一个或多个反应容器或反应区的测定装置。在一个实施例中，袋可以是柔性容器。例如，袋/柔性容器可以包括在两个或更多个柔性材料层之间形成的一个或多个样品孔、扩增孔、扩增容器、反应室、反应区等。在一个实施例中，该袋用于针对多种病原体进行测定。袋可以包括用作样品孔的一个或多个泡罩，说明性地在封闭系统中。说明性地，可以在任选的一次性袋中执行各种步骤，包括核酸制备、初级大体积多重PCR、初级扩增产物稀释和次级PCR、最终进行任选的实时检测或扩增后分析，诸如解链曲线分析。此外，应当理解，虽然在本发明的袋中可以执行各种步骤，但是对于某些用途，可以省略一个或多个步骤，并且可以相应地更改袋的配置。

图1示出了可以在各种实施例中使用或者可以针对各种实施例重新配置的说明性袋510。袋510类似于美国专利号8,895,295的图15，其中相同的项目编号相同。配件590设置有入口通道515a至515l，入口通道515a至515l也用作试剂储存器或废物储存器。说明性地，试剂可以在配件590中冷冻干燥，并在使用之前再水合。泡罩522、544、546、548、564和566以及它们相应的通道514、538、543、552、553、562和565类似于美国专利号8,895,295的图15的相同编号的泡罩。图1的第二级反应区580类似于美国专利申请号8,895,295的第二级反应区，但是高密度阵列581的第二级孔582以稍微不同的图案布置。图1的高密度阵列581的更圆形的图案消除了角落中的孔，并且可以导致第二级孔582的更均匀的填充。如图所示，高密度阵列581设置有102个第二级孔582。袋510适合于在FilmArray®仪器（BioFireDiagnostics，LLC，盐湖城，UT）中使用。然而，应当理解，袋实施例仅是说明性的。

虽然可以使用其他容器，但是说明性地，袋510可以由两层柔性塑料膜或其他柔性材料形成，诸如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚碳酸酯、聚丙烯（PP）、聚甲基丙烯酸甲酯、它们的混合物、组合物以及层，它们可以通过本领域已知的任何方法制成，包括挤出、等离子体沉积和层压。例如，每层可以由一层或多层单一类型或层压在一起的多于一种类型的材料组成。一个操作性示例是包括PET层和PP层的双层塑料膜。也可以使用金属箔或带有铝层压件的塑料。如果使用塑料膜，则这些层可以结合在一起，说明性地通过激光焊接和/或热封。说明性地，该材料具有低的核酸结合能力。类似的材料（例如，PET或聚碳酸酯）可以用于高密度阵列581。

在一些实施例中，可在用于形成柔性袋510的一层或多层中使用屏障膜。例如，对于某些应用来说，屏障膜可能是期望的，因为它们具有比常规塑料膜更低的水蒸气和/或氧气透过率。例如，典型的屏障膜具有在约0.01 g/m²/24小时至约3 g/m²/24小时的范围内、优选在约0.05 g/m²/24小时至约2 g/m²/24小时（例如，不超过约1 g/m²/24小时）的范围内的水蒸气透过率（WVTR）和在约0.01cc/m²/24小时至约2cc/m²/24小时的范围内、优选在约0.05cc/m²/24小时至约2cc/m²/24小时的范围内（例如，不超过约1 cc/m²/24小时）的氧气透过率。屏障膜的示例包括但不限于可以通过金属（例如，铝或另一种金属）气相沉积来金属化的膜或溅射涂覆有氧化物（例如，Al₂O₃或SiO_x）或另一种化学组合物的膜。金属化膜的常见示例是镀铝聚酯薄膜，它是金属涂覆的双轴取向PET（BoPET）。在一些应用中，涂覆的屏障膜可以与聚乙烯、PP或类似的热塑性塑料层层压，这提供了密封性并提高了耐穿刺性。与常规的塑料膜一样，用于制造袋的屏障膜层可以结合在一起，说明性地通过热封。说明性地，该材料具有低核酸结合和低蛋白质结合能力。本领域中已知的其它屏障材料可以被密封在一起以形成泡罩和通道。

对于采用荧光监测的实施例，在操作波长下具有足够低的吸收率和自动荧光的塑料膜是优选的。这种材料可以通过测试不同的塑料、不同的增塑剂和复合物比率以及不同的膜厚度来识别。对于带有铝或其他箔层压件的塑料，可以让将由荧光检测装置读取的袋部分没有箔。例如，如果在袋510的第二级反应区580的第二级孔582中监测荧光，则孔582处的一层或两层将没有箔。在PCR的示例中，由约0.0048英寸（0.1219毫米）厚的聚酯（聚酯薄膜，杜邦，威尔明顿DE）和0.001-0.003英寸（0.025-0.076毫米）厚的聚丙烯膜组成的膜层压件表现良好。说明性地，袋510可以由能够透射近似80%-90%的入射光的透明材料制成。

在一个实施例中，高密度阵列581和孔582由具有选定厚度的卡材料制成，使得形成在卡材料中的孔582具有选定的体积。在一个实施例中，卡材料可以设置在两个或更多个柔性膜层之间，所述柔性膜层分别密封阵列孔582的一端，并形成通道或开放空间，所述通道或开放空间允许孔582被填充并且然后至少部分封闭，以用于在高密度阵列中执行反应。应当理解，虽然袋510被设计成柔性的，但是高密度反应区580和高密度阵列581任选地可以是柔性较低的并且可以是刚性的，并且仍然是柔性样品容器的一部分。因此，应理解，“柔性袋”只需要在某些区中是柔性的。

在说明性实施例中，通过由压力致动器（说明性为气动压力致动器）在泡罩和通道上施加压力，材料在泡罩之间移动。因此，在采用压力的实施例中，袋材料说明性地足够柔性以允许压力具有期望的效果。术语“柔性”在本文中用于描述袋材料的物理特性。术语“柔性”在本文中被定义为通过本文中使用的压力水平容易变形，而不会破裂、断裂、龟裂等。例如，薄塑料片材（诸如Saran™包裹和Ziploc®包）以及薄金属箔（诸如铝箔）都是柔性的。然而，即使在采用气动压力的实施例中，只有泡罩和通道的某些区域需要是柔性的。此外，泡罩和通道的仅一侧需要是柔性的，只要泡罩和通道可容易地变形即可。袋510的其他区域可以由刚性材料制成，或者可以用刚性材料加强。因此，应当理解，当使用术语“柔性袋”或“柔性样品容器”等时，只有袋或样品容器的部分需要是柔性的。

说明性地，塑料膜可以用于袋510。金属（诸如铝或其他合适的材料）片材可以被铣削或以其他方式被切割，以产生具有凸起表面图案的模具。当装配到气动压力机中时（说明性地，Milton WI，Janesville Tool公司，A-5302-PDS），说明性地被调节在195℃的操作温度下，气动压力机像印刷压力机一样工作，仅在模具接触膜的地方熔化塑料膜的密封表面。同样，用于袋510的塑料膜可以使用激光切割和焊接装置切割和焊接在一起。当袋510形成时，诸如PCR引物（说明性地点涂到膜上并干燥）、抗原结合底物、磁珠和硅酸锆珠的各种成分可以密封在各种泡罩内。用于样品处理的试剂可以在密封之前集中地抑或单独地点涂到膜上。在一个实施例中，核苷酸三磷酸盐（NTPs）与聚合酶和引物单独地点涂到膜上，从而基本上消除了聚合酶的活性，直到反应可以被含水样品水合。如果含水样品在水合之前已经被加热，则这就为真正的热启动PCR创造了条件，并减少或消除了对昂贵的化学热启动成分的需要。在另一个实施例中，成分可以以粉末或丸剂的形式提供，并在最终密封之前放入泡罩中。

