Cy7-Cl及其在制备抗结直肠癌药物中的应用
阅读说明：本技术 Cy7-Cl及其在制备抗结直肠癌药物中的应用 (Cy7-Cl and application thereof in preparation of anti-colorectal cancer drugs ) 是由 张磊 汤昆 王群 邱娜 崔昆丽 史霄 滕铁山 程小霞 陈明亮 刘楠 贾爽爽 梁 于 2021-09-07 设计创作，主要内容包括：本发明属于化工医药技术领域,本发明涉及1,7-二[N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-3,3-二甲基-3H-吲哚]-4-氯-3,5-环己烯基三碳菁溴化盐染料及其在制备抗结直肠癌药物中的应用(简称Cy7-Cl)。MTT结果显示：Cy7-Cl显著抑制结直肠癌HCT116细胞、SW480细胞活力。AnnexinV-FITC/PI双染凋亡检测结果显示：Cy7-Cl显著诱导细胞凋亡。本发明的小分子化合物Cy7-Cl作为新的抗结直肠癌药物或者其辅助成分进行开发,抑制结直肠癌效果显著,将为治疗和治愈结直肠癌提供新的途径和手段。(The invention belongs to the technical field of chemical medicines, and relates to a 1, 7-bis [ N- (3, 5-bis (2- (2-methoxyethoxy) ethoxy) benzyl-3, 3-dimethyl-3H-indole ] -4-chloro-3, 5-cyclohexenyl tricarbocyanine bromide dye and application thereof in preparation of anti-colorectal cancer drugs (Cy 7-Cl for short). MTT results show that: cy7-Cl significantly inhibited colorectal cancer HCT116 cell and SW480 cell viability. The annexin V-FITC/PI double-staining apoptosis detection result shows that: cy7-Cl significantly induced apoptosis. The small molecular compound Cy7-Cl is developed as a novel anti-colorectal cancer drug or an auxiliary component thereof, has a remarkable effect of inhibiting colorectal cancer, and provides a novel way and means for treating and curing colorectal cancer.)
技术领域
本发明属于化工医药技术领域，具体涉及一种新型三碳菁花菁染料Cy7-Cl及其在制备抗结直肠癌药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年增加，已经成为威胁人类健康的最严重疾病之一。结直肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，其发生通常与饮食改变和环境因素有关，发病率和死亡率均偏高。结直肠癌是世界上第四大死亡原因，男性中第三大常见癌症，女性中第二大常见癌症，死亡率居第二位。结直肠癌仍是世界癌症相关死亡的主要原因。在中国，据2019年国家癌症中心发表的全国癌症统计数据，结直肠癌发病率位居全国第三位，占癌症总发病人口数的9.8％，严重危害着我国居民的健康，已经成为亟待解决的公共卫生问题。临床上结直肠癌治疗方式仍以手术治疗、放疗、化疗为主。结直肠癌主要的临床化疗药物包括：奥沙利铂、伊立替康、氟尿嘧啶类药物(如5-氟尿嘧啶)。然而奥沙利铂、伊立替康和5-氟尿嘧啶等药物均有可预测的肝脏毒性，限制了其在临床上的使用。因此，开发一种高效低毒的结直肠癌治疗药物迫在眉睫。
