一种pH响应型水凝胶生物载体及应用
阅读说明：本技术 一种pH响应型水凝胶生物载体及应用 (pH response type hydrogel biological carrier and application ) 是由 赵兴卉 翟俊辉 杜红 王轲珑 于 2021-11-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种pH响应型水凝胶生物载体,所述pH响应型水凝胶生物载体由透明质酸钠与甲基丙烯酸酐在光引发剂存在的条件下,用365nm紫外激光照射,透明质酸钠侧链上的羟基通过光致交联经过酯化作用聚合而成透明质酸的甲基丙烯酸酯衍生物。本发明还公开了一种装载有治疗性蛋白PDGF-BB的pH响应型水凝胶生物载体。本发明采用原位自由基聚合的方法合成,反应条件温和,对PDGF-BB的生物活性不会产生影响；把PDGF-BB包裹在水凝胶内,避免暴露在酶环境中,提高了PDGF-BB生物活性的稳定性。(The invention discloses a pH response type hydrogel biological carrier, which is prepared by irradiating sodium hyaluronate and methacrylic anhydride with 365nm ultraviolet laser in the presence of a photoinitiator, and polymerizing hydroxyl on a sodium hyaluronate side chain through photocrosslinking and esterification to obtain a methacrylate derivative of hyaluronic acid. The invention also discloses a pH response type hydrogel biological carrier loaded with the therapeutic protein PDGF-BB. The invention adopts the method of in-situ free radical polymerization for synthesis, has mild reaction conditions, and does not influence the biological activity of PDGF-BB; PDGF-BB is wrapped in the hydrogel, so that exposure to an enzyme environment is avoided, and the stability of the biological activity of the PDGF-BB is improved.)
技术领域
本发明公开一种水凝胶生物载体，属于制药学技术领域。
背景技术
血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor, PDGF）是一种耐热、耐酸以及易被蛋白酶水解的阳离子糖蛋白，可由多种细胞分泌，如：血小板、成纤维细胞、巨噬细胞等等。PDGF有四种单体PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D，这些单体通过二硫键连接形成二聚体形式。其中，PDGF-B 的二聚体形式PDGF-BB作为一种有丝分裂促进剂，可以刺激成纤维细胞和平滑肌细胞增殖和迁移、促进巨噬细胞产生和分泌生长因子。在伤口修复、组织再生骨骼和牙齿再生以及关节修复方面的作用更为显著。尤其在伤口修复方面，是美国食品药品监督管理局（FDA）唯一批准的用于糖尿病溃疡治疗的生长因子。
