具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步的阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方 法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，皆为 可从商业途径得到的试剂和材料。

在实施例中所用的所有水稻品种： CK1,Kusabue；CK2,IRBLk-Ka；CK3,Tsuyuake；CK4,IRBLkm-Ts；CK5,Shin 2；CK6, IRBLks-F5；CK7,C101LAC；CK8, Tetep；CK9,IR8；CK10,K60；CK11,IRBLkp-K60；CK12,IRBL7-M；CK13,IRBLkh-K3；C K14,IR64；CK15,Nipponbare(NPB)；CK16,Achi Asahi；CK17,Maowangu；CK18,93-11；以及CV1-60皆为申请人实验室收集、保存， 并在本研究领域中常用且已在包括但不限于上述文献中公开【Wang etal.2009, Phytopathology 99:900-905；Zhai et al.2011,New Phytologist 189:321-334, https://nph.onlinelibrary.wiley.com；Hua et al.2012,Theor Appl Genet 125:1047-1055,https://www.springer.com/journal/122；Chai et al.2021,Rice, https://thericejournal.springeropen.com(发表中)；附件图表可在各自杂志网站获 得】。

本专利开发及应用的技术路线图如图1所示。

实施例1:稻瘟病Pik抗病等位基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定(图 2-12)

一、实验方法

从上述美国国家生物技术信息中心等公共数据库中检索并下载7个已经克 隆的稻瘟病Pik抗病等位基因家族的基因组序列，

Pik的NCBI登录号为：HM048900.1；

Pik-m的NCBI登录号为：AB462256.1

Pik-s的NCBI登录号为：HQ662329.1

Pi1的NCBI登录号为：HQ606329.1

Pik-p的NCBI登录号为：HM035360.1

Pi7的NCBI登录号为：HQ660231.1

Pik-h的NCBI登录号为：HQ662330.1。

为了便于序列比对分析，加入了2个测序参考感病品种日本晴(Nipponbare,NPB),绥粳18(Suijing 18,SJ 18)相应的基因组序列。为了验证本专利技术体系的 包容性及开放性，加入了2个测序参考抗病品种IR8及IR64相应的基因组序列。

各个片段ATG～TAG(#1基因),及ATG～TGA(#2基因)的范围参考NCBI注 释。

通过常规的生物信息学方法进行序列比较分析。

二、实验结果

序列比较结果如图2-12所示，结果表明：

(1)Pik抗病等位基因家族之#1及#2基因的序列都存在明显的功能性单元型(Pik,Pik-m,Pik-s,Pi1,Pik-IR8,Pik-p,Pi7,Pik-h,Pik-IR64)与非功能性单元型 (Pik-NPB,Pik-SJ18)的基因组分化(典型位置如图3之标记#1及#2所示)；

(2)Pik抗病等位基因家族的序列在功能性单元型中，进一步存在明显的 KM1/KM2亚单元型(Pik,Pik-m,Pik-s,Pi1,Pik-IR8)与KH1/KH2亚单元型 (Pik-p,Pi7,Pik-h,Pik-IR64,Pik-IR8)的分化(典型位置如图3之标记#3及#4所 示；其中Pik-IR8属于KM/KH混合亚单元型)；

(3)上述9个Pik抗病等位基因家族成员都存在功能特异性SNP及其组合(典 型位置如标记图5-12之标记#5～#17所示)。

实施例2：Pik抗病等位基因家族之功能性/非功能性单元型特异性分子标记的开发及鉴定(图3)

一、实验方法

此实施例的实验方法主要参考申请人已发表的论文(Yuan et al.2011,TheorAppl Genet 122:1017-1028；Zhai et al.2011,New Phytologist 189:321-334；Hua etal.2012,Theor Appl Genet,125:1047-1055)。

【以下参考文献与上述的相同，恕不赘述】。简述之：

(1)单元型特异性分子标记的设计：根据上述Pik等位基因家族序列的比对 结果，针对功能性/非功能性单元型清晰的基因组区域，利用引物设计软件Primer Primer 5.0设计P/A(presence/absence；存在/缺失)标记。引物序列如下：

对于#1K标记：

SEQ ID NO.1(Pik-K1^{P/A(1-6230～6419)}-F；5’-3’)：

CGGGCAGCAGTGGGATCGATACTGAG；

SEQ ID NO.2(Pik-K1^{P/A(1-6230～6419)}-R；5’-3’)：

TTTCTGTTTGAATTTCAATATCTGCTACTC。

对于#1N标记：

SEQ ID NO.3(Pik-N1^{P/A(1-6230～6419)}-F；5’-3’)：

TCGTTGTCCACGCTGCTCCTGACGA；

SEQ ID NO.4(Pik-N1^{P/A(1-6230～6419)}-R；5’-3’)：

AGTACAGGTAAAATTAGAATACAATAGCA。

对于#2K标记：

SEQ ID NO.5(Pik-K2^{P/A(2-930～1110)}-F；5’-3’)：

ATGTCAGCCAGAAAATGATGGAAACC；

SEQ ID NO.6(Pik-K2^{P/A(2-930～1110)}-R；5’-3’)：

TAGATTTAGAGTGGGATGAGTAAGTTAAT。

对于#2N标记：

SEQ ID NO.7(Pik-N2^{P/A(2-930～1110)}-F；5’-3’)：

ACCACTGTCACTACTCGGAGGGAA；

SEQ ID NO.8(Pik-N2^{P/A(2-930～1110)}-R；5’-3’)：

ATGGATTTACAATTAAGTTAATTGGCAT。

标记说明：K1及K2，分别表示#1及#2功能性单元型；对应地，N1及N2， 分别表示#1及#2非功能性单元型；P/A，存在(presence；目标基因型)/缺失 (absence；非目标基因型)；1-6230～6419，意为#1基因之#6230～6419基因组区段， 如此类推(下同)；