目前，七甲川花菁染料在肿瘤诊疗领域被广泛研究应用于肿瘤诊断、化疗、光动力疗法及光热治疗。七甲川花菁染料本身具有较低的细胞暗毒性，因此，在化疗研究中，花菁分子常作为化疗药物递送系统中的指示剂或者通过光热或者光动力治疗发挥作用。Shi课题组报道了系列苯环、多碳链、羧基等修饰的七甲川花菁化合物通过光热光动力原理治疗肿瘤的研究，该系列化合物与本发明的化合物修饰结构不同，且本申请的化合物Cy7-Cl未通过光热、光动力作用即可诱导结直肠癌细胞凋亡。Ja-Hyoung Ryu课题组通过多碳链修饰的七甲川花菁化合物和透明质酸组装获得一种应用光动力治疗肿瘤的高分子材料。然而，纳米材料类的多功能光敏剂将面临很多难题，比如稳定地大规模制备工艺、大部分被吸收和滞留在网状内皮组织器官、长期毒性等，导致大部分纳米材料类的多功能光敏剂还停留在早期开发阶段。因此，开发不依赖于纳米高分子材料、也不需要复杂的化学连接，而是基于本身化学结构内在多功能特性的化学小分子类七甲川花菁化合物，可望避免上述问题，大大提高临床转化应用的潜力，推进和扩大肿瘤光学治疗的前景。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种新型花菁染料Cy7-Cl，及其作为药物的新用途，具体为Cy7-Cl在制备抗结肠癌药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：所述Cy7-Cl的化学结构如下所示：
其相关性质如下：
化学名称：1,7-二[N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-3,3-二甲基-3H-吲哚]-4-氯-3,5-环己烯基三碳菁溴化盐染料，简称Cy7-Cl。
分子式：C72H100O16N2ClBr；分子量：1364.9257；检测方式：1HNMR,13C NMR,HRMS；性状：本品为淡蓝色粉末；来源：本实验室合成。药理性质：不溶于水，溶于DMSO。
进一步的，所述Cy7-Cl抑制结直肠癌细胞作用浓度范围为0.04875－6.25μM。
本发明提供了一种体外抑制结直肠癌细胞活力的方法，其将Cy7-Cl加入肿瘤细胞的培养液中，加入Cy7-Cl的终浓度分别为0.04875μM、0.0975μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM。
流式细胞术和荧光显微镜结果显示，Cy7-Cl诱导结直肠癌HCT116细胞、SW480细胞产生活性氧，其将Cy7-Cl加入肿瘤细胞的培养液中，加入Cy7-Cl的终浓度分别为0.195μM、0.78μM、3.12μM；激光共聚焦结果显示，Cy7-Cl定位到线粒体中。因此，本发明公开了一种定位到线粒体的方法，其将Cy7-Cl加入肿瘤细胞的培养液中，加入Cy7-Cl的终浓度为0.78μM。
本发明还提供了一种体外诱导结直肠癌细胞凋亡的方法，其将Cy7-Cl加入肿瘤细胞的培养液中，加入Cy7-Cl的终浓度分别为0.195μM、0.78μM、3.12μM。
本发明所述直肠癌细胞可以是结直肠癌HCT116细胞、SW480细胞。
本发明还提供了一种抗结直肠癌药物，该抗结直肠癌药物的活性成分为Cy7-Cl，其合成路线如下：
本发明的有益效果。
本发明合成的Cy7-Cl是一种花菁衍生物，目前该类化合物大多数是通过光热光动力疗法发挥抗肿瘤作用，而Cy7-Cl不需要光热光动力就能发挥抗肿瘤作用。尤其是本发明提供了Cy7-Cl在制备抗结直肠癌药物中的应用。MTT结果显示：Cy7-Cl显著抑制结直肠癌细胞的增殖，并产生活性氧和定位到线粒体中。AnnexinV-FITC/PI双染凋亡检测结果显示：Cy7-Cl诱导结直肠癌细胞凋亡。本发明的小分子化合物Cy7-Cl作为新的抗结直肠癌药物或者其辅助成分进行开发，抑制结直肠癌效果显著，将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。
附图说明
图1.Cy7-Cl结构鉴定1H NMR(400MHz,DMSO-d6)图谱数据。
图2.Cy7-Cl结构鉴定13C NMR(400MHz,DMSO-d6)图谱数据。
图3.Cy7-Cl结构鉴定HRMS(ESI)图谱数据。
图4.Cy7-Cl抑制结直肠癌HCT116(图A,C)和SW480(图B,D)细胞活力的测定；E图为阳性对照组CY5-PY-1对SW480细胞的抑制活性。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