袋510可以以类似于美国专利号8,895,295中描述的方式使用。在一个说明性实施例中，可将包含待测试样品（100 μl）和裂解缓冲液（200 μl）的300 μl混合物注入到配件590中靠近入口通道515a的注入端口（未示出），并且可将样品混合物吸入入口通道515a中。也可以将水注入配件590的邻近入口通道515l的第二注入端口（未示出），并经由配件590中提供的通道（未示出）分配，从而水合多达11种不同的试剂，其中每种试剂之前都以干燥形式提供在入口通道515b至515l处。用于注入样品和水合流体（例如，水或缓冲液）的说明性方法和装置在美国专利号10,464,060中公开，该专利通过引用并入，尽管可以理解这些方法和装置只是说明性的，并且将样品和水合流体引入袋510中的唯一和其他方式也在本公开的范围内。这些试剂说明性地可以包括冻干PCR试剂、DNA提取试剂、清洗溶液、免疫测定试剂或其他化学实体。说明性地，试剂用于核酸提取、第一级多重PCR、多重反应的稀释、和第二级PCR试剂的制备以及对照反应。在图1所示的实施例中，所有需要注入的只是一个注入端口中的样品溶液和另一个注入端口中的水。在注入之后，两个注入端口可以密封。关于袋510和配件590的各种配置的更多信息，参见已经通过引用并入本文的美国专利号8,895,295。

在注入之后，样品可经由通道514从注入通道515a移动至裂解泡罩522。裂解泡罩522设置有珠或颗粒534，诸如陶瓷珠或其他研磨元件，并且被配置成用于经由使用设置在FilmArray®仪器内的旋转叶片或桨叶的冲击而涡旋。在裂解颗粒（诸如硅酸锆（ZS）珠534）的存在的情况下，通过摇动、涡旋、超声和类似处理对样品进行珠磨是形成裂解物的有效方法。应当理解，如本文所用，术语如“裂解（lyse）”、“裂解（lysing）”和“裂解物（lysate）”不限于破裂细胞，而是这样的术语包括非细胞颗粒（诸如病毒）的破裂。

图4示出了图2所示的仪器800的打珠马达819，打珠马达819包括可以安装在支撑构件802的第一侧811上的叶片821。叶片可以延伸穿过狭槽804以接触袋510。然而，应当理解，马达819可以安装在仪器800的其他结构上。在一个说明性实施例中，马达819是安装在支撑构件802上的Mabuchi RC-280SA-2865 DC马达（日本千叶）。在一个说明性实施例中，马达以5000至25000 rpm、更说明性地为10000至20000 rpm、且仍更说明性地为近似15000至18000rpm的速度转动。对于Mabuchi马达，已经发现7.2V为裂解提供了足够的rpm。然而，应当理解，当叶片821撞击袋510时，实际速度可能稍微更慢。其他电压和速度可用于裂解，这取决于所用的马达和桨叶。任选地，可将受控的小体积空气提供到邻近裂解泡罩522的囊822中。已经发现，在一些实施例中，用一个或多个小体积的空气部分地填充邻近的囊有助于在裂解过程期间定位和支撑裂解泡罩。替代地，其他结构（说明性地围绕裂解泡罩522的刚性或柔性垫圈或其他保持结构）可以用于在裂解期间约束袋510。还应当理解，马达819仅是说明性的，并且可以使用其他装置来研磨、摇动或涡旋样品。在一些实施例中，除了机械裂解之外或代替机械裂解，可以使用化学物质或热。

一旦样品材料已经被充分裂解，样品被移动到核酸提取区，说明性地通过通道538、泡罩544和通道543，到达泡罩546，在那里样品与核酸结合物质（诸如二氧化硅涂覆的磁珠533）混合。替代地，磁珠533可以被再水合，说明性地使用从入口通道515c-515e中的一个提供的流体水合，并且然后通过通道543移动到泡罩544、并且然后通过通道538移动到泡罩522。允许混合物孵育适当长度的时间，说明性地近似10秒至10分钟。位于仪器内邻近泡罩546的可缩回磁体从溶液中捕获磁珠533，从而形成抵靠泡罩546内表面的小球。如果在泡罩522中进行孵育，则可能需要将溶液的多个部分移动到泡罩546以用于捕获。然后，将液体移出泡罩546，并通过泡罩544返回，并进入泡罩522中，泡罩522现在用作废物接收器。来自注入通道515c至515e中的一个或多个的一种或多种清洗缓冲液经由泡罩544和通道543提供给泡罩546。任选地，磁体缩回，并且通过经由通道543从泡罩544和546来回移动磁珠来清洗磁珠533。一旦磁珠533被清洗完，磁珠533就通过磁体的激活被重新捕获在泡罩546中，并且然后清洗溶液被移动到泡罩522。该过程可以根据需要重复，以从核酸结合磁珠533中清洗裂解缓冲液和样品碎片。

在清洗之后，储存在注入通道515f处的洗脱缓冲液被移动到泡罩548，并且磁体被缩回。溶液经由通道552在泡罩546和548之间循环，从而破碎泡罩546中的磁珠533的小球，并允许被捕获的核酸从磁珠解离并进入溶液中。磁体再次被激活，从而捕获泡罩546中的磁珠533，并且被洗脱的核酸溶液被移入泡罩548中。

来自注入通道515g的第一级PCR主混合物与泡罩548中的核酸样品混合。任选地，混合物通过经由通道553在548和564之间迫使混合来混合。在几个混合循环之后，溶液被容纳在泡罩564中，在泡罩564中提供第一级PCR引物的小球，每个靶至少一组引物，并且执行第一级多重PCR。如果存在RNA靶，则可以在第一级多重PCR之前或同时执行RT步骤。FilmArray®仪器中的第一级多重PCR温度循环说明性地执行15-20个循环，尽管取决于具体应用的要求，其他水平的扩增可能是期望的。第一级PCR主混合物可以是本领域已知的各种主混合物中的任何一种。在一个说明性示例中，第一级PCR主混合物可以是美国专利号9,932,634中公开的任何化学物质，其全部内容通过引用并入本文，以供每个循环花费20秒或更少时间的PCR方案使用。

在第一级PCR已经进行了期望的循环次数之后，样品可以被稀释，说明性地通过迫使大部分样品回到泡罩548中，从而仅留下少量在泡罩564中，并且从注入通道515i添加第二级PCR主混合物。替代地，来自515i的稀释缓冲液可以被移动到泡罩566，然后通过在泡罩564和566之间来回移动流体而与泡罩564中的扩增样品混合。如果期望，则稀释可以使用来自注入通道515j和515k的稀释缓冲液重复几次，或者可以保留注入通道515k，说明地以用于测序或其他后PCR分析，并且然后将来自注入通道515h的第二级PCR主混合物添加到一些或所有稀释的扩增样品。应当理解，可以通过更改稀释步骤的数量或通过更改在与稀释缓冲液或第二级PCR主混合物混合之前丢弃的样品的百分比来调节稀释水平，所述第二级PCR主混合物包括用于扩增的成分，说明性地聚合酶、dNTPs和合适的缓冲液，尽管其他成分也可能是合适的，特别是对于非PCR扩增方法。如果期望，则样品和第二级PCR主混合物的混合物可以在移动到用于第二级扩增的第二级孔582之前在泡罩564中预热。这种预热可以避免在第二级PCR混合物中对热启动成分（抗体、化学物质或其他）的需要。

说明性的第二级PCR主混合物是不完整的，缺少引物对，并且102个第二级孔582中的每一个都预先装载有特定的PCR引物对。如果期望，则第二级PCR主混合物可以缺少其他反应成分，并且这些成分也可以预先装载在第二级孔582中。每个引物对可以与第一级PCR引物对相似或相同，或者可以嵌套在第一级引物对中。样品从泡罩564到第二级孔582的移动完成了PCR反应混合物。如本领域已知的，一旦高密度阵列581被填充，则各个第二级反应通过如本领域中已知的任何数量的手段被密封在它们相应的第二级泡罩中。在已经通过引用并入本文的美国专利号8,895,295中讨论了在没有交叉污染的情况下填充和密封高密度阵列581的说明性方法。说明性地，高密度阵列581的孔582中的各种反应说明性地使用一个或多个珀耳帖装置而被同时或单独热循环，尽管用于热循环的其他手段在本领域中是已知的。

在某些实施例中，第二级PCR主混合物包含dsDNA结合染料LCGreen® Plus（BioFire Diagnostics，LLC），以生成指示扩增的信号。然而，应当理解，这种染料仅是说明性的，并且可以使用其它信号，包括本领域已知的荧光、放射、化学发光、酶促等方式标记的其它dsDNA结合染料和探针。替代地，阵列581的孔582可以在没有信号的情况下提供，其中通过后续处理来报告结果。

