具体实施方式

有鉴于上述待解决的问题，本发明提出一种体外活化免疫细胞的方法，该方法是以含有Muparfostat的培养基进行外周血单个核细胞的培养，有效抑制自然杀伤细胞及T细胞于细胞表面表达LAG-3，藉由阻断细胞抑制性讯号的传递，增强自然杀伤细胞及T细胞的活性。

定义

除非另有定义，所有在此使用的技术及科学术语，具有与本领域普通技术人员一般所理解的意义相同的意义。当有所冲突时，以本文件及其所定义者为准。

于此处所使用者，「约」、「大约」、或「大概」一般应指一特定数值或范围的20％以内，较佳10％以内，及更佳5％以内。在此所使用的数值为近似值，代表若未明示地陈述，「约」、「大约」、或「大概」等词可以被推断适用。

于本发明中，「自然杀伤细胞」(natural killer cell)或「NK细胞」是指细胞表面抗原呈现CD3^-CD56⁺的细胞。

于本发明中，「T细胞」(T cell)是指细胞表面抗原呈现CD3⁺的细胞。

于本发明中，「免疫细胞」是指外周血单个核细胞中的淋巴球细胞。

于本发明中，免疫细胞被「活化」是以下列方式判断：当NK细胞或T细胞不表达LAG-3时，该NK细胞或该T细胞具有较佳的活性。

材料与方法

本发明所述外周血检体，是依据伦理委员会通过的计划，自受试者手臂采集全血，置于无菌采血管，于室温存放待后续处理。

本发明所使用的基础培养基可选用自：CellGro SCGM(CellGenix公司)、KBM 501(Kohjin Bio公司)、AIM-V(Thermo Fisher公司)、X-VIV015(Lonza公司)、DMEM或RPM1-1640等市售的基础培养基。

本发明所述培养基中，有时含有适当的蛋白质、细胞激素、抗体、血清、化合物等成分。所述细胞激素有时为白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)或白介素-21(IL-21)。

制备muparfostat(PI-88)及包含其中的硫化磷酸甘露聚醣成份的方法已被美国专利公开号20140135282以及P.N.Handley等人所揭示(2017年)。P.N.Handley等人发表于醣类研究446-447第68至75页的「对酵母菌Pichia(Hansenula)holstii NRRL Y2448磷酸甘露聚醣的寡糖磷酸盐级分的新结构洞悉」一文中，揭示了PI-88的硫化磷酸甘露聚醣成份的以下化学结构通式：

自血液检体分离外周血单个核细胞的方法

抽取7.5-8ml的血液于采血管中，该采血管含有抗凝血剂-肝素，以及Ficoll-Hypaque试剂，外加一聚脂凝胶隔层以分离前述二液体。于室温下以1800g将采血管离心20分钟。离心完成后，收集血浆分层用于后续的细胞培养，并留下5至10mm的血浆层于接口上，操作时不扰动细胞层。接着以移液器收集接口的外周血单个核细胞层至15ml圆锥形管中，以10ml磷酸盐缓冲生理食盐水(Phosphate buffer saline；简称PBS)清洗PBMC并翻转圆锥形管5次，再以400g进行离心5分钟。重复前述清洗步骤两次之后，以5ml的PBS将细胞再悬浮。计算细胞数，通常1ml全血能够分离出1.3x10⁶的PBMC。

体外活化免疫细胞的方法

将PBMC以每孔1x10⁶细胞的密度置于六孔细胞培养盘，并加入培养基，在37℃及5％CO₂的环境下培养。所述培养基是以AIM-V培养基(Thermo Fisher Scientific公司)为基础培养基，并添加浓度范围介于500～1000IU/ml的白介素-2(Novartis公司)，以及添加浓度为300μg/ml的Muparfostat。此后，每隔二至三天观察细胞的生长状况，依细胞生长状况更换新鲜的NK细胞培养基至第18天为止。培养期间，每隔二至三天添加浓度范围介于500～1000IU/ml的白介素-2(Novartis公司)；每日添加浓度为300μg/ml的Muparfostat。最后，将培养盘中的细胞与培养基混合液移至离心管，以离心方式收集所述混合液中的细胞，再以PBS清洗，重复此步骤三次后，以PBS将细胞均匀的打散，如此即获得活化后的免疫细胞。

以流式细胞仪分析细胞表面抗原

以2x10⁵细胞/200μl将活化后的细胞置于96孔盘，并加入3μl荧光标记的抗体于4℃反应30分钟，接着以PBS清洗3次后，加入400μl的PBS悬浮细胞，再以流式细胞仪分析细胞表面的荧光标记。上述荧光标记的抗体包含anti-CD3抗体(clone UCTH1)、anti-CD56抗体(clone HCD56)以及anti-LAG-3抗体(clone 11C3C65)。

