一种基于拟靶向代谢组学深度指纹实现细菌分类与鉴定的方法
阅读说明：本技术 一种基于拟靶向代谢组学深度指纹实现细菌分类与鉴定的方法 (Method for realizing bacteria classification and identification based on quasi-targeted metabonomics deep fingerprint ) 是由 吴清平 冯颖 丁郁 韦献虎 张友雄 陈谋通 张菊梅 杨小娟 陈玲 代京莎 杨宁 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于拟靶向代谢组学深度指纹实现细菌分类与鉴定的方法。对待鉴别的样品进行前处理,对处理后的样品进行代谢轮廓的采集,采集的数据经过归一化处理后,利用处理后的图谱进行细菌的鉴别。1、本方法只需要代谢物的提取过程,相比PCR技术,不需要等温扩增等步骤大大减少了检测时间,快速给出鉴别结果；2、本方法在采集方法和数据库建立成功后,不再需要高分辨质谱的参与,可以直接利用三重四级杆质谱,不但提高了数据质量和稳定性,而且降低了检测和仪器维护成本,更有利于大规模应用；3、代谢组与表型直接相关,加上质谱的高灵敏性,大大放大了菌株间的细微差异,可以更有效的实现菌株的鉴定和分类。(The invention discloses a method for realizing bacterial classification and identification based on pseudo-targeted metabonomics deep fingerprints. Preprocessing a sample to be identified, collecting a metabolic profile of the processed sample, carrying out normalization processing on the collected data, and identifying bacteria by using the processed map. 1. The method only needs the extraction process of the metabolite, compared with the PCR technology, the method does not need the steps of isothermal amplification and the like, thereby greatly reducing the detection time and rapidly giving the identification result; 2. after the acquisition method and the database are successfully established, the method does not need the participation of a high-resolution mass spectrum, can directly utilize the triple quadrupole mass spectrum, not only improves the data quality and stability, but also reduces the detection and instrument maintenance cost, and is more beneficial to large-scale application; 3. the metabolome is directly related to phenotype, and the high sensitivity of mass spectrum greatly amplifies the slight difference between strains, so that the identification and classification of the strains can be more effectively realized.)
技术领域
：本发明涉及分析化学领域、代谢组学领域、深度学习领域以及细菌的分类与鉴定领域，涉及一种基于拟靶向代谢组学技术与深度学习技术结合实现菌种的鉴定与分类的新方法。