图5.Cy7-Cl与激光照射联合作用对结直肠癌HCT116(图A)和SW480(图B)细胞活力无显著影响的测定，胞外光热法测定激光照射对Cy7-Cl无显著影响的测定(图C)。
图6.小分子抑制剂Ferrostatin(铁死亡抑制剂)(图A,B)、Necrostatin(坏死抑制剂)(图C,D)、N-乙酰半胱氨酸(抗氧化剂)(图E,F)、Z-VAD-FMK(凋亡抑制剂)(图G,H)与Cy7-Cl联合作用对结直肠癌细胞HCT116和SW480活力影响的测定。N-乙酰半胱氨酸、Z-VAD-FMK与Cy7-Cl联合作用促进HCT116(图E,G)和SW480(图F,H)细胞增殖的测定。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
图7.Cy7-Cl诱导结直肠癌细胞HCT116(图A)和SW480(图B)定位到线粒体中的测定。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
图8.Cy7-Cl诱导结直肠癌HCT116(图A,C)和SW480(图B,D)细胞活性氧产生的测定。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
图9.Cy7-Cl诱导HCT116(图A)和SW480(图B)细胞线粒体膜电位下降。
图10.Cy7-Cl诱导结直肠癌HCT116(图A)和SW480(图B)细胞ATP水平下降的测定。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
图11.Cy7-Cl诱导结直肠癌HCT116(图A)和SW480(图B)细胞凋亡的测定。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
图12.Cy7-Cl对促凋亡相关蛋白表达上调和抗凋亡蛋白表达下调的测定(图A，B)。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实验方法：
步骤(1)N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚溴化盐的合成(3)。
向100mL二口圆底烧瓶中加入化合物1(1.95g，12.27mmol，1.25eq)，化合物2(4.86g，9.81mmol，1.0eq)和乙腈40mL，搅拌10min，氩气保护下60℃反应72h，TLC监控反应结束，旋蒸除去乙腈，真空干燥得红色粘稠液体。粗品经柱层析(200-300目硅胶，流动相：甲醇:二氯甲烷＝1:20)分离得红色固体化合物3：3.71g，产率：79.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.20(d,J＝1.6Hz,1H),7.04(dd,J＝1.6Hz,8.4Hz,1H),6.72(dd,J＝1.6Hz,8.4Hz,1H),6.61(d,J＝8.4Hz,1H),6.37(m,3H),4.67(s,2H),4.01-3.99(m,4H),3.91-3.87(m,2H),3.69-3.67(m,4H),3.55-3.48(m,12H),3.42-3.39(m,4H),3.22(s,6H),1.32(s,6H)。
步骤(2)1,7-二[N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-3,3-二甲基-3H-吲哚]-4-氯-3,5-环己烯基三碳菁溴化盐染料(简称Cy7-Cl)的合成
置化合物3(781.6mg,1.36mmol,2.0eq)，化合物4(117.4mg,0.68mmol,1.0eq)和乙酸钠(167.3mg,2.04mmol,3.0eq)于100mL