伤口修复和组织再生类疾病需要生长因子在患病部位长期维持一定浓度，但PDGF-BB半衰期短（＜2min），容易被蛋白酶降解，而像慢性伤口床中存在大量蛋白酶，使得PDGF-BB更容易失活。一般会采用多次大剂量给药的方式来维持药物浓度，但这样存在致瘤的风险。所以本领域需要一种载体，所述载体既能够提高PDGF-BB稳定性，又同时能够长期维持一定的药物浓度，以保证PDGF用药的安全性和有效性。
发明内容
基于本领域存在的上述技术问题，本发明的目的就是提供一种水凝胶生物载体，该载体既能够通过可控性释放PDGF-BB的生物活性，提高其在药效作用上的稳定性，还能够通过所述载体的降解保证药物使用的生物安全性。
本发明综合考虑了甲基丙烯酸酐化透明质酸水凝胶的生物相容性和能够保护生长因子缓慢释放的特点，通过将PDGF-BB引入到甲基丙烯酸酐化透明质酸水凝胶网络中，制备得到结合生长因子型pH响应型水凝胶生物载体，目的在于提高传统水凝胶的生物相容性、pH响应性、细胞片层脱附和保护并缓慢释放生长因子等特性。
基于上述目的，本发明首先提供了一种pH响应型水凝胶生物载体，所述pH响应型水凝胶生物载体由甲基丙烯酸化透明质酸在光引发剂、交联剂存在的条件下，用365nm紫外激光照射引发交联反应制备而成。
在一个优选的技术方案中，所述光引发剂为I2959，所述交联剂为第一交联剂GDMA和第二交联剂AI102。
在另一个优选的技术方案中，所述甲基丙烯酸化透明质酸是由透明质酸钠与甲基丙烯酸酐以摩尔比例为 1：30经过酯化作用合成。
在一个优选的技术方案中，所述第一交联剂GDMA与第二交联剂AI102的摩尔比为(1-4):(0-2)。
其次，本发明提供了一种上述的pH响应型水凝胶生物载体的制备方法，所述方法包括使甲基丙烯酸化透明质酸在光引发剂、第一交联剂GDMA和第二交联剂AI102存在的条件下，用365nm紫外激光照射引发交联反应。
第三，本发明提供了一种装载有治疗性蛋白的上述的pH响应型水凝胶生物载体，所述装载有治疗性蛋白的pH响应型水凝胶生物载体装载是通过将水凝胶生物载体冻干，以干态浸泡法将治疗性蛋白负载在pH响应型水凝胶生物载体内制备而成。
在一个优选的技术方案中，所述治疗性蛋白为血小板衍生生长因子。
在一个更为优选的技术方案中，所述血小板衍生生长因子为BB型二聚体形式。
第四，本发明提供了上述的载有治疗性蛋白的pH响应型水凝胶生物载体的制备方法，所述方法包括将水凝胶生物载体冻干，以干态浸泡法将治疗性蛋白负载在pH响应型水凝胶生物载体内制备的步骤。
最后，本发明提供了上述的载有治疗性蛋白的pH响应型水凝胶生物载体在制备促进伤口修复和组织再生类药物中的应用。
本发明采用原位自由基聚合的方法合成pH响应型水凝胶生物载体，并使用干态浸泡法将治疗性蛋白负载在pH响应型水凝胶生物载体内，反应条件温和，对PDGF-BB的生物活性不会产生影响；把PDGF-BB包裹在水凝胶内，避免暴露在酶环境中，提高稳定性。PDGF-BB的释放是通过水凝胶的降解实现的，本发明选用了响应碱性pH值降解的两种交联剂：第一交联剂GDMA和第二交联剂AI102，两种交联剂的降解基于自身酯键基团，但这两种交联剂在碱性条件下降解速率不同。本发明提供的pH响应型水凝胶生物载体可根据伤口类型的不同，即，伤口部位的pH值的不同，通过控制配伍比例，从而控制了凝胶降解速度，以适应应用要求。鉴于人体伤口部位的pH值是在8.0左右，所述的两种交联剂在8.0时，降解的速度是不同的，第二交联剂比第一交联剂水溶性好，且含有的酯键数量相对较多，所以在降解速率上比第一交联剂快。通过调整两者的比例，例如GDMA：AI102比例为1：2时，释放速率最慢，这样就提供控制两个交联剂之间的比例实现水凝胶不同速率的降解。可以针对不同疾病以及伤口类型的治疗选择合适的交联剂比例（见图1）。