(2)单元型特异性分子标记的检测：利用上述4组引物对18个水稻对照品 种进行PCR扩增。PCR扩增体系(20.0μL)如下：

【以下PCR扩增体系与上述的相同，恕不赘述】

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，随后进行35个循环的PCR扩增[94℃ 变性30sec，退火30sec(K1/60℃，N1/62～64℃，K2/63℃，N2/61～63℃)，72℃ 延伸30sec)]，最后72℃延伸5min，PCR产物置于4℃冰箱保存备用。

【除了退火温度之外，以下PCR扩增条件与上述的相同，恕不累述】

取0.25μL PCR产物，加入0.25μL ddH₂O和5μL 10x loading并混匀，用微量 进样器取1.5～2μL产物在8％～12％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(250V,20～120 min)，之后，按照常规的检测方法进行分子标记的拍照、记录。

【以下分子标记检测程序与上述的相同，恕不赘述】

二、实验结果

各个分子标记的大小如图3所示，结果表明，18个供试品种呈现清晰而多 样的基因型(单元型)：

K1/K2功能性单元型品种(同时被判断为K1及K2基因型的品种)：CK1, Kusabue；CK2,IRBLk-Ka；CK3,Tsuyuake；CK4,IRBLkm-Ts；CK5,Shin 2；CK6, IRBLks-F5；CK7,C101LAC；CK8,Tetep；CK9,IR8；CK10,K60；CK11, IRBLkp-K60；CK12,IRBL7-M；CK13,IRBLkh-K3；CK14,IR64；

非功能性单元型品种(只含有一个K型基因型，或者完全不含有K型基因型 的品种)：CK15,Nipponbare(N1/N2)；CK16,Achi Asahi(N1/N2)；CK17, Maowangu(N1/K2)；CK18,93-11(N2)。

在后续的检测、鉴定中，将去除非功能性单元型的供试品种CK15-18。

实施例3:Pik抗病等位基因家族之K1/K2功能性单元型之亚单元型特异性分子 标记的开发及鉴定(图4)

一、实验方法

(1)亚单元型特异性分子标记的设计：根据上述Pik等位基因家族序列的比对 结果，针对功能性单元型之KM/KH亚单元型清晰的SNP，根据dCAPS (derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequences；Neff et al.2002,Trends in Genetics 18:613-615)标记的设计原理，先利用在线软件dCAPSFinder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行dCAPS标记的引物设计；然后利用 引物设计软件Primer Primer 5.0进行标记设计的确认。

【以下分子标记及引物设计程序与上述的相同，恕不赘述】。

引物序列如下：

对于#3标记(上带,KM1；下带,KH1)：

SEQ ID NO.9(KM1/KH1^G1-357A-F；5’-3’)：

GTCCTACGACCTGGATGATG；

SEQ ID NO.10(KM1/KH1^G1-357A-R；5’-3’)：

CAGAGAAGCGATTGGAGGCA。

对于#4标记(上带,KM2；下带,KH2)：

SEQ ID NO.11(KM2/KH2^G2-1559C-F；5’-3’)：

AAGATAGCAACAAAGTAGACGAGC；

SEQ ID NO.12(KM2/KH2^G2-1559C-R；5’-3’)：

CACCATCGAGGGTAAGAGGAG。

(2)亚单元型特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩 增体系(退火温度：KM1/KH1^G1-357A/60℃，KM2/KH2^G2-1559C/62℃)，对14个功能 性单元型的水稻供试品种进行PCR扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。

取出上述PCR产物，分别利用限制性内切酶SphI(KM1/KH1^G1-357A)及NcoI (KM2/KH2^G2-1559C)进行酶切，反应体系(10.0μL)如下：

在37℃条件下酶切5小时后，向上述每管酶切产物中加入10μL 10x loading 并混匀，按照上述实验程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测、拍 照、记录。

【以下PCR扩增产物酶切体系(除了Pik-IR8^A1-927G之酶切温度为65℃外，其 余皆为37℃)与上述的相同，恕不赘述】

二、实验结果

各个分子标记的大小如图4所示，结果表明，14个供试品种呈现3种清晰 的基因型(亚单元型)：

KM1/KM2亚单元型品种：CK1,Kusabue；CK2,IRBLk-Ka；CK3,Tsuyuake；CK4,IRBLkm-Ts；CK5,Shin 2；CK6,IRBLks-F5；CK7,C101LAC；CK8,Tetep；

KH1/KH2亚单元型品种：CK10,K60；CK11,IRBLkp-K60；CK12, IRBL7-M；CK13,IRBLkh-K3；CK14,IR64；

KM1/KH2混合亚单元型品种：CK9,IR8。

实施例4：Pik抗病等位基因家族之K1/K2功能性单元型之KM1/KM2亚单元型 之广谱持久抗性基因Pik特异性分子标记的开发及鉴定(图5)

一、实验方法

(1)Pik特异性分子标记的设计：根据上述Pik等位基因家族序列的比对结果， 发现了4个目标基因Pik特异性的SNP(A1-1380T,G1-2588T,T1-2793C, T1-5932G)；其中A1-1380T,G1-2588T经验证为测序错误而产生的SNP而被排除。 将2个真实的SNP设计为Pik功能特异性分子标记Pik^T1-2793C及Pik^T1-5932G，引物 序列如下：

对于#5标记(上带,非目标基因；下带,目标基因)：

SEQ ID NO.13(Pik^T1-2793C-F；5’-3’)：CCTTCCAGTACCTCTCTCGAAGC；

SEQ ID NO.14(Pik^T1-2793C-R；5’-3’)：AATGGCAGGCATAGCTTGTCC。

对于#6标记(上带,目标基因；下带,非目标基因)：

SEQ ID NO.15(Pik^T1-5932G-F；5’-3’)：CAAAAGTTCCTCGCCGAGATGC；

SEQ ID NO.16(Pik^T1-5932G-R；5’-3’)：TCTTCATGGAAGGCTATCCTTGGTA。

(2)Pik特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体 系及扩增条件(退火温度：Pik^T1-2793C/50～59℃，Pik^T1-5932G/56℃)，对14个功能性 单元型的水稻供试品种进行PCR扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。