Schlenk瓶中，加入乙酸酐40mL，氩气保护下升温至100℃，反应4h，TLC监控反应结束，冷却至室温，旋蒸除去溶剂得粗品，经柱层析(300-400目硅胶，流动相：甲醇:二氯甲烷＝1:15)分离得绿色固体化合物cy7-cl：399.1mg，产率：43％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.28-8.24(d,J＝14Hz,2H),7.68-7.66(d,J＝7.6Hz,2H),7.42-7.41(m,4H),7.33-7.28(m,2H),6.49-6.48(m,2H),6.43-6.40(m,6H),5.43(s,4H),4.04-4.01(m,8H),3.69-3.67(m,8H),3.54-3.46(m,24H),3.40-3.37(m,8H),3.20(s,12H),2.58-2.57(m,4H),1.78-1.76(m,2H),1.71(s,12H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ172.8,160.0,148.7,143.4,142.3,140.8,137.3,128.7,126.9,125.4,122.6,111.7,105.5,102.3,100.0,71.2,69.9,69.8,69.6,68.8,67.3,58.0,49.1,48.5,47.1,27.6,25.8,21.1,20.2；HRMS(ESI)：calcd for C71H100ClN2O16Br[M-Br]+1283.6761，found[M-Br]+1283.0201，[M-Br+Na]2+653.9965。
Cy7-Cl结构鉴定图谱数据为图1、图2、图3。
Cy7-Cl溶于DMSO中，配置成50mM母液备用。
应用实例1、MTT法和细胞克隆实验测定Cy7-Cl对结直肠癌细胞的生长抑制作用
HCT116细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)按3×103/孔接种至96孔板，应用5％CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640完全培养基37℃培养12h，加入不同浓度(分别为0.04875μM、0.0975μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM)的Cy7-Cl，每个浓度设定5个复孔，继续培养48h，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力。
测定方法为：15μL/孔加入预先配制好的MTT反应液，继续培养4h，吸弃上清，100μL/孔加入DMSO溶解还原产物，490nm波长处读取吸光度值，计算细胞存活率，以测定Cy7-Cl干预孔吸光度值/对照孔吸光度值作为细胞活力，并以此计算Cy7-Cl对结直肠癌HCT116细胞、SW480细胞的IC50值。
IC50指细胞生长被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为HCT116细胞数量为对照组一半时Cy7-Cl的浓度。
结果：Cy7-Cl对结直肠癌HCT116细胞的IC50值为0.8178μM(图4A)。
同样的方法测定Cy7-Cl对SW480细胞的抑制作用，结果其对SW480细胞的IC50值为0.941μM(图4B)。
每孔取500个HCT116细胞接种于6孔细胞培养，37℃、5％CO2培养箱RPMI1640完全培养基培养24－48h后，梯度药物处理，药物浓度分别为0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM。药物处理48h后更换正常完全培养基继续培养，空白组长成一定数量肉眼可见的菌落后，吸去培养基，PBS洗涤1次，每孔加入1ml 4％多聚甲醛固定30-60min，PBS洗涤1次；每孔加入1％结晶紫染液1ml，染色10-20min；PBS洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照，结果显示：Cy7-Cl显著抑制HCT116细胞的增殖(图4C)。
同样的方法测定Cy7-Cl对SW480细胞的影响，结果显示：Cy7-Cl显著抑制SW480细胞的增殖(图4D)。
接下来，进一步验证与Cy7-Cl结构相近的化合物CY5-PY-1(结构式如下，)对SW480细胞的抑制活性，结果其对SW480细胞的IC50值为21.3μΜ，可见本发明化合物对结肠癌细胞的抑制活性提高了20倍以上，具体见图4E。
应用实例2、MTT法测定激光照射和Cy7-Cl联合对结直肠癌细胞生长的影响