附图说明
图1：可控释放PDGF-BB pH响应性水凝胶制备的示意图；
图2：m-HA 1H-NMR谱图；
图3：可控释放PDGF-BB pH响应性水凝胶实物图；
图4：不同交联剂比例pH响应性水凝胶压缩性能测试；
图5：不同交联剂比例pH响应性水凝胶扫描电子显微镜图；
图6：不同交联剂比例pH响应性水凝胶溶胀率图；
图7：不同交联剂比例pH响应性水凝胶累计PDGF-BB释放速率图；
图8：pH响应性水凝胶细胞毒性实验；
图9：pH响应性水凝胶对于3T3细胞的迁移作用统计图；
图10. pH响应性水凝胶对于3T3细胞的迁移作用观察图；
图11.不同处理方式小鼠全层皮肤伤口愈合情况观察图；
图12.不同处理方式小鼠全层皮肤伤口面积随时间变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
实施例1. pH响应型水凝胶生物载体的制备
图1给出了PDGF-BB pH响应性水凝胶制备的示意图，其中A为甲基丙烯酸酐，B为透明质酸钠，1为第一交联剂GDMA，2为第二交联剂AI102。以下具体介绍制备步骤。
1. 甲基丙烯酸化透明质酸（m-HA）的制备
使透明质酸钠（HA）与甲基丙烯酸酐（MA）经过酯化作用合成透明质酸的甲基丙烯酸酯衍生物， 具体步骤包括如下：
（1）称取2g透明质酸钠（HA）粉末，溶解于100mL去离子水中，在4℃冰箱中搅拌过夜，将粉末充分溶解。
（2）通过加入5mol/L氢氧化钠调节HA溶液的pH，使反应的pH保持在8到9之间，随后在HA溶液中缓慢滴加1.6mL的甲基丙烯酸酐并在4℃连续搅拌反应24小时。
（3）随后，将m-HA沉淀在过量丙酮中，再用乙醇洗涤，然后溶解在50ml去离子水中。
（4）采用截留分子量为14000Da的透析袋用去离子水透析48小时，以去除未反应的甲基丙烯酸酐和其他副产物，获得纯化的m-HA，将其冻干备用。
以氘代水为溶剂溶解m-HA，浓度为6mg/ml，进行核磁表征，m-HA核磁图见图2。从1H-NMR谱图可以看出，在δ4.79ppm处为D2O的特征峰；δ3-4ppm为HA环结构中质子氢的特征峰；δ1.86ppm为HA中甲基上H的特征峰；δ2.03ppm为侧链N-乙酰葡糖胺上甲基H的特征峰。与HA核磁谱图相比，m--HA在δ5.68ppm和δ6.13ppm出现的两个新的峰为甲基丙烯酸酐中烯烃质子的特征峰，可以表明甲基丙烯酸酐成功接枝到了HA分子结构中。
2. pH响应型水凝胶生物载体的制备
装载有血小板衍生生长因子的m-HA水凝胶的制备
以m-HA为单体，GDMA（二甲基丙烯酸甘油酯，第一交联剂）和AI102（聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸丙烯酸酯，第二交联剂）为交联剂，然后加入引发剂I2959（2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮），在紫外光365nm处引发反应，制备成pH响应型水凝胶生物载体，随后将其冷冻干燥。
具体步骤如下：
取甲基丙烯酸化透明质酸、第二交联剂AI102制备成水溶液；第一交联剂GDMA和引发剂I2959分别加入DMSO制备成溶液；
将m-HA、AI102水溶液、I2959溶液、GDMA溶液在反应管中混合均匀，在365nm紫外光下反应2min，形成pH响应型水凝胶生物载体。将其冻干后，将PDGF-BB负载到水凝胶上。
其中第一交联剂GDMA：第二交联剂AI102的摩尔比为(1-4):(0-2)；
（1） 溶液配制：