取出上述PCR产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶Alu I (Pik^T1-2793C)以及KpnI(Pik^T1-5932G)进行酶切；并按照上述实验程序对酶切样品进 行基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测、拍照及记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图5所示，结果表明，2个Pik特异性分子标记皆可 将目标基因区分于该基因家族所有已知的等位基因：

目标基因携带品种：CK1,Kusabue(Pik)及CK2,IRBLk-Ka(Pik)；

非目标基因携带品种：CK3,Tsuyuake(Pik-m)；CK4,IRBLkm-Ts(Pik-m)； CK5,Shin2(Pik-s)；CK6,IRBLks-F5(Pik-s)；CK7,C101LAC(Pi1)；CK8,Tetep (Pi1)；CK9,IR8(Pik-IR8)；CK10,K60(Pik-p)；CK11,IRBLkp-K60(Pik-p)；CK12, IRBL7-M(Pi7)；CK13,IRBLkh-K3(Pik-h)；CK14,IR64(Pik-IR64)

综上，三级标记如图6所示。

实施例5：Pik抗病等位基因家族之K1/K2功能性单元型之KM1/KM2亚单元型 之广谱持久抗性基因Pik-m特异性分子标记的开发鉴定(图7)

一、实验方法

(1)Pik-m特异性分子标记的设计：根据上述Pik等位基因家族序列的比对结 果，仅发现1个目标基因Pik-m特异性的SNP(C1-851G/A)，按照上述程序设计 为Pik-m特异性分子标记Pikm^T1-2793C。引物序列如下：

对于#7标记(上带及下带,非目标基因；中带,目标基因)：

SEQ ID NO.17(Pikm^C1-851G/A-F；5’-3’)：

GCGCTCGTAGGTGATCTAAGAGAT；

SEQ ID NO.18(Pikm^C1-851G/A-R；5’-3’)：

GATTTCACCGGCGCAAGCAT。

(2)Pik-m特异性分子标记的检测：利用上述1组引物，按照上述PCR扩增 体系及扩增条件(退火温度59℃)，对14个功能性单元型的水稻供试品种进行PCR 扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。

取出上述PCR产物，按照上述酶切体系，利用限制性内切酶MboI进行酶切； 并按照上述实验程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测、拍照及记 录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图7所示，结果表明，该特异性分子标记可将目标基 因区分于该基因家族所有已知的等位基因：

目标基因携带品种：CK3,Tsuyuake(Pik-m)；CK4,IRBLkm-Ts(Pik-m)；

非目标基因携带品种：CK1,Kusabue(Pik)；CK2,IRBLk-Ka(Pik)；CK5,Shin 2(Pik-s)；CK6,IRBLks-F5(Pik-s)；CK7,C101LAC(Pi1)；CK8,Tetep(Pi1)；CK9,IR8 (Pik-IR8)；CK10,K60(Pik-p)；CK11,IRBLkp-K60(Pik-p)；CK12,IRBL7-M(Pi7)； CK13,IRBLkh-K3(Pik-h)；CK14,IR64(Pik-IR64)。

实施例6：Pik抗病等位基因家族之K1/K2功能性单元型之KM1/KM2亚单元型 之抗性基因Pik-s特异性分子标记的开发及鉴定(图8)

一、实验方法

(1)Pik-s特异性分子标记的设计：根据上述Pik等位基因家族序列的比对结 果，并未发现目标基因Pik-s特异性的SNP，但是一个最优组合 [C1-957T+G2-1559C(#4KM2/KH2)]却能将目标基因Pik-s与该基因家族所有的 等位基因区分开；按照上述程序设计为Pik-s特异性分子标记Piks^C1-957T及 KM2/KH2^G2-1559C。

特别地，由于#8标记之目标区域基因组分化明显，设计2条正向引物与1 条反向引物搭配进行PCR检测。引物序列如下：

对于#8标记(上带,非目标基因；下带,目标基因)：

SEQ ID NO.19(Piks^C1-957T-F1；5’-3’)：

TGCGATGTTTCTGGAGGTCAGGCATG

SEQ ID NO.20(Piks^C1-957T-F2；5’-3’)：

TGCGGAGTTGCTGCAGGTCAGGCATG

SEQ ID NO.21(Piks^C1-957T-R；5’-3’)：

GTCGATGAGATGTTGTTGAAGAGCT；

对于#4标记(上带,目标基因；下带,非目标基因)：

SEQ ID NO.11(KM2/KH2^G2-1559C-F；5’-3’)：

AAGATAGCAACAAAGTAGACGAGC；

SEQ ID NO.12(KM2/KH2^G2-1559C-R；5’-3’)：

CACCATCGAGGGTAAGAGGAG；

(2)Pik-s特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体 系及扩增条件(退火温度：Piks^C1-957T/52℃，KM2/KH2^G2-1559C/62℃)，对14个功能 性单元型的水稻供试品种进行PCR扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。

取出上述PCR产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶SphI (Piks^C1-957T)以及NcoI(KM2/KH2^G2-1559C)进行酶切，并按照上述实验程序对酶切 样品进行基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测、拍照及记录

二、实验结果

各个分子标记的大小如图8所示，结果表明，该特异性分子标记组合可将目 标基因区分于该基因家族所有已知的等位基因：

目标基因携带品种：CK5,Shin 2(Pik-s)；CK6,IRBLks-F5(Pik-s)；

非目标基因携带品种：CK1,Kusabue(Pik)；CK2,IRBLk-Ka(Pik)；CK3, Tsuyuake(Pik-m)；CK4,IRBLkm-Ts(Pik-m)；CK7,C101LAC(Pi1)；CK8,Tetep (Pi1)；CK9,IR8(Pik-IR8)；CK10,K60(Pik-p)；CK11,IRBLkp-K60(Pik-p)；CK12, IRBL7-M(Pi7)；CK13,IRBLkh-K3(Pik-h)；CK14,IR64(Pik-IR64)。