参照应用实例1，96孔板隔孔铺，96孔板加药培养24h后进行激光照射，照射条件为1W，5min，808nm。激光照射24h后采用MTT法测定Cy7-Cl对结直肠癌HCT116细胞的影响，结果显示：激光照射和Cy7-Cl联合作用对HCT116细胞活力无显著影响(图5A)。
同样的方法测定Cy7-Cl对SW480细胞的影响，结果显示：激光照射和Cy7-Cl联合作用对SW480细胞活力无显著影响(图5B)。
应用实例3、胞外光热法法测定激光照射对Cy7-Cl的影响
将Cy7-Cl加入肿瘤细胞的培养液中，96孔板中加入200μL含Cy7-Cl的培养基后进行激光照射，加入Cy7-Cl的终浓度为0.04875－6.25μM，照射条件为1W，5min，808nm，结果显示：光热对Cy7-Cl无显著影响(图5C)。
应用实例4、MTT法测定小分子抑制剂Ferrostatin(铁死亡抑制剂)、Necrostatin(坏死抑制剂)、N-乙酰半胱氨酸(抗氧化剂)、Z-VAD-FMK(凋亡抑制剂)对Cy7-Cl抑制结直肠癌细胞活力的影响
参照应用实例1，加药前配置一定量含抑制剂的培养基，用含有抑制剂的培养基加入不同浓度的Cy7-Cl，每个浓度设定5个复孔，继续培养48h，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力，结果显示：Ferrostatin和Necrostatin与Cy7-Cl联合对HCT116细胞增殖能力无明显影响(图6A,C)；N-乙酰半胱氨酸、Z-VAD-FMK与Cy7-Cl联合显著促进HCT116细胞增殖(图6E,G)。
同样的方法测定各种小分子抑制剂与Cy7-Cl联合作用对SW480细胞的影响，结果显示：Ferrostatin和Necrostatin与Cy7-Cl联合对HCT116细胞增殖能力无明显影响(图6B,D)。N-乙酰半胱氨酸、Z-VAD-FMK与Cy7-Cl联合显著促进SW480细胞增殖(图6F,H)。
应用实例5、Cy7-Cl诱导结直肠细胞定位到线粒体
取HCT116细胞1×104接种于玻底培养皿中，应用5％CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养12h，加入0.78μM的Cy7-Cl，继续培养48h。按照1：10000的比例配置Mito-Tracker Green工作液，工作液37℃孵育5-10min，弃去培养液，Nacl洗一次，加入工作液，37℃孵育15-45min，孵育结束后吸掉废液，Nacl洗一次，加入无血清RPMI 1640，上机观察并拍照，结果显示：Cy7-Cl诱导HCT116细胞定位到线粒体中(图7A)。
同样的方法观察Cy7-Cl对SW480细胞定位的影响，结果显示：Cy7-Cl诱导SW480细胞定位到线粒体中(图7B)。
应用实例6、荧光显微镜法和流式细胞术法测定Cy7-Cl对结直肠癌细胞活性氧产生的影响
HCT116细胞按2.5×105/孔接种至24孔板，应用5％CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养12h，加入不同浓度(分别为0.195μM、0.78μM、3.12μM)的Cy7-Cl，继续培养48h，弃培养液，按照1：1000的比例配置染色液，加入染色液后放37℃细胞培养箱中孵育40min左右，孵育完成后PBS洗涤2次，加入少许无血清RPMI 1640，上机观察并拍照,结果显示：Cy7-Cl显著诱导HCT116细胞活性氧水平升高(图8A)。
同样的方法观察Cy7-Cl对SW480细胞活性氧产生的影响，结果显示：Cy7-Cl显著诱导SW480细胞活性氧水平升高(图8B)。
HCT116细胞按1×105/孔接种至6孔板，应用5％CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养12h，加入不同浓度(分别为0.195μM、0.78μM、3.12μM)的Cy7-Cl，继续培养48h，弃培养液，无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，PBS洗涤3次，弃废液，按照1：1000的比例配置染色液，加入染色液后放37℃细胞培养箱中孵育40min左右，每5min颠倒吹打一次。孵育完成后离心，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测，结果显示：Cy7-Cl显著诱导HCT116细胞活性氧水平升高(图8C)。