背景技术
：代谢组学以一种整体的形式在分析生物系统的化学多样性方面已被证实是一种有力的工具，且其与表型直接相关，能更灵敏的反应不同物种间的细微差异。常规的代谢组学分析策略主要有非靶向和靶向两种，前者一般使用高分辨质谱获得丰富的代谢物信息，但存在数据复杂、重复性差、线性范围窄等缺点；后者一般使用三重四极杆质谱，数据质量有很大提高，但通常只检测已知代谢物，覆盖度低。针对上述特点，拟靶向代谢组学的概念被提出，目前该方法已被延伸到液相色谱-质谱领域，该方法在建立之初，用高分辨质谱获取代谢物的离子对信息，而在实际样品分析时采用靶向的多反应检测(MRM)方式测量代谢物的丰度，方法覆盖度高、线性和重复性良好，且不需要标样来限定检测的代谢物。目前，高覆盖度的(半)定量代谢组学方法在生命科学各领域均受到重视，拟靶向方法将会起到越来越重要的作用。
自本世纪初以来，深度学习得到了迅速发展，如今在各个领域都展现出了最先进的表现。深度学习由大数据获取、并行和分布式计算能力以及复杂的训练算法发展而来，促进了图像识别、语音识别和自然语言处理等多个领域的重大进展。目前，在生物学领域的应用也越来越广泛，如生物标志物开发的中药领域、基因组学、转录组学、蛋白质组学、结构生物和化学。
食源性致病菌是危害人类健康的极其重要的问题，已确定的食源性疾病有250多种。。这些致病菌包括单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、蜡样芽孢杆菌等。食源性病原体可引起多种健康问题，例如重复性肠道感染、中枢神经系统疾病、关节炎、肾脏疾病和失明。开发灵敏、快速的方法来严格监测各种食源性致病菌是必要和紧迫的。这些致病菌中，部分遗传相关性较高的菌种，如志贺氏菌和大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌等，即使用MALDI-TOF-MS方法，也无法通过常规标准程序直接区分。此外，MALDI-TOF-MS方法分析样品所需的基板、仪器、仪器维护等均价格昂贵，大大增加了鉴定成本，不利于大规模应用。迄今为止，仍然缺乏对病原菌进行鉴定和分型的有效手段，需要新的稳健、快速和可靠的方法来检测病原体。
由于代谢组与表型直接相关，细微差异也可以显现出来，使其有望成为比MALDI-TOF-MS细菌鉴定和分类更有力的工具。已有研究报道，通过代谢组学模式识别筛选差异代谢物，建立了以生物标志物来进行病原体识别和快速检测的方法和通过代谢组学轮廓进行识别的两种有效方法，使得代谢组学技术可以成为食源性病原体和腐败微生物的检测与鉴定平台。然而，针对这两种方法，一方面筛选得到的生物标记物验证困难，对进一步用于鉴定的有效性评价也并未见报道；另一方面，以上分析方法都依赖于高分辨质谱，价格昂贵，维护成本高，使得其用于细菌鉴定和分类的成本大大提高，不利于其大规模应用。
发明内容
：本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺陷，提供一种基于拟靶向代谢组学轮廓和深度学习实现细菌分类与鉴定的方法，其采用拟靶向代谢组学技术，用LC-QQQ-MS获取不同菌种的代谢轮廓，结合机器学习技术，实现细菌不同属，不同种，不同血清型以及耐药性菌株的识别和鉴定。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的基于拟靶向代谢组学轮廓和深度学习实现细菌分类与鉴定的方法，对待鉴别的样品进行前处理，对处理后的样品进行代谢轮廓的采集，采集的数据经过归一化处理后，利用处理后的图谱进行细菌的鉴别。
进一步地，具体步骤如下步骤：
1)样品前处理；
2)拟靶向方法的建立
使用高分辨质谱采集质量控制(QC)样品的一级和二级信息，经处理后，导出代谢物的母离子和子离子列表，生成具有SRM或者MRM通道的超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集方法；质量控制(QC)样品是通过混合所有样品的等份上清液来制备的；
每个方法均对质量控制样品重复3次分析，离子对出现至少2次以上且校正保留时间与特征离子对库中的校正保留时间偏差≤0.5min,视为有效离子对；这里的质量控制样是由待分析样品等体积混合制备而成。
3)代谢轮廓的收集