实施例7：Pik抗病等位基因家族之K1/K2功能性单元型之KM1/KM2亚单元型 之广谱持久抗性基因Pi1特异性分子标记的开发及鉴定(图9)

一、实验方法

(1)Pi1特异性分子标记的设计：根据上述Pik等位基因家族序列的比对结果， 发现4个目标基因Pi1特异性的SNP(T1-853G,C1-3273G,T1-3783G,T2-2519A)； 其中C1-3273G,T1-3783G经验证为测序错误而产生的SNP而被排除。将2个真 实的SNP设计为Pi1特异性分子标记Pi1^T1-853G及Pi1^T2-2519A。

特别地，由于#9标记之目标区域基因组分化明显，设计2条正向引物与1 条反向引物搭配进行PCR检测。引物序列如下：

引物序列如下：

对于#9标记(上带及下带,非目标基因；中带,目标基因)：

SEQ ID NO.22(Pi1^T1-853G-F1；5’-3’)：

GTTGCAATCGCCGGTGACCTAAGAGACCA；

SEQ ID NO.23(Pi1^T1-853G-F2；5’-3’)：

GTTGCGCTCGTAGGTGATCTAAGAGACCA；

SEQ ID NO.24(Pi1^T1-853G-R；5’-3’)：

TCACATATGGATTTCACCGGCGCAAGC。

对于#10标记(上带,非目标基因；下带,目标基因)：

SEQ ID NO.25(Pi1^T2-2519A-F；5’-3’)：

CAAAGAAAGGATTCTTATCCCAAT；

SEQ ID NO.26(Pi1^T2-2519A-R；5’-3’)：

CCACCCTTTGTTATATTGAGCTT。

(2)Pi1特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体 系及扩增条件(退火温度：Pi1^T1-853G/65℃，Pi1^T2-2519A/58℃)，对14个功能性单元 型的水稻供试品种进行PCR扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。

取出上述PCR产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶NlaIII (Pi1^{T1 -853G})以及MseI(Pi1^T2-2519A)进行酶切，并按照上述实验程序对酶切样品进 行基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测、拍照及记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图9所示，结果表明，2个Pi1特异性分子标记皆可 将目标基因区分于该基因家族所有已知的等位基因：

目标基因携带品种：CK7,C101LAC(Pi1)；CK8,Tetep(Pi1)；

非目标基因携带品种：CK1,Kusabue(Pik)；CK2,IRBLk-Ka(Pik)；CK3, Tsuyuake(Pik-m)；CK4,IRBLkm-Ts(Pik-m)；CK5,Shin 2(Pik-s)；CK6,IRBLks-F5 (Pik-s)；CK9,IR8(Pik-IR8)；CK10,K60(Pik-p)；CK11,IRBLkp-K60(Pik-p)；CK12, IRBL7-M(Pi7)；CK13,IRBLkh-K3(Pik-h)；CK14,IR64(Pik-IR64)。

实施例8：Pik抗病等位基因家族之K1/K2功能性单元型之KM1/KH2混合亚单 元型之新型抗性基因Pik-IR8特异性分子标记的开发及鉴定(图10)

一、实验方法

(1)Pik-IR8特异性分子标记的设计：根据上述Pik等位基因家族序列的比对 结果，发现了2个目标基因Pik-IR8特异性的SNP(A1-149G,A1-927G)；按照上 述程序将其设计为Pik-IR8特异性分子标记Pik-IR8^TA1-149G及Pik-IR8^A1-927G。

特别地，由于Pik-IR8^A1-927G标记处于复杂的基因组分化区域，为了确保标记 的检测，其正向引物之#3关键碱基设计为简并碱基，记为dF；其中，y＝c/t。

引物序列如下：

对于#11标记(上带,非目标基因；下带,目标基因)：

SEQ ID NO.27(Pik-IR8^A1-149G-F1；5’-3’)：

CAGAGTTCATCAGATCCGAGCTT；

SEQ ID NO.28(Pik-IR8^A1-149G-R；5’-3’)：

TCAGAGAAGCGATTGGAGACA。

对于#12标记(上带,非目标基因；下带,目标基因)：

SEQ ID NO.29(Pik-IR8^A1-927G-dF；5’-3’)：

TCYGCGCTCCGGAAGAAGGTCG；

SEQ ID NO.30(Pik-IR8^A1-927G-R；5’-3’)：

CCTGGCAATCCAAGGATGCAAA。

(2)Pik-IR8特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩 增体系及扩增条件(退火温度：Pik-IR8^A1-149G/60℃，Pik-IR8^A1-927G/63℃)，对14 个功能性单元型的水稻供试品种进行PCR扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备 用。

取出上述PCR产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶AflII (Pik-IR8^{A1 -149G})以及TaqI(Pik-IR8^A1-927G，酶切温度65℃)进行酶切，并按照上 述实验程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测、拍照及记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图10所示，结果表明，2个Pik-IR8特异性分子标记 皆可将目标基因区分于该基因家族所有已知的等位基因：

目标基因携带品种：CK9,IR8(Pik-IR8；序列如GenBank MZ358904所示)；

非目标基因携带品种：CK1,Kusabue(Pik)；CK2,IRBLk-Ka(Pik)；CK3, Tsuyuake(Pik-m)；CK4,IRBLkm-Ts(Pik-m)；CK5,Shin 2(Pik-s)；CK6,IRBLks-F5 (Pik-s)；CK7,C101LAC(Pi1)；CK8,Tetep(Pi1)；CK10,K60(Pik-p)；CK11, IRBLkp-K60(Pik-p)；CK12,IRBL7-M(Pi7)；CK13,IRBLkh-K3(Pik-h)；CK14, IR64(Pik-IR64)。