当施加到袋泡罩的压力被用于移动袋510内的材料时，在一个实施例中，可以采用气动“囊”。在其他实施例中，可以使用各种机械驱动的压力致动器。囊组件810，其一部分在图2-3中示出，包括容纳多个可膨胀囊822、844、846、848、864和866的囊板824，每个囊可能够单独膨胀，说明性地通过压缩气体源单独膨胀。因为囊组件810可经受压缩气体并使用多次，所以囊组件810可由比袋更坚韧或更厚的材料制成。替代地，囊822、844、846、848、864和866可以由用垫圈、密封件、阀和活塞紧固在一起的一系列板形成。其他布置也在本发明的范围内。替代地，可以使用阵列或机械致动器和密封件来密封通道并引导流体在泡罩之间的移动。WO 2018/022971中详细描述了可适于本文所述仪器的机械密封件和致动器系统，其全部内容通过引用并入本文。

次级PCR的成功取决于多重第一级反应生成的模板。通常，使用高纯度的DNA来执行PCR。诸如酚提取或商业DNA提取试剂盒的方法提供高纯度的DNA。通过袋510处理的样品可需要进行调节以补偿不太纯的制剂。生物样品的成分可能会抑制PCR，这是一个潜在的障碍。说明性地，热启动PCR、更高浓度的Taq聚合酶、调节氯化镁浓度、调节引物浓度和添加辅助剂（诸如DMS、TMSO或甘油）任选地可用于补偿较低的核酸纯度。虽然纯度问题很可能是第一级扩增更关心的问题，但应当理解，在第二级扩增中也可以提供类似的调节。

当袋510被放置在仪器800内时，囊组件810被压靠在袋510的一个面上，使得如果特定的囊被膨胀，则压力将迫使液体流出袋510中的对应泡罩。在一个或多个实施例中，一个或多个可膨胀囊可以在仪器中膨胀，以增强泡罩与仪器的一个或多个部件之间的接触。例如，气动囊822可以至少部分地膨胀，以增强一侧上的泡罩522和另一侧上的裂解设备之间的接触。在另一种情况下，气动囊848和864可以至少部分地在泡罩548和564上膨胀，以增强泡罩548和564与用于第一级PCR的加热器组件之间的接触。除了对应于袋510的许多泡罩的囊之外，囊组件810可以具有附加的气动致动器，诸如对应于袋510的各种通道的囊或气动活塞。图2-3示出了对应于袋510的通道538、543、553和565的说明性的多个活塞或硬密封件838、843、852、853和865，以及最小化到配件590中的回流的密封件871、872、873、874。当被激活时，硬密封件838、843、852、853和865形成夹管阀以夹断和关闭对应的通道。为了将液体限制在袋510的特定泡罩内，硬密封件在通向和来自泡罩的通道上被激活，使得致动器发挥夹管阀的功能以将通道夹紧关闭。说明性地，为了在不同的泡罩中混合两个体积的液体，激活密封连接通道的夹管阀致动器，并且对泡罩上的气动囊进行交替加压，从而迫使液体来回通过连接泡罩的通道以混合其中的液体。夹管阀致动器可以具有各种形状和尺寸，并且可以被配置成一次夹断多于一个的通道。

虽然在本文中讨论了气动致动器，但是应当理解，可以设想用于向袋提供压力的其他类型的压力换能器，包括各种机电致动器，诸如线性步进马达、马达驱动的凸轮、由气动、液压或电磁力驱动的刚性桨叶、辊、摇臂，以及在某些情况下扳起的弹簧。另外，除了施加垂直于通道轴线的压力之外，还有各种可逆或不可逆地关闭通道的方法。这些包括将袋跨通道扭结、热封、滚动致动器、以及密封到通道中的各种物理阀，诸如蝶阀和球阀。另外，小的珀耳帖装置或其他温度调节器可以放置成邻近通道，并设置在足以冻结流体的温度下，从而有效地形成密封。此外，虽然图1的袋设计适于自动化仪器，其特征在于致动器元件定位在每个泡罩和通道上，但是还可以设想致动器可以保持静止，并且袋510可以被转换，使得小数量的致动器可以用于几个处理站，包括样品破碎、核酸捕获、第一和第二级PCR、以及用于袋510的其他应用（诸如免疫测定和免疫PCR）的处理站。在袋510在站之间平移的配置中，作用在通道和泡罩上的辊可以证明是特别有用的。因此，尽管在当前公开的实施例中使用了气动致动器，但是当在本文中使用术语“气动致动器”时，应当理解，取决于袋和仪器的配置，可以使用其他压力换能器、致动器和提供压力的其他方式。

除了前述的气动囊和密封件，图3图示了另一个压力换能器880的配置，该压力换能器880的尺寸和位置可以被设置成向高密度反应区580和高密度反应孔582施加压力。压力换能器880的尺寸和位置可以设置成大致向高密度反应区580施加压力，或者压力换能器880可以是或包括子结构882，该子结构882的尺寸和位置设置成仅向高密度反应孔582施加压力。在一个实施例中，压力换能器880的致动具有将高密度反应区580和高密度反应孔582轻轻地压靠在第二级PCR加热器（图2中的888）上以促进从加热器888到反应孔582中的流体的热传递的效果。在另一个实施例中，在高密度反应区580或高密度反应孔582上的压力换能器880的致动可以压缩高密度反应孔582上方和下方的柔性层599和597，以密封关闭孔并从高密度反应区580清除多余的流体。

压力换能器880可以是机械或气动致动的，如本文中上面详细描述的。在期望荧光激发高密度反应孔582和对来自高密度反应孔582的荧光进行检测情况下，压力换能器880可以包括透明塑料囊等，其可以在高密度反应孔582填充有反应混合物之后在高密度反应孔582上膨胀。在这种情况下，压力换能器880可以包括“窗口囊”，其在高密度反应孔582上膨胀，同时允许来自光源898的激发光（图2）通过以激发荧光并允许通过摄像机896观察（图2）。这样，在使用荧光或其他光学检测的实施例中，优选的是，压力换能器880由光学透明且荧光最小的材料制成。在本领域已知数种这样的材料。

类似地，除了前述内容之外，在一个实施例中，压力换能器880还可以高效且有效地从高密度反应孔582清除多余的流体。例如，从第二级阵列中清除多余的流体可以降低PCR循环时间（即，较小体积的液体可以更快地循环）。此外，清除多余的流体有助于抑制第二级PCR阵列的相邻孔之间的相互混合（在本文中通常称为“串扰”）。如美国专利号8,895,295（该专利已经通过引用并入本文）中所讨论的，第二级阵列可以设置有穿孔覆盖层，该覆盖层允许填充第二级孔并有助于抑制串扰。反应完成后，可以降低高密度反应区580上的压力，以允许从仪器800移除。在不需要进一步分析的实施例中，不再需要防止孔582之间的串扰。在期望进一步分析的情况下，可以使用更永久的密封机构，说明性地结合图5-10描述的任何密封层。

回到图2，每个气动致动器经由阀899连接到压缩空气源895。虽然图2中仅示出了几根软管878，但是应当理解，每个气动配件经由软管878连接到压缩气体源895。压缩气体源895可以是压缩机，或者替代地，压缩气体源895可以是压缩气体瓶，诸如二氧化碳瓶。如果期望便携性，则压缩气体瓶特别有用。压缩气体的其他源也在本发明的范围内。类似的气动控制可以在图12-16的实施例中提供，以用于控制袋1400中的流体，或者可以提供其他致动器、伺服系统等。

仪器810的几个其他部件也连接到压缩气体源895。安装在支撑构件802的第二侧814上的磁体850说明性地经由软管878使用来自压缩气体源895的气体部署和缩回，不过移动磁体850的其他方法在本领域中是已知的。磁体850坐落于支撑构件802的凹部851中。应当理解，凹部851可以是穿过支撑构件802的通道，使得磁体850可以接触袋510的泡罩546。然而，取决于支撑构件802的材料，应当理解，凹部851不需要一直延伸穿过支撑构件802，只要当磁体850被部署时，磁体850足够靠近以在泡罩546处提供足够的磁场，并且当磁体850完全缩回时，磁体850不会显著影响泡罩546中存在的任何磁珠533。虽然参考了缩回的磁体850，但是应当理解，可以使用电磁体，并且可以通过控制通过电磁体的电流来激活和去激活电磁体。因此，虽然本说明书讨论了撤回或缩回磁体，但是应当理解，这些术语足够宽泛，以包括撤回磁场的其他方式。可以理解，气动连接可以是气动软管或气动空气歧管，因此减少了所需软管或阀的数量。