同样的方法测定Cy7-Cl对SW480细胞ROS产生的影响，结果显示：Cy7-Cl显著诱导SW480细胞活性氧水平升高(图8D)。
应用实例7、JC-1染色法测定Cy7-Cl诱导线粒体膜电位下降
参照应用实例6铺24孔板和加药，配置4mL JC-1染色工作液，具体配置为：10μLJC-1(200成)+1.6mL超纯水+0.4mL JC-1染色缓冲液(5成)。吸去废液，Nacl洗一次，每个孔加入500μL JC-1工作液，37℃孵育40min左右。配置5mL染色缓冲液，具体配置为：1mL JC-1染色缓冲液+4mL超纯水。孵育结束后，吸去废液，用JC-1染色缓冲液洗涤2次。洗涤结束后，每孔加500μL完全培养基，避光，上机观察并拍照，结果显示：Cy7-Cl显著诱导HCT116细胞线粒体膜电位下降(图9A)。
JC-1荧光探针可快速灵敏地检测线粒体膜电位变化。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。这样就非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降。
同样的方法观察Cy7-Cl对SW480细胞线粒体膜电位的影响，结果显示：Cy7-Cl显著诱导SW480细胞线粒体膜电位下降(图9B)。
应用实例8、Cy7-Cl对结直肠癌细胞ATP产生的影响
参照应用实例6铺6孔板，加药和收集细胞，每个EP管中加入200μL提取液，裂解细胞，为充分裂解细胞，可以使用移液枪进行反复吹打使裂解液充分接触并裂解细胞。裂解后，4℃，12000g，5min离心，取上清，冰浴上溶解待用试剂，按照每个样品需要100μL ATP检测工作液，ATP检测试剂稀释液和ATP检测试剂按照1：9的比例配置。在96孔板中隔孔加入100μL检测工作液后，室温静置5min，每孔再加入20μL样品，多功能酶标仪检测，结果显示：Cy7-Cl显著诱导HCT116细胞ATP水平下降(图10A)。
细胞在凋亡状态下，ATP水平会下降，ATP水平的下降表明线粒体功能受损或者下降，在细胞凋亡时ATP水平的下降通常与线粒体膜电位下降同时发生。
同样的方法测定Cy7-Cl对SW480细胞ATP产生的影响，结果显示：Cy7-Cl显著诱导SW480细胞ATP水平下降(图10B)。
应用实例9、AnnexinV-FITC/PI双染测定Cy7-Cl诱导结直肠癌细胞的凋亡
参照应用实例6铺6孔板，加药，37℃、5％CO2培养箱RPMI 1640完全培养基培养48h。无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，PBS洗涤3次，分别加入500μL的Binding Buffer，5μL(2.5μg/ml)的Annexin-V-FITC和5μL(50μg/ml)PI(碘化丙啶)，注意避光，染色15min后用流式细胞仪测定。Annexin-V-FITC和PI的染色结果显示：Cy7-Cl显著诱导HCT116细胞凋亡(图11A)。
同样的方法测定Cy7-Cl对SW480细胞凋亡的影响，结果显示：Cy7-Cl显著诱导SW480细胞凋亡(图11B)。
应用实例10、Western blot法测定Cy7-Cl对凋亡相关蛋白表达的影响
制胶；上样；电泳，转膜恒流300mA，1.5h；应用脱脂牛奶封闭PVDF膜摇床孵育1h；用杂交袋将PVDF膜浸在一抗中，4℃孵育过夜；TBST洗3次，每次10min；二抗室温摇床孵育1h；TBST洗3次，每次10min；最后进行蛋白检测。结果显示：Cy7-Cl调节HCT116细胞凋亡相关蛋白表达，比如，上调促凋亡蛋白Bax、Cytc、cleaved-caspase3的表达，下调抗凋亡蛋白BCL-2的表达，表明Cy7-Cl显著诱导HCT116细胞凋亡(图12)。
同样的方法测定Cy7-Cl对SW480细胞凋亡的影响，结果显示：Cy7-Cl调节SW480细胞凋亡相关蛋白表达，比如，上调促凋亡蛋白Bax、Cytc、cleaved-caspase3的表达，下调抗凋亡蛋白BCL-2的表达，表明Cy7-Cl显著诱导SW480细胞凋亡(图12)。
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