实施例9：Pik抗病等位基因家族之K1/K2功能性单元型之KH1/KH2亚单元型 之广谱持久抗性基因Pik-p/Pi7/Pik-h特异性分子标记的开发及鉴定(图11)

一、实验方法

(1)Pik-p/Pi7/Pik-h特异性分子标记的设计：根据上述Pik等位基因家族序列 的比对结果，发现了1个目标基因Pik-p特异性的SNP(T1-1229C)，经验证为测 序错误产生的而被排除；未发现Pi7及Pik-h的特异性SNP，但是一个最优组合 [A2-2137G+T1-961A/C/G+A1-961T/C/G]却能将3个目标基因与该基因家族所 有的等位基因区分开来；按照上述程序将其设计为Pik-p/Pi7/Pik-h特异性分子标 记组合：Pikp/7/kh^A2-2137G，Pikp/7^T1-961A/C/G及Pikh^A1-961T/C/G。

特别地，由于Pikp/7^T1-961A/C/G及Pikh^A1-961T/C/G，以及参考标记Pikh^G1-961T/C/A标记处于复杂的基因组分化区域，为了确保标记的检测，其正向引物之#5,6,10, 14,27关键碱基设计为简并碱基，记为dF；其中，r＝a/g，w＝a/t，k＝g/t，s＝c/g， y＝c/t。

引物序列如下：

对于#13标记(上带,目标基因；下带,非目标基因)：

SEQ ID NO.31(Pikp/7/kh^A2-2137G-F1；5’-3’)：

GCAAGGGTTAACCCAGGAAAG；

SEQ ID NO.32(Pikp/7/kh^A2-2137G-R；5’-3’)：

TAGTTGAATGAATGGAATGGCC；

对于#14标记(上、中带,非目标基因；下带,目标基因)：

SEQ ID NO.33(Pikp/7^T1-961A/C/G-dF；5’-3’)：

TGCGRWGTTKCTGSAGGTCAGCCAAGYAAT；

SEQ ID NO.34(Pikp/7^T1-961A/C/G-R；5’-3’)：

GTCGATGAGATGTTGTTGAAGAGCT；

对于#15a标记(上带,非目标基因；下带,目标基因)：

SEQ ID NO.35(Pikh^A1-961T/C/G-dF；5’-3’)：

GTTKCTGSAGGTCAGCCAAGYTTA；

SEQ ID NO.36(Pikh^A1-961T/C/G-R；5’-3’)：

TTGAGCGAAAATGTCTGCAAGAGTCT。

对于#15b标记(参考标记；上带,目标基因；下带,非目标基因)：

SEQ ID NO.37(Pikh^G1-961T/C/A-dF；5’-3’)：

GTTKCTGSAGGTCAGCCAAGCTAA；

SEQ ID NO.38(Pikh^G1-961T/C/A-R；5’-3’)：

TTGAGCGAAAATGTCTGCAAGAGTCT。

(2)Pik-p/Pi7/Pik-h特异性分子标记的检测：利用上述3组引物，按照上述 PCR扩增体系及扩增条件(退火温度：Pikp/7/kh^A2-2137G/58℃,Pikp/7^T1-961A/G/C/60℃, Pikh^{A1 -961T/G/C}/58℃,Pikh^G1-961T/A/C/60℃)，对14个功能性单元型的水稻供试品种进 行PCR扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。

取出上述PCR产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶 NcoI(Pikp/7/kh^A2-2137G),MseI(Pikp/7^T1-961A/G/C),MseI (Pikh^A1-961T/G/C),DdeI(Pikh^G1-961T/A/C)进行酶切，并按照上述实验程序对酶切样品 进行基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测、拍照及记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图11所示，结果表明，上述一组3个Pik-p/Pi7/Pik-h 特异性分子标记即可以将目标基因区分于该基因家族所有的等位基因：

目标基因Pik-p与Pi7相同，其携带品种为：CK10,K60(Pik-p)；CK11, IRBLkp-K60(Pik-p)；CK12,IRBL7-M(Pi7)；

目标基因Pik-h携带品种：CK13,IRBLkh-K3(Pik-h)；

非目标基因携带品种：CK1,Kusabue(Pik)；CK2,IRBLk-Ka(Pik)；CK3, Tsuyuake(Pik-m)；CK4,IRBLkm-Ts(Pik-m)；CK5,Shin 2(Pik-s)；CK6,IRBLks-F5 (Pik-s)；CK7,C101LAC(Pi1)；CK8,Tetep(Pi1)；CK9,IR8(Pik-IR8)；CK14,IR64 (Pik-IR64)。

特别地，经上述分子标记验证存在2个测序错误：

(a)Pik-p与Pi7的序列相同，不存在SNP：Pi7之#961C实为#961T，

(b)Pik-h之#961G实为#961A(详见图11之参考标记#15b)。

实施例10：Pik抗病等位基因家族之K1/K2功能性单元型之KH1/KH2亚单元 型之新型抗性基因Pik-IR64特异性分子标记的开发及鉴定(图12)

一、实验方法

(1)Pik-IR64特异性分子标记的设计：根据上述Pik抗病等位基因家族序列 的比对结果，发现了17个目标基因Pik-IR64特异性的SNP(T1-3013C,G1-4705A, T1-5468C等)；将其中3个(T1-3013C,G1-4705A,T1-5468C)设计为Pik-IR64特 异性分子标记，并从中选择2个最优的作为Pik-IR64特异性分子标记组合： Pik-IR64^T1-3013C及Pik-IR64^T1-5468C。引物序列如下：