气动活塞阵列869的各种气动活塞868也经由软管878连接到压缩气体源895。虽然仅示出了两个软管878将气动活塞868连接到压缩气体源895，但是应当理解，每个气动活塞868都连接到压缩气体源895。示出了12个气动活塞868。

一对温度控制元件安装在支撑件802的第二侧814上。如本文所使用的，术语“温度控制元件”是指向样品添加热或从样品中移除热的装置。温度控制元件的说明性示例包括但不限于加热器、冷却器、珀耳帖装置、电阻加热器、感应加热器、电磁加热器、薄膜加热器、印刷元件加热器、正温度系数加热器及其组合。温度控制元件可以包括多个加热器、冷却器、珀耳帖装置等。在一个方面，给定的温度控制元件可以包括多于一种类型的加热器或冷却器。例如，温度控制元件的说明性示例可以包括珀耳帖装置，该珀耳帖装置具有应用于珀耳帖装置的顶面和/或底面的单独的电阻加热器。虽然术语“加热器”在整个说明书中被使用，但是应当理解，可以使用其他温度控制元件来调节样品的温度。

如上所讨论的，第一级加热器886可以定位成加热和冷却泡罩564或泡罩548和564的内容物，以用于第一级PCR。如图2所示，第二级加热器888可以被定位成加热和冷却袋510的阵列581的第二级泡罩582的内容物，以用于第二级PCR。然而，应当理解，这些加热器也可以用于其他加热目的，并且可以视情况包括适合于特定应用的其他加热器。

如上所讨论的，虽然在两个或更多个温度之间进行热循环的珀耳帖装置对于PCR是有效的，但是在一些实施例中，可能期望将加热器保持在恒定温度下。说明性地，这可以用来通过消除转变加热器温度所需的时间超过转变样品温度所需的时间而减少运行时间。此外，这种布置可以提高系统的电效率，因为只需要热循环较小的样品和样品器皿，而不需要大得多（热质量更大）的珀耳帖装置。例如，仪器可以包括相对于袋定位以完成热循环多个加热器（即，两个或更多个），这些加热器处于针对例如退火、延长、变性设定的温度下。对于许多应用来说，两个加热器可以是足够的。在各种实施例中，加热器可以移动，袋可以移动，或者流体可以相对于加热器移动，以完成热循环。说明性地，加热器可以线性地布置、呈圆形布置等。上面已经参照第一级PCR讨论了合适加热器的类型。

当期望荧光检测时，可以提供光学阵列890。如图2所示，光学阵列890包括光源898和摄像机896，光源898示意性地为经滤光的LED光源、经滤光的白光或激光照明。摄像机896说明性地具有多个光电探测器，每个光电探测器对应于袋510中的第二级孔582。替代地，摄像机896可以拍摄包含所有第二级孔582的图像，并且该图像可以被分成对应于每个第二级孔582的单独的场。取决于配置，光学阵列890可以是静止的，或者光学阵列890可以放置在附接到一个或多个马达的移动器上，并且移动以从每个单独的第二级孔582获得信号。应当理解，其他布置是可能的。图18所示的第二级加热器的实施例在袋510的与图2所示相反的一侧上提供加热器。这种取向仅仅是说明性的，并且可以由仪器内的空间约束来确定。假设第二级反应区580设置在光学透明材料中，光电探测器和加热器可以在阵列581的任一侧上。

如图所示，计算机894控制压缩空气源895的阀899，并且因此控制仪器800的所有气动装置。另外，在其他实施例中，仪器中的许多气动系统可以用机械致动器、压力施加装置等来代替。计算机894还控制加热器886和888以及光学阵列890。这些部件中的每一个都经由电缆891电连接，尽管其他物理或无线连接也在本发明的范围内。应当理解，计算机894可以容纳在仪器800内，或者可以在仪器800的外部。此外，计算机894可以包括控制一些或所有部件的内置电路板，并且还可以包括外部计算机，诸如台式或膝上型PC，以接收和显示来自光学阵列的数据。可以提供界面，诸如键盘界面，其包括用于输入信息和诸如温度、循环时间等变量的键。说明性地，还提供显示器892。例如，显示器892可以是LED、LCD或其他这样的显示器。

其他现有技术的仪器教导在密封的柔性容器内的PCR。参见，例如，美国专利号6,645,758、6,780,617和9,586,208，其通过引用并入本文。然而，在密封的PCR器皿内包括细胞裂解可以提高使用的便利性和安全性，特别是当待测试样品可能含有生物危害物时。在本文所示的实施例中，来自细胞裂解的废物以及来自所有其它步骤的废物保留在密封的袋内。尽管如此，应当理解的是，袋内容物可以被移除用于进一步的测试。

如上所讨论的，图2示出了可以与袋510一起使用的说明性仪器800。仪器800包括支撑构件802，支撑构件802可以形成外壳的壁或者安装在外壳内。仪器800还可以包括第二支撑构件（未示出），该第二支撑构件任选地可相对于支撑构件802移动，以允许袋510的插入和撤回。说明性地，一旦袋510已经被插入到仪器800中，盖子就可以覆盖袋510。在另一个实施例中，两个支撑构件可以是固定的，袋510通过其他机械装置或气动压力保持在适当位置。

在说明性示例中，加热器886和888安装在支撑构件802上。然而，应当理解，这种布置仅是说明性的，并且其他布置也是可能的。说明性加热器包括如现有技术中已知的珀耳帖和其他块状加热器、电阻加热器、电磁加热器和薄膜加热器，以热循环泡罩864和第二级反应区580的内容物。具有囊822、844、846、848、864、866、硬密封件838、843、852、853和密封件871、872、873、874的囊板810形成囊组件808，囊组件808可以说明性地安装在可朝向袋510移动的可移动支撑结构上，使得气动致动器放置成与袋510接触。当袋510被插入仪器800中并且可移动支撑构件朝向支撑构件802移动时，袋510的各种泡罩处于邻近于囊组件810的各种囊和组件808的各种密封件的位置中，使得气动致动器的激活可以迫使液体从袋510的一个或多个泡罩中流出，或者可以形成具有袋510的一个或多个通道的夹管阀。袋510的泡罩和通道与组件808的囊和密封件之间的关系在图3中更详细地示出。

虽然上面关于图3讨论的压力换能器880（例如，窗口囊）是可能够在反应期间至少部分地密封孔582或高密度反应区580的反应中的流体的装置的一个示例，但是在一些情况下可能期望形成永久或半永久密封，其能够在反应完成之后———例如，在从仪器上移除反应容器之后的数小时、数天或数周内保持反应孔的流体内容物的完整性。注意，在使用反应容器之后形成持久的更耐用的密封也可以具有在反应期间更好地密封反应孔中的流体内容物的效果。本发明提供了反应容器、方法和系统，用于使用正常反应中已经存在的条件原位密封封闭反应容器中的各个反应孔以形成密封。例如，在一些热循环反应中存在的热和压力可以用于使密封材料变形，以原位形成密封，从而密封反应容器中的一个或多个反应孔，并形成密封，该密封在反应期间有效地密封孔，并在热循环完成且反应容器从仪器中移除之后保留。此外，说明性的可密封反应容器、方法和系统不会有在反应之前过早粘附和密封的风险。同样，因为形成密封所需的条件已经存在于正常的反应条件中，所以本文描述的容器、方法和系统不需要任何额外的步骤或处理来形成密封。根据本文描述的方法和系统密封的反应孔可以在相同或不同的仪器上保存和重新读取。这种反应孔可以用于测量孔与孔之间的可变性或仪器与仪器之间的可变性。此外，根据本文所述的方法和系统密封的反应孔可用于制作标准（例如，荧光标准），其可以用于校准仪器。因为密封材料被包含在反应容器中，并且几乎没有过早形成密封的风险，所以使用可密封的反应容器以及本文描述的方法和系统不需要用户方进行任何特殊的处理或样品制备。