PBMC与癌细胞株共同培养的测试

将1x10⁶的A549癌细胞株及3x10⁶的HepG2癌细胞株置于T25细胞培养瓶中，添加适量培养基后培养一天。隔日，将癌细胞株以PBS清洗后，与新鲜制备的3x10⁶的外周血单个核细胞共同培养，在37℃及5％CO2的环境下培养至第四天。每日于实验组的培养基添加浓度为300μg/ml的Muparfostat；对照组则于培养期间不添加Murpafostat。第四天，将细胞与培养基混合液移至离心管，以离心方式收集所述混合液中的细胞，再以PBS清洗以2x10⁵细胞/200μl将活化后的细胞置于96孔盘，并加入3μl荧光标记的抗体于4℃反应30分钟，接着以PBS清洗3次后，加入400μl的PBS悬浮细胞，再以流式细胞仪分析细胞表面的荧光标记。上述荧光标记的抗体包含anti-CD3抗体(clone UCTH1)、anti-CD56抗体(cloneHCD56)以及anti-LAG-3抗体(clone 11C3C65)。

以Western印迹法分析LAG-3蛋白质表达

将外周血单个核细胞以前述“体外活化免疫细胞的方法”所述的方法培养至第18天后，以RIPA溶液(Tris-HCl 50mM pH 7.5,NaCl 150mM,NP-40 1％,SDS 0.1％)裂解培养后的PBMC以及CMV3-His-LAG-3转殖的293ft细胞(阳性对照组)。以12％的SDS-PAGE分离来自PBMC及293ft细胞的蛋白质，并将蛋白质转印至PVDF膜(BIO-RAD公司)。所述PVDF膜预先以含有4％小牛血清(BSA)的PBS于室温下进行封闭一小时。接着，将PVDF模与一级抗体结合，该抗体包含anti-LAG-3(17B4)抗体(以1:1000的比例添加；Novus Biologicals公司)以及anti-GAPDH(GT239)抗体(GeneTex公司)。将PVDF膜以PBST清洗三次，每次十分钟，再加入二级抗体Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG+IgM(H+L)抗体(以1:10000的比例添加；Jackson ImmunoResearch Inc公司)，于室温下反应一小时。接着，将PVDF膜以PBST清洗三次后，以Trident femto WesternHRP Substrate(GeneTex公司)侦测讯号。最后以ImageJ影像分析程序判读相对的蛋白质量。

实施例

实施例1、培养基添加Muparfostat的培养结果

图2是依本发明培养PBMC后，针对表达LAG-3的自然杀伤细胞进行数量分析。由图2可发现，当培养基未添加Muparfostat，在第18天，表达LAG-3的自然杀伤细胞(即表面抗原为LAG-3⁺CD3^-CD56⁺的细胞)占PBMC中NK细胞总数的83％；相较于此，当每日于培养基添加浓度为300μg/ml的Muparfostat，在第18天，LAG-3⁺CD3^-CD56⁺细胞数量下降，只占NK细胞总数的64％。此结果显示，于培养基添加Muparfostat有效增加不表达LAG-3的NK细胞数，该类NK细胞具有较佳的活性。

为进一步探究Muparfostat对于活化免疫细胞的作用机制，针对细胞中LAG3蛋白质的表达量进行分析。图3是依本发明培养PBMC后，针对细胞中LAG3蛋白质的表达量进行分析。结果显示，相较于未添加Muparfostat的对照组，添加Muparfostat培养后的PBMC，其LAG-3蛋白质的表达量为对照组的58％。由图3可发现，Muparfostat有助于抑制LAG-3蛋白质于免疫细胞的表达量，进而阻断LAG-3所传递的抑制性讯息，达到活化免疫细胞的效果。

实施例2、与癌细胞株共同培养的测试结果

为模拟免疫细胞与癌细胞互动的情境，本实施例是将PBMC与癌细胞株共同培养。所述癌细胞株包含A549癌细胞株(非小细胞肺癌细胞株)以及HepG2细胞株(肝癌细胞株)。图4是依本发明培养PBMC并将其与癌细胞株共同培养后，针对表达LAG-3的T细胞进行数量分析。其中，图4A为PBMC与A549癌细胞株共同培养的分析结果，该结果显示，在未添加Muparfostat的对照组中，表达LAG-3的T细胞占PBMC总数的5.3％，而在添加Muparfostat的实验组中，表达LAG-3的T细胞数量减少，仅占PBMC总数的3.2％。图4B为PBMC与HepG2癌细胞株共同培养的分析结果，该结果显示，在未添加Muparfostat的对照组中，表达LAG-3的T细胞占PBMC总数的5.2％，而在添加Muparfostat的实验组中，表达LAG-3的T细胞数量明显减少，仅占PBMC总数的1％。

图5是依本发明培养PBMC并将其与一癌细胞株共同培养后，针对表达LAG-3的自然杀伤细胞(NK细胞)进行数量分析。其中，图5A为PBMC与A549癌细胞株共同培养的分析结果，该结果显示，在未添加Muparfostat的对照组中，表达LAG-3的NK细胞占PBMC总数的5％，而在添加Muparfostat的实验组中，表达LAG-3的NK细胞数量减少，仅占PBMC总数的3.2％。图5B为PBMC与HepG2癌细胞株共同培养的分析结果，该结果显示，在未添加Muparfostat的对照组中，表达LAG-3的NK细胞占PBMC总数的7.7％，而在添加Muparfostat的实验组中，表达LAG-3的NK细胞数量明显减少，仅占PBMC总数的1.5％。综上，于培养基添加Muparfostat有效增加不表达LAG-3的NK细胞数量及T细胞数量，该类NK细胞及T细胞具有较佳的活性，因此可达到活化免疫细胞的效果。