对于#16标记(上带,非目标基因；下带,目标基因)：

SEQ ID NO.39(Pik-IR64^T1-3013C-F；5’-3’)：

CAAGCTATGCCTGCCATTGG；

SEQ ID NO.40(Pik-IR64^T1-3013C-R；5’-3’)：

CAAGAAATATATCTCCTTGCAGTCG。

对于#17标记(上带,非目标基因；下带,目标基因)：

SEQ ID NO.41(Pik-IR64^T1-5468C-F；5’-3’)：

TGGGGAGCTGAATCATCTAAAGC；

SEQ ID NO.42(Pik-IR64^T1-5468C-R；5’-3’)：

ACAAGGGGAGGTCCGAAACG。

(2)Pik-IR64特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩 增体系及扩增条件(退火温度：Pik-IR64^T1-3013C/62℃，Pik-IR64^T1-5468C/55℃)，对 14个功能性单元型的水稻供试品种进行PCR扩增并将其产物置于4℃冰箱保存 备用。

取出上述PCR产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶 SalI(Pik-IR64^{T1 -3013C})以及HindIII(Pik-IR64^T1-5468C)进行酶切，并按照上述实验 程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测、拍照及记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图12所示，结果表明，2个Pik-IR64特异性分子标 记皆可将目标基因区分于该基因家族所有已知的等位基因：

目标基因携带品种：CK14,IR64(Pik-IR64；序列如GenBank MZ358905所 示)；

非目标基因携带品种：CK1,Kusabue(Pik)；CK2,IRBLk-Ka(Pik)；CK3, Tsuyuake(Pik-m)；CK4,IRBLkm-Ts(Pik-m)；CK5,Shin 2(Pik-s)；CK6,IRBLks-F5 (Pik-s)；CK7,C101LAC(Pi1)；CK8,Tetep(Pi1)；CK9,IR8(Pik-IR8)；CK10,K60 (Pik-p)；CK11,IRBLkp-K60(Pik-p)；CK12,IRBL7-M(Pi7)；CK13,IRBLkh-K3 (Pik-h)。

实施例11：利用本发明的一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pik抗病等 位基因家族的技术体系从未知的稻种资源群体中挖掘、鉴定Pik等位基因的实例 (图13)

如上所述，本发明的Pik抗病等位基因家族鉴别之技术体系由9组特异性分 子标记鉴别体系组成(图3-12)。其中，功能性/非功能性单元型，以及功能性单元 型之KM/KH亚单元型检测需按照先后顺序推进，而后续的各个目标基因的检测 则没有先后顺序之分。整套技术体系的检测程序及方案如上所述，恕不赘述(下 同)。

(1)供试对照品种组成：8个Pik等位基因携带者作为对照品种(CK1-8)；CK1,Kusabue(Pik)；CK2,Tsuyuake(Pik-m)；CK3,Shin 2(Pik-s)；CK4,C101LAC(Pi1)； CK5,IR8(Pik-IR8)；CK6,K60(Pik-p)；CK7,IRBLkh-K3(Pik-h)；CK8,IR64 (Pik-IR64)；

(2)供试稻种资源组成：为了提高稻种资源的多样性，籼、粳稻品种皆由古 老品种及现代品种组成。其中，CV1-15为古老的籼稻品种；CV16-30为现代的 籼稻品种；CV31-45为古老的粳稻品种；CV46-60为现代的粳稻品种。

(3)Pik等位基因之功能性/非功能性单元型的鉴定(图13a)

利用上述功能性单元型一组特异性标记，对上述68个供试品种进行了鉴定。 结果表明，21个品种被推断为K1/K2功能性单元型品种：CV1,CV2,CV4,CV10, CV14,CV18,CV19,CV27,CV32,CV36,CV37,CV45,CV46,CV48,CV49,CV50, CV51,CV54,CV56,CV57,CV58；

特别地，由于Pik等位基因之功能性/非功能性单元型特异性标记是非此即彼 的‘存在/缺失’标记，一般情况下只检测一对功能性单元型特异性标记即可；而且 功能性单元型品种以外的其余品种皆可判断为非功能性单元型品种而被排除于 后续的检测中。

(4)Pik等位基因之K1/K2功能性单元型之亚单元型的鉴定(图13b)

利用上述亚单元型一组特异性标记，对上述21个K1/K2功能性单元型供试 品种进行了鉴定。结果表明：

11个为KM1/KM2亚单元型品种：CV10,CV36,CV37,CV46,CV48,CV49, CV50,CV54,CV56,CV57,CV58；

7个为KH1/KH2亚单元型品种：CV1,CV4,CV14,CV18,CV19,CV27, CV45；

1个为KM1/KH2混合亚单元型品种：CV2；

2个为KH1/KM2混合亚单元型品种：CV32,CV51。

(5)8个Pik抗病等位基因的鉴定(图13c-i)

利用上述Pik抗病等位基因7组特异性标记(Pik-p,Pik-h合并为一组)，对上 述21个功能性单元型之4种亚单元型供试品种进行了鉴定。结果表明：

目标基因Pik携带品种(图13c)：CV54,CV56,CV57,CV58；

目标基因Pik-m携带品种(图13d)：没有；

目标基因Pik-s携带品种(图13e)：CV36,CV37,CV46,CV48,CV49,CV50；

目标基因Pi1携带品种(图13f)：没有；

目标基因Pik-IR8携带品种(图13g)：CV2；

目标基因Pik-p携带品种(图13h)：CV27；

目标基因Pik-h携带品种(图13h)：没有；

目标基因Pik-IR64携带品种(图13i)：CV1,CV4,CV14,CV18,CV19,CV45；

新型Pik等位基因携带品种(图13c-i)：CV10,CV32,CV51。

特别地，由于上述3个新型等位基因的基因型既与上述8个等位基因的不同， 它们之间彼此亦不相同，因此，被分别命名为，Pik-CKN(Chikenuo,CV10；序列 如GenBankMZ358906所示),Pik-GDD(Gaoyangdiandaodahongmeng,CV32；序列 如GenBank MZ358907所示),Pik-SRC(Sariceltik,CV51；序列如翟纯，2012，华 南农业大学博士学位论文所示)。