现在转到图5A和5B，图示了用于在封闭系统中对流体样品执行多个反应的反应容器5000的实施例的横截面图。虽然反应容器5000示出了几个平行的反应孔5035，但这仅仅是说明性的。本文所述的原位密封系统可用于原位密封反应容器的任何部分，诸如但不限于一个反应孔或多个平行的反应孔、反应室（例如，反应泡罩）、流体流动通道等。如图5A所示，反应容器5000被示为处于初始的未变形/未密封状态5000a。图5B图示了处于变形/密封状态5000b的反应容器5000。

反应容器5000包括第一外层5010、第二外层5020、阵列层5030和形成为阵列层5030中形成的一系列空隙或孔的多个反应孔5035。在采用压力的实施例中，用于形成反应容器5000的一层或多层的材料说明性地足够柔性，以允许压力具有期望的效果。然而，即使在采用气动压力的实施例中，只有反应容器5000的某些区域需要是柔性的。此外，反应容器5000的仅一侧需要是柔性的，只要选择部分（例如，在阵列层5030的至少一侧上）可容易地变形即可。反应容器5000的其他区域可以由刚性材料制成，或者可以用刚性材料加强。因此，应当理解，当使用术语“柔性袋”或“柔性反应容器”等时，只有袋或反应容器的部分需要是柔性的。用于制造第一外层5010、第二外层5020和阵列层5030的材料在上文中参照袋510和阵列581进行了详细讨论。可以使用的材料的非限制性示例包括但不限于聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚碳酸酯、聚丙烯（PP）或聚甲基丙烯酸甲酯。在所示实施例中，柔性外层5020结合到阵列层5030的一端5053，以密封孔5035的一端。第二外层5020可以直接结合到阵列层5030（例如，通过热焊接或超声波焊接）或者层5020可以包括可以将层5020结合到阵列层5030的粘合剂层（例如，压敏粘合剂或热活化粘合剂（未示出））。

在所示实施例中，反应容器5000包括密封层5040，其中5040a是指变形和密封之前的层5040，并且5040b是指变形和密封之后的层5040。密封层5040耦合到第一外层5010的内表面5047，使得密封层5040邻近于阵列孔5035的开口端定位。在反应容器5000的初始、未变形/未密封状态5000a中，第一柔性外层5010和密封层5040a与阵列层5035间隔开，并且流体可以流入（或流出）多个孔5035的开口端5055。一旦流体样品已经填充了孔5035，就可以向层5010的外表面5049施加压力，以按压层5010和5040与阵列层5030的第二端5051接触，从而在所述多个孔（未示出）的开口端5055上形成临时密封。

图5B指示了在反应条件（例如，在热循环反应期间）下（例如，当可以施加热和压力中的一种或两种时）可能发生的情况。在图示的实施例中，反应条件导致形成密封以密封孔5035的开口端5055。通过将层5010和5040压靠在阵列层5030上，例如，可以邻近于层5020对反应容器5000施加热以促进多个孔5035中的反应（例如，核酸扩增反应），同时在表面5049处邻近于层5010处施加压力。在其他实施例中，热和压力可以施加到反应容器5000的同一侧。说明性地，为促进反应而提供的热和压力可导致密封层5040变形（如5040b说明性地表示的）以形成原位密封，而不需要附加的热和压力。变形的密封层5040b可以在阵列层5030的第二端5051周围变形（示例变形在5042和5044处说明性地示出），并且被压入孔开口5055中以产生密封塞（例如，以5044示出），密封塞进入孔5035的开口端5055，使得孔的流体内容物在反应期间或之后不能流出和混合。当反应完成并且热和压力被移除时，密封各个孔5035的开口端5055的密封（例如，永久或半永久密封）沿着阵列层5030、第二端5051在5042/5044处的第二端5051和密封层5040之间的界面处留下。

在一个实施例中，密封层5040可以直接施加到外层5010的内表面5047，或者密封材料5040可以作为层或单独膜层的一部分被包括，该单独膜层结合到外层5010的邻近于阵列层5030的第二端的内表面5047。例如，密封层5040（其说明性地可以包括粘合剂、在水相环境中溶胀的溶胀材料、蜡等）可以作为连续层、喷涂层等直接施加到外层5010的内表面5047。在另一个实施例中，密封材料5040可以被涂覆到另一个膜层上或者可以是另一个膜层的一部分，该另一个膜层可以结合到外层5010的邻近于阵列层5030的第二端5051的内表面5047。膜层可以包括背衬层（例如，PET层）和施加到背衬的密封材料。在一个实施例中，这种膜层可以直接结合（例如，通过热焊接、激光焊接等）到上部柔性层5010。在另一个实施例中，这种膜层可以包括第二粘合剂层（例如，压敏粘合剂），其也被施加到将膜层粘附到上部柔性层的背衬层。

合适的热活化和压力活化粘合剂的示例包括，但不限于，乙烯-乙酸乙烯酯（EVA）、乙烯-乙酸乙酯（EEA）、乙烯-乙酸甲酯（EMA）、乙烯丙烯酸正丁酯（EnBA）、乙烯-丙烯酸（EAA）、热塑性聚氨酯（TPU）、聚己内酯、硅树脂橡胶、热塑性弹性体、蜡（例如，微晶蜡）、聚乙烯、聚丙烯、低密度聚乙烯、它们的共聚物以及它们的组合。合适的热活化和压力活化粘合剂、蜡等可以在热循环条件下软化或部分或完全熔化，以变形到密封阵列层5030的反应孔5035中并基本密封阵列层5030的反应孔5035。粘合剂的熔化温度应低于反应的最高温度，且高于环境温度。在一个实施例中，使用熔点在约60℃至约100℃范围内（例如，约65-95℃、约70-90℃、约75-85℃、或约80-85℃）的粘合剂。然而，人们将会理解，压力和热之间存在相互作用，并且所列举的温度范围仅仅是说明性的。例如，如果压力相对增加，则可能需要较少的热来使粘合剂变形以形成密封，或者，另一方面，如果压力相对降低，则可能需要更多的热来形成密封。当热和压力从反应容器5000移除时，粘合剂将重新固化以形成密封各个孔5035的密封。

热和压力不是可以用于孔密封的唯一原位反应参数或过程。可以产生永久密封的其它原位过程包括但不限于：当反应液体被提供给孔时，密封孔的液体敏感粘合剂层；孔可被提供有在孔填充时与粘合剂层反应的粘合剂催化剂、溶剂或试剂；吸湿材料可被提供在微孔开口周围，其可以在水的存在下扩展并堵塞开口；或者吸湿材料可被提供在孔内并可用于在样品进入时吸收样品（例如，像海绵一样），从而防止样品成分离开。

现在参考图6A和6B，示出了被配置成用于原位密封的高密度反应区6000的另一个实施例的横截面图。图6A和6B的实施例类似于图5A和5B所示的实施例，除了原位密封材料6040设置在高密度阵列层6030的邻近于孔6035的开口端6055的端部6051上之外。如在前面的示例中，6040通常指密封材料，6040a指处于初始、未变形/未密封状态的密封材料，并且6040b指处于变形/密封状态的密封材料。如图6A所示，反应容器6000被示为处于初始的未变形/未密封状态6000a。图6B图示了处于变形/密封状态6000b的反应容器6000。

反应容器6000包括第一外层6010、第二外层6020、阵列层6030和形成为阵列层6030中形成的一系列空隙或洞的多个反应孔6035。用于制造第一外层6010、第二外层6020和阵列层6030的材料在本文别处详细讨论。在所示实施例中，第二外层6020结合到阵列层6030的第一端6053，以密封孔6035的第一端。第二外层6020可以直接结合到阵列层6030的第二端6053（例如，通过热焊接或超声波焊接）或者层6020可以包括可以将层6020结合到阵列层6030的粘合剂层（例如，压敏粘合剂或热活化粘合剂（未示出））。

在图示的实施例中，反应容器6000包括设置在阵列层6030的与第一端6053相对的第二端6051上的密封材料6040。在反应容器6000的初始未变形/未密封状态6000a中，密封材料6040处于未密封状态6040a，并且第一柔性外层6010与密封材料6040分离，使得流体可以流入（或流出）所述多个孔6035的开口端6055。一旦流体样品已经填充了孔6035，就可以在表面6049处向层6010的外部施加压力，以将层6010压到与密封材料6040接触，从而在层6010的内表面6047和密封材料6040之间产生临时密封，该密封材料6040盖住孔6035的开口端6055。