用建立的超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集方法进行实际待测样本的高覆盖代谢组学分析采集代谢轮廓质谱图谱；
4)代谢轮廓图谱的预处理
对质谱数据进行峰的检测、提取、对齐和积分后进行缺失值的填充和归一化处理后进行后续的数据分析；
5)细菌的鉴别
通过机器学习算法对已知分类的代谢轮廓图谱数据进行训练，建立细菌鉴定数据库，将新的数据代入库中进行测试鉴定。
在本发明在一个实施方式中，步骤1)的样品前处理是将生长至OD600值达到0.6±0.05的菌液或者临床感染标本，离心收集，冷PBS溶液洗涤两次后，液氮淬灭代谢反应，加入冷提取液超声破碎后，收集上清液用于LC/MS分析，所述的冷提取液包括按体积比乙腈：甲醇：水＝2：2：1，含同位素标记内标混合物；质量控制(QC)样品是通过混合所有样品的等份上清液来制备的。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，所述的高分辨质谱包括TOF,Orbitrap,FT-ICR-MS等。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)中,超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集方法包括MRM、SRM等。
在本发明的一个实施方式中，步骤3)中,采集时间共12min。
在本发明的一个实施方式中，步骤3)中,流动相条件：0～1.0min,1％B；1.0～8.0min,1％～99％B；8.0～10.0min,99％B；10.0～10.1min,99％～1％B；10.1～12min,1％B，其中流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B可以为乙腈或甲醇。
在本发明的一个实施方式中，步骤4)中,数据的缺失值填充方法包括选取某个固定值/默认值填充缺失值，填充均值，填充中位数，填充众数，填充KNN数据，填充模型预测的值等。
在本发明的一个实施方式中，步骤4)中,数据的归一化包括内标归一、QC归一、四分位归一、log转换、Auto scaling、Pareto scaling等方法中的一种或者多种。
在本发明的一个实施方式中，步骤5)中,机器学习算法包括PCA-DFA、PCA-SVM、CNN(ResNet、DenseNet)、VAE-CNN、VAE-ANN等。
常见的机器学习方法，如SVM、DFA等，在进行DFA和SVM分析前，先进行PCA分析，对多维数据进行降维，然后利用DFA或SVM分析对降维后的复杂变量进行线性重组，把复杂简单化，由此可以看到两个或多个组别之间的最大变化。CNN是深度学习(deep learning)的代表算法之一，具有表征学习能力。其中，深度残差网络(Deep residual network,ResNet)的提出是CNN图像史上的一件里程碑事件。当网络深度增加时，网络准确度出现饱和，甚至出现下降，发生退化问题。ResNet通过残差学习解决了深度网络的退化问题，可以训练出更深的CNN模型，从而实现更高的准确度。ResNet模型的核心是通过建立前面层与后面层之间的“短路连接”(shortcuts，skip connection)，这有助于训练过程中梯度的反向传播，从而能训练出更深的CNN网络。DenseNet模型，它的基本思路与ResNet一致，但是它建立的是前面所有层与后面层的密集连接(dense connection)，它的名称也是由此而来。DenseNet的另一大特色是通过特征在channel上的连接来实现特征重用(feature reuse)。这些特点让DenseNet在参数和计算成本更少的情形下实现比ResNet更优的性能。
代谢组学是生物体被扰动后(如基因改变或环境改变)，通过对生物体内所有小分子代谢物进行定性定量分析，发现其代谢物种类/数量及其变化规律，并寻找代谢物与生理病理变化相对关系的科学。其研究对象大多是分子量在1000Da以下的小分子物质，如糖、有机酸、脂质、氨基酸、芳香烃等。液相色谱-质谱(LC-MS)是代谢组学中一个越来越重要的工具。