取冻干m-HA 20mg，加入去离子水1ml，制成20mg/ml的溶液；
取AI102 50mg，加入去离子水500μl，制成100mg/ml的溶液；
取GDMA 250mg，加入DMSO 500μl，制成500mg/ml的溶液；
取I2959 100mg，加入DMSO1ml，制成100mg/ml的溶液。
（2）制备不同交联剂比例的水凝胶：
表1水凝胶合成参数（交联剂比例为GDMA：AI102）
将m-HA、AI102水溶液、I2959溶液、GDMA溶液在反应管中混合均匀，在365nm紫外光下反应2min，得到不同比例的水凝胶。
图3为可控释放PDGF-BB pH响应性水凝胶实物图。不同交联剂比例pH响应性水凝胶压缩性能测试结果如图4。随着交联剂量的增加，杨氏模量显著增加。杨氏模量越大，材料越不容易发生形变。相同的压缩应变下交联剂的量越多，水凝胶需要的应力就高，压缩模量就大。由结果可知，当GDMA：AI102=4：1时杨氏模量最大，说明受力时形变最小。
3. pH响应型水凝胶生物载体的PDGF-BB装载
使用干态浸泡法将PDGF-BB（购自军事医学科学院）装载于pH响应型水凝胶生物载体之中，即，待水凝胶完全冻干，将其浸泡在PDGF-BB溶液中，使PDGF-BB充分负载到水凝胶上。反应完成形成包含PDGF-BB的水凝胶。
具体步骤如下：
将水凝胶用打孔器打孔取样，制成直径为15mm，高度为8mm的圆柱体,随后将水凝胶冻干3天，之后将冻干的水凝胶浸泡于5ml浓度为50ng/ml的含有PDGF-BB溶液中48h，以确保水凝胶充分吸收，之后用PBS冲洗3次，将未结合到水凝胶中的PDGF-BB冲洗掉，制得结合生长因子的水凝胶生物载体。
实施例2. 装载有血小板衍生生长因子的m-HA水凝胶的表征
1、水凝胶形貌表征
将达到平衡溶胀的水凝胶样品置于-50℃的冻干机中冷冻干燥48h，所得样品在液氮中冷冻脆断后喷金制样，其截面形貌使用扫描电子显微镜（SEM）观察。图5为不同交联剂比例pH响应性水凝胶扫描电子显微镜图像。由此可见，交联剂比例越大，孔径越小，说明交联程度越高。当GDMA与AI102的摩尔比例为1：2时，交联程度最大。
2、水凝胶的溶胀率表征
利用冷冻干燥后的水凝胶支架进行溶胀性能测试。将水凝胶样品用打孔器打孔，制成直径为1.5cm，高度为12mm的圆柱体，随后将样品冻干。利用分析天平称量并记录各组水凝胶的原始重量 W0，然后将水凝胶置于10mL的 PBS 缓冲溶液中浸泡，观察水凝胶的溶胀变化，分别在 2 h，6 h，12 h，24 h，48 h 和 72 h 取样。用滤纸小心吸去水凝胶表面的水分，称量并记录水凝胶样品的重量 Wi，每种样品至少设置 3 个重复样，最后结果取平均值。水凝胶的溶胀率（W）可用以下公式计算：
溶胀率(W)＝(Wi–W0 )/W0×100％
如图6所示，当GDMA：AI102比例为1：0时，溶胀率最大。当两者比例为4：1时，溶胀率最小。水凝胶支架在刚开始 14 h 内，溶胀程度急剧上升，尤其是两种加入交联剂量少的水凝胶，主要是由于加入的交联剂少，交联度较低，形成的聚合物网络比较疏散，可以吸收大量的水。在浸泡 24 h 左右水凝胶支架达到了溶胀平衡。
3、不同交联剂比例pH响应性水凝胶释放动力学表征
将负载PDGF-BB的不同交联剂比例的干燥HA-MA水凝胶放置于pH=8的PBS缓冲液中，37℃水浴锅中温育，进行药物控释研究。在特定时间（1、2、3、4、5、7、10天）取出200μL的释放液，同时补充200μL纯净的PBS缓冲液。将收集的释放液通过酶联免疫反应（ELISA）测定释放的PDGF-BB的含量。
不同交联剂比例pH响应性水凝胶累计PDGF-BB释放速率图见图7。当GDMA：AI102比例为1：0时，释放速率最快。当两者比例为1：2时，释放速率最慢。