在层6010被压到密封材料6040上的情况下，例如，可以邻近于层6020将热施加到反应容器6000以促进多个孔6035中的反应（例如，核酸扩增反应）。如图6B所示，为促进反应而提供的热和压力可导致密封材料6040从其初始状态6040a变为变形/密封状态6040b，以形成原位密封，使得孔6035的流体内容物不能流出孔6035的开口端6055，并在反应期间或之后混合。在一个说明性示例中，密封材料6040可以是热固性聚合物或热塑性聚合物。当反应完成并且热和压力被移除时，密封各个孔6035的密封（例如，永久或半永久密封）沿着层6010和变形的密封材料6040b之间的界面留下。

在一个实施例中，密封材料6040可以直接施加到阵列层6030的第二端6051。例如，密封材料6040可以是粘合剂、在水相环境中溶胀的溶胀剂、蜡等，其被直接施加到阵列层6030的第二端6051，使得其邻近于外层6010的内表面6047设置。例如，如上文详细讨论的，阵列层可以由相对厚的卡材料制成，该卡材料中形成有孔以形成样品孔阵列。例如，与约0.02至约0.1毫米的外层的厚度相比，阵列层材料具有约0.3至约1毫米（例如，约0.4毫米）的厚度。在示例实施例中，密封材料（例如，热敏粘合剂）可以作为液滴、网格线等形式以连续涂层的形式施加到卡层。然后，可以在卡层中形成孔洞，从而留下阵列层，其中孔洞以密封材料为边界。在另一个实施例中，密封材料可以在形成阵列层和孔洞之后施加。

在又一实施例中，密封材料6040可以包括可以结合到阵列层6030的膜材料。膜材料可以包括背衬层（例如，PET层）和如本文公开的施加到背衬层的密封材料。在一个实施例中，这种膜材料可以直接结合（例如，通过热焊接、激光焊接等）到阵列层6030的第二端6051。在另一个实施例中，这种膜层可以包括第二粘合剂层（例如，压敏粘合剂），其可以将膜层粘附到阵列层6030的第二端6051。在将膜材料施加到阵列层6030之前或之后，可以在阵列层6030中形成孔洞。如果在阵列中形成洞之前将膜材料施加到阵列上，则洞可以穿过阵列卡、膜和原位密封粘合剂而形成。如果在阵列孔洞形成之后将密封材料作为承载粘合剂层的膜施加到阵列，则在将膜附着到阵列之前，可以在膜/粘合剂中形成对应的洞。

合适的热活化和压力活化粘合剂的示例（例如，乙烯-乙酸乙烯酯（EVA）、乙烯-乙酸乙酯（EEA））在上文中参照图5A和5B进行了讨论。合适的热活化和压力活化粘合剂、蜡等可以在反应条件（例如，热循环条件）下至少部分熔化以基本上密封阵列层6030的反应孔6035。在一个实施例中，热活化和压力活化粘合剂的熔点在约60℃至约100℃的范围内。当热和压力从反应容器6000移除时，热活化和压力活化粘合剂将重新固化以形成密封，该密封沿着层6010的内表面6047和密封材料6040之间的界面密封各个孔6035。

现在参考图7A和7B，示出了被配置成用于原位密封的反应容器7000的又一实施例的横截面图。图7A和7B的实施例类似于前述示例中所示的反应容器的高密度反应区。如在前面的示例中，7040通常是指密封材料，7040a是指处于初始、未变形/未密封状态的密封材料，且7040b是指处于变形/密封状态的密封材料。如图7A所示，反应容器7000被示为处于初始的未变形/未密封状态7000a。图7B图示了处于变形/密封状态7000b的反应容器7000。

反应容器7000包括第一外层7010、第二外层7020、阵列层7030和形成为阵列层7030中形成的一系列空隙或洞的多个反应孔7035。本文详细讨论了用于制造第一外层7010、第二外层7020和阵列层7030的材料。在所示实施例中，第二外层7020结合到阵列层7030的第一端7053，以密封孔7035的第一端。第二外层7020可以直接结合到阵列层7030的第一端7053（例如，通过热焊接或超声波焊接）或者层7020可以包括可以将层7020结合到阵列层7030的粘合剂层（例如，压敏粘合剂或热活化粘合剂）（未示出）。在图示的实施例中，反应容器7000包括耦合到第一外层7010的内表面7047的密封层7040。该密封层7040类似于图5A和5B所示的密封层5040。

图7A和7B示出了反应容器7000的说明性实施例，其包括阵列孔7035的开口上的物理屏障。夹在反应容器7000的第一外层7010、密封层7040和第二外层7020之间的是具有孔7035的阵列层7030。设置在阵列层7030的第二端7051上的是穿孔层7050，穿孔层7050被提供以充当物理屏障，其中穿孔7055允许流体样品在力的存在下流入孔7035（例如，孔7035中的部分真空）中，但是在没有力的情况下阻碍从孔回流。说明性地，穿孔层7050是已经被密封到阵列层7030的第二端7051的塑料膜层（说明性地通过热封），尽管应当理解，可以采用其他固定方法。还应当理解，用于阵列层7030的材料和用于穿孔层7050和第二外层7020的材料应当彼此兼容，与密封方法兼容，并且与所使用的化学物质兼容。

在初始的未变形/未密封状态7000a（图7A）下，第一外层7010和密封层7040与穿孔层7050和阵列层7035分离，并且作为结果，流体可以经由开口7055流入（或流出）多个孔7035。在美国专利号8，895，295中讨论了在没有交叉污染的封闭系统中填充高密度阵列（例如，阵列孔7035）的说明性方式，该专利已经通过引用并入本文。在图7A和7B所示的说明性实施例中，提供了穿孔层7050，其类似于美国专利号8,895,295的穿孔层7050。穿孔层7050允许流体在存在力的情况下流入每个孔7035中，但是穿孔足够小，以基本上防止流体在没有力的情况下流入或流出孔。例如，孔7035中的预定量的真空可足以通过穿孔层7050的开口7055抽吸流体并抽入孔内；一旦在填充孔时“消耗”了预定的真空，流体将通常不容易通过开口7055流入或流出孔7035。在填充阵列孔7035之后，阵列层7030中的孔7035可以通过向邻近于表面7049的第一外层7010施加压力来临时密封，如例如美国专利号8,895,295中所讨论的，以将第一外层7010和密封层7040压靠在穿孔层7050的上表面7052上。

在通过邻近于层7010施加压力来将层7040压靠在穿孔层7050的上表面7052上以形成临时密封的情况下，可以将热施加到反应容器7000（例如，邻近于层7020）以促进多个孔7035中的反应（例如，核酸扩增反应）。如图7B所示，为促进反应而提供的热和压力可导致处于初始、未变形/未密封状态7040a的密封层7040变形，如7040b所示，以产生密封，使得孔7035的流体内容物不能经由开口7055流出，并在反应期间或之后混合。在所示实施例中，密封层7040可以在密封状态7040b下变形，以至少部分地填充到穿孔层洞7055中，从而形成密封塞7044。密封层7040可以如图所示进一步密封，例如，在穿孔层7050的上表面7052和密封层7040b之间的界面处的7042处密封。当反应完成并且热和压力被移除时，密封各个孔7035的密封（例如，永久或半永久密封）沿着穿孔层7050、开口7055和变形的密封材料7040b之间的界面留下。

如参考图5A和5B详细描述的，密封层7040可以直接施加到外层7010的内表面7047，或者密封材料7040可以包含有结合到外层7010的内表面7047的单独的膜层，使得密封材料7040邻近于穿孔层7050设置。直接施加到外层7010的内表面的密封层7040可以例如喷涂或涂覆到外层7010的内表面上。承载密封材料7040的膜层可以直接结合（例如，通过热焊接、激光焊接等）到外层7010的内表面7047，或者这样的膜层可以包括第二粘合剂层（例如，压敏粘合剂），其将邻近于层7010的背衬层与邻近于穿孔层7050的粘合剂层7040粘附。