本发明用拟靶向代谢组学技术获取不同菌种的代谢轮廓，结合深度学习技术，建立细菌代谢轮廓图谱库，实现细菌不同属、不同种以及不同血清型的识别和鉴定。代谢组学主要分为非靶向和靶向分析策略，拟靶向分析方法结合了二者的优势，以实际样品为天然混合标准品，提供了更全面的代谢组学信息，而不仅仅是能鉴定到代谢物，消除了对标准品的依赖，简化了随后的MRM分析的优化，还可以同时检测已知和未知的代谢物，显著地扩大了覆盖范围。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本方法只需要代谢物的提取过程，相比PCR技术，不需要等温扩增等步骤大大减少了检测时间，快速给出鉴别结果；
2、本方法在采集方法和数据库建立成功后，不再需要高分辨质谱的参与，可以直接利用三重四级杆质谱，不但提高了数据质量和稳定性，而且降低了检测和仪器维护成本，更有利于大规模应用；
3、代谢组与表型直接相关，加上质谱的高灵敏性，大大放大了菌株间的细微差异，可以更有效的实现菌株的鉴定和分类；
4、通过机器学习建立的代谢轮廓图谱库，将新采集的图谱数据直接代入库中进行判别，机器学习判别，尤其是深度学习判别可以有效地保障鉴别结果的准确性。
附图说明
图1是CNN算法结构框架图
图2是ResNet算法结构框架图
图3是CNN分类与鉴定验证集的混淆矩阵
图4是ResNet分类与鉴定验证集的混淆矩阵
具体实施方式
通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于一下所公开的示范性实施例，可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。下面通过实例进一步阐释本发明，实例仅限于说明本发明以便于理解，而非对本发明的限定。
实施例1
本实施例要使用本发明的方法获取，收集菌株常见食源性致病菌B.cereus,E.coli,Enterobacter sakazakii,Listeria,P.Aeruginosa,Salmonella enteritidis,Staphylococcus aureus,Y.enterocolitica；李斯特氏菌常见的6个种L.grayi,L.innocua,L.iuanuii,L.monocytohenes,L.seeligeri,L.welshimeri；以及单增李斯特氏菌常见的血清型(2a,2b,2c,3b,4a,4ab,4b,4c,4d,7)和耐青霉素的单增李斯特氏菌，每株菌独立培养获取以上的10个平行样，分两个批次培养，每个平行样两个技术重复，共获取上述菌株3146个样本的数据集。
基于拟靶向代谢组学轮廓和深度学习实现细菌分类与鉴定的方法，具体包括以下步骤：
1)样品前处理
菌株收集：将上述菌株活化后平板过夜培养，挑单菌落接种至BHI肉汤，过夜培养后调OD600至0.2，重新接种至BHI肉汤培养基，接种量10％,37℃生长至OD值达到0.6±0.05。-10℃和12000r/min离心15分钟收集菌株细胞后，用1ml冷PBS溶液转移并洗涤两次后，液氮淬灭代谢反应。然后加入800μL冷提取液(体积比乙腈：甲醇：水＝2：2：1，含同位素标记内标，[2H9]-氧化三甲胺，2μg/ml)超声破碎，功率约400w，破碎6s，停4s。超声分解后，样品在-20℃孵育1h，4℃、12 000r/min离心15min收集上清液并进行真空干燥。最后，用200ul乙腈溶液(体积比乙腈：水＝1：1)进行重悬并超声15分钟，取上清用于LC/MS分析。质量控制(QC)样品是通过混合所有样品的等体积份上清液来制备的。
2)拟靶向方法的建立
上述样品各取10ul等体积混合后得到质量控制(QC)样品。使用UHPLC-Q-Orbitrap液相色谱-质谱联用系统：Ultimate 3000超高效液相色谱仪(Dionex公司)串联Q Exactive高分辨质谱(Thermo Fisher Scientific公司)采集质量控制(QC)样品的一级和二级信息。采集时间为12min，流动相条件：0～1.0min,1％B；1.0～8.0min,1％～99％B；8.0～10.0min,99％B；10.0～10.1min,99％～1％B；10.1～12min,1％B，其中流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。经处理后，导出代谢物的母离子和子离子列表，生成具有SRM通道的TSQ Quantiva三重四极杆采集方法。每个方法均对质量控制样品重复3次分析，离子对出现至少2次以上且校正保留时间与特征离子对库中的校正保留时间偏差≤0.5min，视为有效离子对；这里的质量控制样是由待分析样品等体积混合制备而成。
3)代谢轮廓的收集