4. pH响应性水凝胶生物相容性表征
细胞毒性测试：
取制备好的不含PDGF-BB的水凝胶和含PDGF-BB的水凝胶适量加入24孔板中，加入适量只含P/S的培养基（pH=8），在培养箱中继续孵育24 h后，取出培养基，过0.22 μm滤膜。每孔中接种1×104个细胞，37 ℃，5% CO2条件下孵育过夜。把上述浸提液加入后继续孵育24h，然后使用CCK-8试剂盒来验证水凝胶是否具有细胞毒性。所用到的水凝胶的第一交联剂：第二交联剂的比例为1：2。
pH响应性水凝胶细胞毒性实验结果见图8。包裹不同浓度PDGF-BB的水凝胶的生物活性都大于75%，所以认为制备的水凝胶生物相容性良好。
5. pH响应性水凝胶对于3T3细胞的迁移作用
（1）无血清 DMEM 培养基(pH=8)配制：取 0.5 ml 双抗，然后加入 49.5 ml DMEM高糖培养基。
（2）把直尺和记号笔放在超净台紫外杀菌 30 min，然后把 DMEM 完全培养基， 1×PBS 放到 37 ℃水浴锅温育 20 min，胰酶放在室温条件下温育。
（3）铺板：取 6 孔板，在板背部，用记号笔画 5 条过孔的横线。将细胞稀释成5×104个/ml，每孔接种 2 ml。37 ℃，5% CO2条件下孵育，使孔板底部被单层铺满。
（4）为了消除完全培养基促进细胞增殖迁移对于结果的影响，加样前12 h，换成只含 P/S 的培养基。用10μL 枪头垂直于标记线方向划直线。移除旧培养基，用 1×PBS 冲洗3 次以除去划落的细胞。
（5）用无血清 DMEM 培养基分别浸泡不含PDGF的水凝胶和包含PDGF-BB的水凝胶。取上述提取液 2 ml 分别加入到各个孔中。设置空白组（只含 P/S 的培养基）。加样后放入5% CO2，37 ℃培养箱孵育。在同一个视野下分别拍摄 0、12、24、36、48 h的照片，使用Image J 软件计算面积，进而计算出细胞迁移率。
图9为pH响应性水凝胶对于3T3细胞的迁移作用统计图；图10为 pH响应性水凝胶对于3T3细胞的迁移作用观察图。所用到的水凝胶的第一交联剂：第二交联剂的比例为1：2。与只含有水凝胶的对照组相比，使用未包裹的 PDGF-BB和水凝胶包裹的PDGF-BB作用的细胞，3T3细胞不断向中间部位迁移，划痕面积显著减小。通过 ImageJ 定量伤口面积，发现未包裹PDGF-BB 的水凝胶的细胞迁移率在36h 内能达到37%，包裹PDGF-BB的水凝胶细胞迁移率在36 h 时间内能达到42%，而对照组细胞迁移率仅为10%左右。这证明了包裹PDGF-BB的水凝胶能够促进 3T3 细胞迁移，可能对于伤口愈合具有促进作用。
6.小鼠全层皮肤伤口愈合实验：
将小鼠分为不含PDGF-BB的水凝胶和含PDGF-BB的水凝胶三组。所用到的水凝胶的第一交联剂：第二交联剂的比例为1：2。负载药物的水凝胶原位注射至伤口部位(pH=8)，随后覆盖非粘性无菌敷贴，并用3M敷贴固定。分别在不同时间点（0、3、7、10、14天）对小鼠伤口进行拍照，使用直尺作为参照。伤口面积使用Image J软件计算。
创面闭合率%=（S0-SN）/S0×100
其中，S0为初始创面面积，SN为N天时创面面积
图11是不同处理方式小鼠全层皮肤伤口愈合情况图示。从图11中可以看到糖尿病小鼠的伤口都在逐渐缩小，但水凝胶包裹的PDGF-BB组与其他两组相比，伤口愈合更显著。图12的小鼠伤口面积随时间变化曲线显示，7 d时，3组的平均伤口面积分别为83.4%，72.8%和65.0%；14 d时，3组的平均伤口面积变为54.9，25.1%和7.8%，与其他两组相比，水凝胶包裹的PDGF-BB组伤口面积减小的最多，由此可以看出水凝胶包裹的PDGF-BB组有利于伤口愈合。