该实例鉴证了本专利技术体系具有的包容性及可比性，因为在8个已知基因 的基础上增加了2个具有可比性的新基因。

实施例12：利用本发明的一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pik抗病等 位基因家族的技术体系甄别该基因家族“异名同质基因”及“同名异质基因”的正 反实例(图3,4,11)

有别于一般的分子标记专利技术，仅仅针对特定基因一个或者少数几个SNP 的检测，本发明之技术体系由“单元型-亚单元型-等位基因”等三级检测标记组成。 由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，而且开放性地包含了主要的功能 性特异性基因组区域及SNP，各个标记独立而具有严谨的逻辑性。由此实现了对 由上述测序错误而产生的“异名同质基因”或者“同名异质基因”的精准甄别。

正例1：如上所述，目标基因Pik-p的携带者应该属于Pik等位基因家族之 K1/K2功能性单元型(I级标记；图3)，KH1/KH2功能性亚单元型(II级标记；图 4)，而且2个功能特异性分子标记(III级标记；图11)(Pikp/7/kh^A2-2137G, Pikp/7^T1-961A/C/G)皆为阳性(含有目标基因，下同)的品种。由此推断2个品种(CK10, CK11)携带目标基因Pik-p；

反例1-1:品种CK12被认为是Pi7的携带者(Tsunematsu et al.2000,Breed Sci,50:229-234；甘霖，2011，华南农业大学学位硕士论文)。但在该技术体系中， 其三级分子标记检测的结果却与Pik-p的完全相同。由此推断Pi7实为Pik-p的“异 名同质基因”，亦即该基因原来的特异性SNP(C1-961A/G/T)是测序错误，实为 与Pik-p的完全相同(T1-961A/G/C)。

反例1-2:品种CK13被确认为Pik-h的携带者(Tsunematsu et al.2000,BreedSci,50:229-234；翟纯，2012，华南农业大学博士学位论文)。在该技术体系中， CK13(Pik-h)在I级标记(图2)、II级分子标记(图3)，以及III级分子标记之 Pikp/7/kh^A2-2137G检测的结果与CK10,CK11(Pik-p)，以及CK12(Pi7＝Pik-p)的完 全相同，而Pikp/7^T1-961A/G/C检测的结果与Pik-p/Pi7的不相同(图10)，由此似乎可 以推断Pik-h特异性的SNP如测序结果那样为(G1-961T/A/C)。但是，当以此SNP 设计为分子标记Pikh^G1-961T/C/A时，品种CK10-14之间并无差异性(图10之参考标 记#15b)，而当以SNP(A1-961T/C/G)设计为分子标记Pikh^A1-961T/C/G时，品种 CK13与全体CK品种具有差异性(图10之标记#15a)。由此说明由测序错误而产 生了“同名异质基因”，亦即Pikh^G1-961T/C/A与Pikh^A1-961T/C/G是不同的Pik等位基因， 而后者才是真正的Pik-h(图10)。

实施例13：利用本发明的一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pik抗病等 位基因家族的技术体系甄别真假抗病基因Pik的正反实例(图3,4,5,13)

有别于一般的分子标记专利技术，仅仅针对于目标基因特定基因组区域 DNA多态性而进行的检测，本发明之技术体系由“单元型-亚单元型-等位基因” 等三级检测标记组成。由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，而且开放 性地包含了主要的功能特异性基因组区域及SNP，各个标记独立但具有严谨的逻 辑性。由此实现了对由上述“标记假阳性”而产生的真假基因(已知基因与新型基 因之分)的甄别。

正例2：如上所述，目标基因Pik的携带者应该属于Pik基因家族之K1/K2 功能性单元型(I级标记；图3)，KM1/KM2功能性亚单元型(II级标记；图4)，而 且2个功能特异性分子标记(Pik^T1-2793C,Pik^T1-5932G)皆为阳性的品种(CK1,CK2； III级标记；图5)。由此推断4个品种(CV54,CV56,CV57,CV58)携带目标基因 Pik(图13)；

反例2:品种CV32的单元型为K1/K2，但是其亚单元型则为KH1/KM2，而 且2个Pik功能特异性分子标记中，只有Pik^T1-2793C为阳性(图13)。如果仅仅以 单元型特异性及Pik功能特异性分子标记Pik^T1-2793C为判断依据，CV32应该被判 断为目标基因Pik的携带者。但是如果以本发明构建的系统而严谨的Pik等位基 因家族之技术体系来作判断，该品种并非目标基因Pik的携带者，而是新发掘的 Pik等位基因Pik-GDD，因为其亚单元型并非KM1/KM2型，而且2个Pik功能 特异性分子标记中，只有Pik^T1-2793C为阳性(图13)。

实施例14：利用本发明的一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pik抗病等 位基因家族的技术体系甄别真假抗病基因Pik-s的正反实例(图3,4,8,13)

同样地，有别于一般的分子标记专利技术，仅仅针对于目标基因特定基因组 区域DNA多态性而进行的检测，本发明之技术体系由“单元型-亚单元型-等位基 因”等三级检测标记组成。由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，而且 开放性地包含了主要的功能性特异性基因组区域及SNP，各个标记独立但具有严 谨的逻辑性。由此实现了对由上述“标记假阳性”而产生的真假基因(已知基因与 新型基因之分)的甄别。

正例3：目标基因Pik-s的携带者应该属于Pik基因家族之K1/K2功能性单 元型(I级标记；图3)，KM1/KM2功能性亚单元型(II级标记；图4)，而且2个功 能特异性分子标记(Piks^C1-957T,KM2/KH2^G2-1559C)皆为阳性的品种(CK5,CK6；III 级标记；图8)。由此推断6个品种(CV36,CV37,CV46,CV48,CV49,CV50)携带 目标基因Pik-s(图12)；