用建立的超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集方法进行实际待测样本的高覆盖代谢组学分析采集代谢轮廓质谱图谱。采集时间为12min，流动相条件：0～1.0min,1％B；1.0～8.0min,1％～99％B；8.0～10.0min,99％B；10.0～10.1min,99％～1％B；10.1～12min,1％B，其中流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。
4)代谢轮廓图谱的预处理
用Tracefinder进行定量处理，获取离子对半定量结果，作为代谢指纹。如若定量结果为0，则将其视为缺失值，进行缺失值填充，剔除组间缺失值超过50％的特征，然后进行均值填充。在深度学习识别模型建立之前，进行数据的归一化和标准化，主要进行了内标归一，log转换，以及Pareto scaling方法。
5)细菌的鉴别
深度学习模型的建立，本发明此实施例设计了卷积神经网络来实现菌株代谢轮廓的分类与识别，具体设计如下：特征层特征提取和表示、非线性映射和分类映射的二层全连接网络组成。该算法的结构如图1所示。
本研究算法的具体内容及流程如下：
ⅰ.第一层卷积网络的作用为数据的特征提取和表示，可表示为
式中W1为卷积核，B1为n1维的偏差，*表示卷积运算，W1表达式为c1×f1×1，代表c1个f1×1的卷积核，其中c1为滤波器的个数(本研究设置第一层滤波器个数为512，因此c＝512)。输入样本Y，通过滤波器对Y进行卷积操作(Conv1D)，得到Y的特征向量，该层输出的特征向量经过Relu激活函数处理输出得到F1(Y)。
ⅱ.第二层中，将c1维特征向量映射到c2维特征向量，可表示为
式中B2为n2维的偏差，W2表达式为c2×f2×1，代表c2个f2×1的卷积核。输入F1(Y)，通过滤波器对其进行卷积操作(Conv1D)，得到F1(Y)的特征向量，并经过Relu激活函数处理得到F2(Y)。
ⅲ.第三层，利用全连接网络对前面所学习到的非线性映射关系进行非线性映射，可表示为
主要将进行Flatten操作将F2(Y)进行顺序展平，并进行全连接操作，神经元个数设置为128。输入F2(Y)，构建全连接操作，并经过Relu激活函数处理得到F3(Y)。
ⅳ.第四层，利用全连接网络对前面所学习到的非线性映射关系进行分类映射，可表示为
主要进行全连接操作，并进行分类映射，由于本研究处理的是二分类问题，因此，将该层神经元个数设置为24。输入F3(Y)，构建全连接操作，并经过Softmax激活函数处理得到F4(Y)。
ⅴ.准确率(Accuracy)作为本研究网络算法的损失函数来学习获得网络的参数,训练的本质就是对这些参数进行优化，训练参数包括(W1,W2,W3,W4,B1,B2,B3,B4)。准确率可以表示为
式中，N表示训练样本数量，Tn表示预测正确的训练样本数量。
6)鉴定结果
鉴定结果如图3所示，其验证集预测准确率达到96％以上，主要集中在部分L.iuanuii。
实施例2
本实施例要使用本发明的方法获取，收集菌株常见食源性致病菌B.cereus,E.coli,Enterobacter sakazakii,Listeria,P.Aeruginosa,Salmonellaenteritidis,Staphylococcus aureus,Y.enterocolitica；李斯特氏菌常见的6个种L.grayi,L.innocua,L.iuanuii,L.monocytohenes,L.seeligeri,L.welshimeri；以及单增李斯特氏菌常见的血清型(2a,2b,2c,3b,4a,4ab,4b,4c,4d,7)和耐青霉素的单增李斯特氏菌，每株菌独立培养获取以上的8个平行样，分两个批次培养，每个平行样两个技术重复，共获取上述菌株3146个样本的数据集。
基于拟靶向代谢组学轮廓和深度学习实现细菌分类与鉴定的方法，具体包括以下步骤：
1)样品前处理
菌株收集：上述菌株活化后平板过夜培养，挑单菌落接种至BHI肉汤，过夜培养后调OD600至0.2，重新接种至BHI肉汤培养基，接种量10％,37℃生长至OD值达到0.6±0.05。-10℃和12000rpm离心15分钟收集菌株细胞后，用1ml冷PBS溶液转移并洗涤两次后，液氮淬灭代谢反应。然后加入800μL冷提取液(体积比乙腈：甲醇：水＝2：2：1，含同位素标记内标,[2H9]-氧化三甲胺，2μg/ml)超声破碎，功率约400w，破碎6s，停4s。超声分解后，样品在-20℃孵育1h，4℃、12 000rpm离心15min收集上清液并进行真空干燥。最后，用200ul乙腈溶液(体积比乙腈：水＝1：1)进行重悬并超声15分钟，取上清用于LC/MS分析。质量控制(QC)样品是通过混合所有样品的等体积份上清液来制备的。