在各种实施例中，密封层7040可以包括粘合剂、在水相环境中溶胀的溶胀材料、蜡（例如，微晶蜡）等及其组合。典型的溶胀剂包括亲水性交联聚合物，其在水性介质中溶胀至其自身重量的10至1000倍。合适的热活化和压力活化粘合剂的示例（例如，乙烯-乙酸乙烯酯（EVA）、乙烯-乙酸乙酯（EEA））在上文中参照图5A和5B进行了讨论。合适的热活化和压力活化粘合剂、蜡等在反应条件（例如，热循环条件）下至少部分软化或熔化以粘附到穿孔层7050，并且优选地，变形到穿孔层洞7055中，以基本密封阵列层7030的反应孔7035。在一个实施例中，热活化和/或压力活化粘合剂的熔点在约60℃至约100℃的范围内。

图8A和8B的实施例类似于图6A和6B和7A和图7B的实施例，除了原位密封材料8040设置在洞8055之间的穿孔层8050上而不是直接设置在阵列层上（参见，例如，图6A的密封材料6040设置在端部6051上）之外。如在前面的示例中，8040通常是指密封材料，8040a是指处于初始、未变形/未密封状态的密封材料，并且8040b是指处于变形/密封状态的密封材料。如图8A所示，反应容器8000被示为处于初始的未变形/未密封状态8000a。图8B图示了处于变形/密封状态8000b的反应容器8000。

反应容器8000包括第一外层8010、第二外层8020、阵列层8030、在阵列层8030中形成为一系列空隙或洞的多个反应孔8035以及穿孔层8050。用于制造第一外层8010、第二外层8020、穿孔层8050和阵列层8030的材料在本文的别处详细讨论。在所示实施例中，第二外层8020结合到阵列层8030的第一端8053，以密封孔8035的第一端。第二外层8020可以直接结合到阵列层8030的第一端8053（例如，通过热焊接或超声波焊接）或者层8020可以包括可以将层8020结合到阵列层8030的第一端8053的粘合剂层（例如，压敏粘合剂或热活化粘合剂）（未示出）。类似地，穿孔层8050可以结合到阵列层8030的与第一端8053相对的第二端8051，以部分地密封孔8035的第二端。穿孔层8050可以由可以直接结合到阵列层8030的第二端8051的膜层形成（例如，通过热焊接或超声波焊接）或穿孔层8050可以由包括粘合剂层（例如，压敏粘合剂或热活化粘合剂）（未示出）的膜层形成，粘合剂层可以将穿孔层8050结合到阵列层8030的第二端8051。

在图示的实施例中，反应容器8000包括设置在穿孔层8050的上表面8052上的密封材料8040，使得密封材料8040邻近于外层8010的内表面8047。在图示的实施例中，密封材料8040看起来是施加到邻近于洞8055的穿孔层8050上的密封材料的离散液滴或珠，但是这仅仅是说明性的。密封材料8040可以作为连续层施加在穿孔层8050顶上，或者，如将参考图9更详细讨论的，密封材料8040可以是施加到穿孔层8050的膜材料的一部分，或者，替代地，穿孔层8050可以由在一侧上具有原位密封材料的膜制成。在密封材料8040处于图8A所示的初始、未变形/未密封状态8040a的情况下，第一外层8010与密封材料8040分离，并且流体可以通过穿孔层8050的洞8055流入多个孔8035中。一旦流体样品已经填充了孔8035，就可以邻近于外层8010的外表面8049施加压力，以按压层8010以使其与密封材料8040接触，从而产生临时密封。当施加热和/或压力时（例如，在热循环反应中），密封材料可以变形并将外层8010的内表面8047粘附到处于密封状态8040b的密封材料8040，以形成更永久的密封。

在一个实施例中，密封材料8040可以直接施加到穿孔层8050的上表面8052。例如，密封材料8040可以是粘合剂、溶胀剂、蜡等或其组合，其被直接施加到穿孔层8050的上表面8052，使得密封材料邻近于外层8010的内表面。在示例实施例中，密封材料（例如，热敏粘合剂）可以作为连续涂层、液滴、网格线等施加到穿孔层材料上，并且然后可以形成穿孔，从而留下具有由密封材料8040为边界的洞8055的穿孔层8050。在另一个实施例中，密封材料8040（例如，液滴或网格线）可以在将穿孔层8050结合到阵列层8030之后施加。在又另一实施例中，密封材料8040可以是施加到穿孔层8050的膜层的一部分。在这样的实施例中，包括密封材料的膜层可以包括尺寸近似相同并且基本上对应于穿孔层8050中的洞8055的孔，或者替代地，密封材料层可以包括基本上大于穿孔层8050中的洞8055的洞。这种膜层可以直接结合（例如，通过热焊接、激光焊接等）到穿孔层8050。在另一个实施例中，这种膜层可以包括第二粘合剂层（例如，压敏粘合剂），其可以将承载密封材料的膜层粘附到穿孔层8050。

在另一个示例中，图8A和8B的实施例中的穿孔层可以由包括密封层的膜基材料制成。这种膜基材料9000的一个示例示意性地示于图9中。膜9000包括背衬层9002（例如，PET层）以及第一粘合剂层9004和第二粘合剂层9006。类似于8050的穿孔层可以通过在膜9000中制作类似于穿孔8055的穿孔并且然后将穿孔膜粘附到比如阵列8030的阵列上来制备。在各种实施例中，第一粘合剂层9004和第二粘合剂层9006可以是相同的粘合剂，或者它们可以是不同的粘合剂。例如，第一粘合剂层9004可以是粘合剂（例如，压敏粘合剂、辐射活化粘合剂（例如，紫外线催化的环氧树脂））、常规环氧树脂、表面活化的硅树脂、氰基丙烯酸酯、酮、乳胶、厌氧粘合剂或丙烯酸酯粘合剂），其被选择成用于将膜9000结合到阵列，优选地不加热，并且第二粘合剂层9006可以是密封层（例如，热敏粘合剂），其可以在反应条件（例如，热和压力）下形成原位密封，以在穿孔层的粘合剂层9006和反应容器外层的内表面之间形成永久或半永久密封。在一个实施例中，用于第二粘合剂层9006的粘合剂可以选自包括以下各者的组，但不限于此：热活化和/或压力活化粘合剂、在水相环境中溶胀的溶胀材料、蜡、水活化粘合剂及其组合。在一个实施例中，膜材料9000可以直接结合（例如，通过热焊接、激光焊接等）到阵列层。在另一个实施例中，这种膜层可以包括第二粘合剂层（例如，压敏粘合剂或热敏粘合剂），其可以将膜9000粘附到阵列。

人们还将理解，在图5A、5B、7A和7B所示的实施例中，诸如膜材料9000的膜可以用于制作施加到外层的密封材料。例如，第一粘合剂层9004可以是粘合剂（例如，压敏粘合剂），其被选择成用于将膜9000结合到外层（例如，到图7A和7B的外层7010的表面7047），优选地不加热，并且第二粘合剂层9006可以是密封层（例如，热敏粘合剂），其可以在选定的反应条件（例如，热和/或压力）下形成原位密封。取决于实施例，可以选择第一粘合剂层9004以将膜9000结合到第一层的邻近于阵列层或穿孔层的内表面，并且可以选择第二粘合剂层9006以在反应条件下在粘合剂层9006和阵列层的第二端之间（图5A和5B）或者在粘合剂层9006和穿孔层之间（图7A和7B）形成永久或半永久密封。

现在参考图10A-10C，图示了系统10000的横截面图。图10A-10C图示了如何可以在具有反应容器的仪器10005中形成原位密封的示例，该反应容器包括高密度反应区和原位密封特征。图10D图示了类似于图7A和7B所示的在10A-10C图的仪器中已经形成原位密封之后的高密度反应区。虽然系统10000所示的反应容器是图7A和7B所示的反应容器，但是人们将会理解，这仅仅是为了说明的目的，并且这里所示的任何反应容器都可以被接收在仪器10005中。

示出的带有系统10000的仪器10005包括加热器10010和压力换能器10020之间的开口，其被配置成接收包括高密度反应区和原位密封特征的反应容器。图10A-10C所示的仪器10005只是仪器的一部分，并且应当理解，加热器10010和压力换能器10020可以被包括在执行几种功能的仪器中，诸如图2的仪器800，或者加热器10010和压力换能器10020可以是被配置成用于向反应容器施加压力和热（例如，以用于核酸扩增的热循环）的独立仪器的一部分。