反例3-1:虽然品种CV10的单元型为K1/K2，亚单元型亦为KM1/KM2，但 是在2个Pik-s功能特异性分子标记中，只有KM2/KH2^G2-1559C为阳性。由此推断 该品种并非目标基因Pik-s的携带者，而是新挖掘的Pik等位基因Pik-CKN(图13)。

反例3-2:虽然品种CV51的单元型为K1/K2，但是其亚单元型则为 KH1/KM2，而且2个Pik-s功能特异性分子标记中，只有KM2/KH2^G2-1559C为阳 性。由此推断该品种并非目标基因Pik-s的携带者，而是新发掘的Pik等位基因Pik-SRC(图13)。

上述实例从不同角度实证了本发明之技术体系具有包容性且精准鉴别并挖 掘稻瘟病Pik抗病等位基因家族非凡的能力及效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pik抗病等位基因家族的技术体系

<130>

<160> 42

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Pik-K1P/A(1-6230~6419)-F(#1K标记)

<400> 1

cgggcagcag tgggatcgat actgag 26

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Pik-K1P/A(1-6230~6419)-R

<400> 2

tttctgtttg aatttcaata tctgctactc 30

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Pik-N1P/A(1-6230~6419)-F(#1N标记)

<400> 3

tcgttgtcca cgctgctcct gacga 25

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Pik-N1P/A(1-6230~6419)-R

<400> 4

agtacaggta aaattagaat acaatagca 29

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Pik-K2P/A(2-930~1110)-F(#2K标记)

<400> 5

atgtcagcca gaaaatgatg gaaacc 26

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> Pik-K2P/A(2-930~1110)-R

<400> 6

tagatttaga gtgggatgag taagttaat 29

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Pik-N2P/A(2-930~1110)-F(#2N标记)

<400> 7

accactgtca ctactcggag ggaa 24

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Pik-N2P/A(2-930~1110)-R

<400> 8

atggatttac aattaagtta attggcat 28

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> KM1/KH1G1-357A-F(#3标记)

<400> 9

gtcctacgac ctggatgatg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> KM1/KH1G1-357A-R

<400> 10

cagagaagcg attggaggca 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> KM2/KH2G2-1559C-F(#4标记)

<400> 11

aagatagcaa caaagtagac gagc 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> KM2/KH2G2-1559C-R

<400> 12

caccatcgag ggtaagagga g 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> PikT1-2793C-F(#5标记)

<400> 13

ccttccagta cctctctcga agc 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> PikT1-2793C-R

<400> 14

aatggcaggc atagcttgtc c 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> PikT1-5932G-F(#6标记)

<400> 15

caaaagttcc tcgccgagat gc 22

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> PikT1-5932G-R

<400> 16

tcttcatgga aggctatcct tggta 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> PikmC1-851G/A-F(#7标记)

<400> 17

gcgctcgtag gtgatctaag agat 24

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> PikmC1-851G/A-R

<400> 18

gatttcaccg gcgcaagcat 20

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> PiksC1-957T-F1(#8标记)

<400> 19

tgcgatgttt ctggaggtca ggcatg 26

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> PiksC1-957T-F2

<400> 20

tgcggagttg ctgcaggtca ggcatg 26

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> PiksC1-957T-R

<400> 21

gtcgatgaga tgttgttgaa gagct 25

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> Pi1T1-853G-F1(#9标记)

<400> 22

gttgcaatcg ccggtgacct aagagacca 29

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> Pi1T1-853G-F2

<400> 23

gttgcgctcg taggtgatct aagagacca 29

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> Pi1T1-853G-R

<400> 24

tcacatatgg atttcaccgg cgcaagc 27

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> Pi1T2-2519A-F(#10标记)

<400> 25

caaagaaagg attcttatcc caat 24

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> Pi1T2-2519A-R

<400> 26

ccaccctttg ttatattgag ctt 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Pik-IR8A1-149G-F(#11标记)

<400> 27

cagagttcat cagatccgag ctt 23

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> Pik-IR8A1-149G-R

<400> 28

tcagagaagc gattggagac a 21

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> Pik-IR8A1-927G-dF(#12标记)

<400> 29

tcygcgctcc ggaagaaggt cg 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> Pik-IR8A1-927G-R

<400> 30

cctggcaatc caaggatgca aa 22

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> Pikp/7/khA2-2137G-F(#13标记)

<400> 31

gcaagggtta acccaggaaa g 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> Pikp/7/khA2-2137G-R

<400> 32

tagttgaatg aatggaatgg cc 22

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> Pikp/7T1-961A/G/C-dF(#14标记)

<400> 33

tgcgrwgttk ctgsaggtca gccaagyaat 30

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> Pikp/7T1-961A/G/C-R

<400> 34

gtcgatgaga tgttgttgaa gagct 25

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 分子标记PikhA1-961T/C/G-dF(#15a标记)

<400> 35

gttkctgsag gtcagccaag ytta 24

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> PikhA1-961T/C/G-R

<400> 36

ttgagcgaaa atgtctgcaa gagtct 26

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> PikhG1-961T/C/A-dF(#15b标记)

<400> 37

gttkctgsag gtcagccaag ctaa 24

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> PikhG1-961T/C/A-R

<400> 38

ttgagcgaaa atgtctgcaa gagtct 26

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Pik-IR64T1-3013C-F(#16标记)

<400> 39

caagctatgc ctgccattgg 20

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> Pik-IR64T1-3013C-R

<400> 40

caagaaatat atctccttgc agtcg 25

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> Pik-IR64T1-5468C-F(#17标记)

<400> 41

tggggagctg aatcatctaa agc 23

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Pik-IR64T1-5468C-R

<400> 42

acaaggggag gtccgaaacg 20