2)拟靶向方法的建立
上述样品各取10ul等体积混合后得到质量控制(QC)样品。使用UHPLC-Q-Orbitrap液相色谱-质谱联用系统：Ultimate 3000超高效液相色谱仪(Dionex公司)串联Q Exactive高分辨质谱(Thermo Fisher Scientific公司)采集质量控制(QC)样品的一级和二级信息。采集时间为12min，流动相条件：0～1.0min,1％B；1.0～8.0min,1％～99％B；8.0～10.0min,99％B；10.0～10.1min,99％～1％B；10.1～12min,1％B，其中流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。经处理后，导出代谢物的母离子和子离子列表，生成具有SRM通道的TSQ Quantiva三重四极杆采集方法。每个方法均对质量控制样品重复3次分析，离子对出现至少2次以上且校正保留时间与特征离子对库中的校正保留时间偏差≤0.5min，视为有效离子对；这里的质量控制样品是由待分析样品等体积混合制备而成。
3)代谢轮廓的收集
用建立的超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集方法进行实际待测样本的高覆盖代谢组学分析采集代谢轮廓质谱图谱。
4)代谢轮廓图谱的预处理
用Tracefinder进行定量处理，获取离子对半定量结果，作为代谢指纹。如若定量结果为0，则将其视为缺失值，进行缺失值填充，剔除组间缺失值超过50％的特征，然后进行均值填充。在深度学习识别模型建立之前，进行数据的归一化和标准化，主要进行了内标归一，log转换，以及Pareto scaling方法。
5)细菌的鉴别
深度学习模型的建立，本发明此实施例设计了残差网络来实现菌株代谢轮廓的分类与识别，具体设计如下：本设计算法由特征层特征提取和表示、残差块非线性映射和分类映射的二层全连接网络组成，网络结构组成如图2所示。
具体内容如下：
i第一层卷积网络的作用为数据的特征提取和表示，可表示为
式中W1为卷积核，B1为n1维的偏差，*表示卷积运算，W1表达式为c1×f1×1，代表c1个f1×1的卷积核，其中c1为滤波器的个数(本研究设置第一层滤波器个数为256，因此c＝256)。输入样本Y，通过滤波器对Y进行卷积操作(Conv1D)，得到Y的特征向量，该层输出的特征向量经过Relu激活函数处理输出得到F1(Y)。
ⅱ.第二层为残差块的非线性映射，残差块本身由若干次卷积、批标准化、激活映射组成，避免了梯度消失。通过Convolutional Block将c1维特征向量映射到c2维特征向量，可表示为
输入F1(Y)，通过残差块对其进行非线性映射操作，得到F1(Y)的特征向量，并经过Relu激活函数处理得到F2(Y)。
ⅲ.第三层，利用全连接网络对前面所学习到的非线性映射关系进行非线性映射，可表示为
主要将进行Flatten操作将F2(Y)进行顺序展平，并进行全连接操作，神经元个数设置为256。输入F2(Y)，构建全连接操作，并经过Relu激活函数处理得到F3(Y)。
ⅳ.第四层，利用全连接网络对前面所学习到的非线性映射关系进行分类映射，可表示为
主要进行全连接操作，并进行分类映射，由于本研究处理的是二分类问题，因此，将该层神经元个数设置为24。输入F3(Y)，构建全连接操作，并经过Softmax激活函数处理得到F4(Y)。F4(Y)及为样本的分类结果。
ⅴ.准确率(Accuracy)作为本研究网络算法的损失函数来学习获得网络的参数,训练的本质就是对这些参数进行优化。准确率可以表示为
式中，N表示训练样本数量，Tn表示预测正确的训练样本数量。
6)鉴定结果
鉴定结果如图4所示，其验证集预测准确率达到99％以上。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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