反应容器7000包括第一外层7010、第二外层7020、阵列层7030和形成为阵列层7030中形成的一系列空隙或洞的多个反应孔7035。在所示实施例中，第二外层7020结合到阵列层7030的第一端7053，以密封孔7035的第一端。阵列层的第二相对端7051包括位于阵列孔7035的开口上以充当物理屏障的穿孔层7050，穿孔7055允许流体样品流入孔7035中，但可有助于阻止流体从孔回流。反应容器7000还包括耦合到第一外层7010的内表面7047的密封层7040。在图示的实施例中，密封层7040可以响应于热和压力而变形以形成密封（例如，半永久密封），其在反应期间密封反应孔的开口，并且在移除热和压力之后仍然存在。在所示实施例中，7040通常指密封层，7040a指处于未变形/未密封状态的密封层，且7040b指处于变形/密封状态的密封层。

在图10A所示的初始步骤中，反应容器7000可以设置在加热器10010和压力换能器10020之间。在初始步骤中，加热器10010和压力换能器10020可能还没有被激活，并且密封层7040a和第一外层7010可能没有被压到与穿孔层7050接触，这允许用流体填充孔7035。用于加热器10010的加热器的合适示例可包括但不限于现有技术中已知的珀耳帖加热器和其他块加热器、电阻加热器、电磁加热器和薄膜加热器。压力换能器10020可以是机械或气动致动的，如上文参考图3的压力换能器880详细描述的。当期望对孔7035的内容物进行荧光激发和以及对来自孔7035的内容物的荧光进行检测时，压力换能器可以是透明的塑料囊或类似物，其可以在孔7035填充有反应混合物后在反应容器上膨胀。

在图10B中，压力换能器10020和加热器10010被激活。在图示的实施例中，压力换能器10020的致动具有将反应容器7000的第二外层7020压靠在加热器10010上的效果，以便于热从加热器10010传递到反应孔7035中的流体。同样，压力换能器10020的致动可以将层7010和7040压靠在穿孔层7050上，以密封关闭孔7035，并从高密度反应区清除多余的流体。在图示的实施例中，加热器10010和/或压力换能器10020的致动具有转换密封材料层7040以形成能够密封反应孔的密封的效果。

这种密封如图10所示。在这种情况下，在热和/或压力下，密封层7040从初始状态7040a变形到密封状态7040b，以在7042处粘附到穿孔层7050，并在7044处堵塞穿孔层7050中的洞7055。反应容器7000可以经历在加热器10010和第二外层7020之间的以10030指示的界面处的第一温度（T₀）、在10032处指示的第二中间温度（T_i）、以及在10034处指示的第三温度（T_s）。在一个说明性示例中，T₀可以是大约95-105℃（例如，大约96℃），T_i可以是大约95-100℃（例如，约95℃），并且T_s可以在约60℃至约100℃的范围内（例如，约65-95℃，约70-90℃，约75-85℃，或约80-85℃）。在一个实施例中，加热器10010可以被配置成用于等温反应，并且在反应条件下，T₀、T_i和T_s处存在的温度可以基本上是静态的。在另一个实施例中，加热器10010可以被配置成用于热循环，并且T₀、T_i和T_s处存在的温度可以不是静态的，但是当加热器10010处于热循环的高温部分时（例如，变性）可以最高并且当加热器10010处于热循环的较低温度部分时（例如，退火）可以更低。在一个实施例中，可以选择密封层7040的密封材料，使得其在T_s下的热和/或压力下变形，以形成密封反应孔7035的密封。例如，密封材料可以是具有软化点或熔点在约60℃至约100℃范围内（例如，约65-95℃，约70-90℃，约75-85℃，或约80-85℃）的热和压力活化粘合剂。然而，密封材料可以是在水相环境中溶胀的溶胀剂、蜡或由热和/或压力激活的类似物（例如，通过水蒸气）以形成密封反应孔7035的密封。

如图10D所示，当从反应容器7000移除热和压力时（例如，当从仪器10005移除反应容器时），密封材料7040b将再次固化以形成密封各个孔7035的密封。根据本文所述的方法和系统密封的反应孔可以保留一段时间，以用于随后的结果确认和/或在不同的仪器上进一步分析或重新读取。这种反应孔可用于测量孔与孔之间的可变性或不同仪器的仪器可变性。此外，根据本文所述的方法和系统密封的反应孔可用于制作标准（例如，荧光标准），其可以用于校准仪器。因为密封材料在原位形成密封，所以密封可以增强穿孔层的效果，以进一步防止流体在反应进行的同时流入或流出孔，从而基本上防止各个反应孔的内容物与其他反应孔的内容物互相混合。

示例

以下示例旨在说明本发明的实施例，并且不旨在限制说明书或所附权利要求的范围。

图11图示了在有和没有原位密封材料的情况下、在高密度反应区的孔中保留荧光材料的几个时间点（过程中，1周，3周）的时间过程实验。图11示出了在反应过程期间和反应过程之后原位密封以充分隔离各个孔的有效性。在图示的示例中，在具有和不具有原位密封层的阵列的微孔阵列中点涂了荧光染料的图案。在图5A-8B（例如，图7A和7B）中图示了用于形成原位密封的具有相关联材料的孔阵列的示例。两个阵列在反应阶段（过程中列）都显示出足够的临时密封。然而，当在稍后的时间点（3小时之后和1周之后）检查阵列时，没有原位密封层的阵列显示出荧光染料从原始孔到相邻孔的显著混合。相比之下，具有原位密封层的阵列显示出良好的密封，其中荧光染料基本上保留在原始孔中，并且几乎没有染料泄漏到相邻孔的迹象。

在该实施例中，具有施加于其上的乙烯-醋酸乙烯酯（EVA）原位密封材料层的膜材料以类似于图7A和7B所示实施例的布置放置在邻近于阵列孔开口端的外层内表面上。尽管在该示例中EVA被用作原位密封材料，但是也可以使用其它材料，诸如但不限于乙烯-乙酸乙酯（EEA）、乙烯-乙酸甲酯（EMA）、乙烯丙烯酸正丁酯（EnBA）、乙烯-丙烯酸（EAA）、热塑性聚氨酯（TPU）、聚己内酯、硅树脂橡胶、热塑性弹性体、蜡（例如，微晶蜡）、聚乙烯、聚丙烯、低密度聚乙烯、它们的共聚物以及它们的组合。合适的热活化和压力活化粘合剂、蜡等通常具有约60℃至约100℃范围内（例如，约65-95℃，约70-90℃，约75-85℃，或约80-85℃）的软化点或熔点。如参考图10C所示，原位密封材料经历的温度范围通常在反应（例如，热循环反应）期间处于该范围内。

热和压力不是唯一可以用于孔密封的原位反应成分。可以产生永久密封的其它原位过程包括但不限于：填充孔的液体可以活化液体敏感粘合剂层来密封孔；微孔可以填充有在填充孔时与粘合剂层反应的粘合剂催化剂、溶剂或试剂；或者微孔开口周围的吸湿材料可以在水的存在下扩展并堵塞开口。

权利要求中陈述的限制将基于权利要求中采用的语言被广义地解释，并且不限于前述详细描述中描述的特定示例，这些示例将被解释为非排他性和非穷尽性的。在权利要求的等同物的含义和范围内的所有变化都包含在它们的范围内。

还应当理解，某些实施例的各种特征可以与本公开的其他实施例兼容、组合、包括在本公开的其他实施例中和/或并入本公开的其他实施例中。例如，根据本公开的某些实施例的系统、方法和/或产物可以包括、并入或以其他方式包括在本文公开和/或描述的其他实施例中描述的特征。因此，与本公开的特定实施例相关的某些特征的公开不应被解释为将所述特征的应用或包含限制于特定实施例。此外，除非特征被描述为在特定实施例中是必需的，否则在各种实施例中描述的特征可以是任选的，并且可以不包括在本公开的其他实施例中。此外，除非特征被描述为需要另一个特征与之组合，否则本文任何特征可以与本文公开的相同或不同实施例的任何其他特征组合。