黄芪多糖在制备具有吸湿、保湿或舒缓功效的化妆品中的应用
阅读说明：本技术 黄芪多糖在制备具有吸湿、保湿或舒缓功效的化妆品中的应用 (Application of astragalus polysaccharide in preparation of cosmetics with moisture absorption, moisture retention or relieving effects ) 是由 刘小花 王少华 刘珈铭 王昊 戴伟昊 于 2021-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供黄芪多糖在制备具有吸湿、保湿或舒缓功效的化妆品中的应用。所述化妆品包括霜膏、乳液、膜粉剂、啫喱剂、粉饼、气雾剂和喷雾剂。所述黄芪多糖的制备方法为：将黄芪通过复合酶联合超声提取法进行提取,然后用乙醇沉淀,将乙醇回收后,再加入不同比例乙醇进行纯化,得到不同的黄芪多糖；所述复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶。本发明的黄芪多糖具有良好的吸湿、保湿和舒缓功效,在化妆品领域具有一定的研究价值。应用本发明方法制备的多种醇沉黄芪多糖的吸湿、保湿和舒缓功效均佳。(The invention provides application of astragalus polysaccharide in preparing cosmetics with moisture absorption, moisture retention or relieving effects. The cosmetics comprise creams, lotions, film powders, gels, pressed powders, aerosols and sprays. The preparation method of the astragalus polysaccharide comprises the following steps: extracting radix astragali by complex enzyme combined ultrasonic extraction method, precipitating with ethanol, recovering ethanol, and purifying with ethanol of different proportions to obtain different astragalus polysaccharides; the complex enzyme is cellulase and papain. The astragalus polysaccharide disclosed by the invention has good moisture absorption, moisture retention and relieving effects, and has a certain research value in the field of cosmetics. The various alcohol-precipitated astragalus polysaccharides prepared by the method have good moisture absorption, moisture retention and relieving effects.)
技术领域
本发明涉及黄芪多糖在制备具有吸湿、保湿或舒缓功效的化妆品中的应用。
背景技术
多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成的糖，也被称为多聚糖。多糖是植物重要的贮藏养料的形式，并且构成了植物的基本骨架，是植物的重要组成部分，在植物体内发挥着重要的作用。除了对植物本身的作用，多糖还具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老以及治疗心脑血管疾病等多种独特的生物活性。植物多糖细胞毒性相对较小，因此植物多糖越来越受到人们的重视和青睐。
黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补气固表，托毒排脓，利尿，生肌等作用。虽然黄芪和红芪同为一科，但是经过多年的研究，发现黄芪和红芪的活性成分并不相同。黄芪多糖是黄芪主要的化学成分和主要的活性成分之一。葡聚糖和杂多糖是黄芪多糖主要成分，具有调节免疫、抗氧化和抗衰老等作用。
随着生活水平的日益提高，在温饱得到满足的现代生活，越来越多的人更加注重自身的形象以及寿命的延长。随着消费者对化妆品需求的增加，一大批化妆品涌入市场，但是一些劣质化妆品给消费者和社会造成了严重的危害，某些化妆品中化学添加剂导致毁容的案例一时间让广大消费者谈“虎”色变。为了保证化妆品的安全性，一些合成的化学物质逐渐被细胞毒性更小的天然产物所替代。随着技术的不断发展和研究的不断深入，越来越多的天然成分被添加到化妆品中，在保证化妆品安全性的同时又能改善了其疗效，从而使消费者对化妆品趋之若鹜。时代在发展，科技在进步，但是化妆品的主题依旧闪亮，抗衰老、美白、防晒等功效的化妆品经久不衰。
目前已经有许多天然产物被添加到化妆品中发挥着不同的作用。比如，雷杨等通过HPD-400大孔吸附树脂将楮实子粗提物进行分离，得到水、30％、60％以及95％四个部位，以B16细胞为研究对象，研究了了各部位是如何影响酪氨酸酶的活性，并且测定了各部位对黑色素合成的抑制作用。结果表明，在楮实子粗提物中，60％乙醇部位具有最强的抑制酪氨酸酶活性的作用，并且能抑制B16细胞中黑色素的合成，具有较好的美白效果。再比如，由士权等采用微生物发酵和二次醇沉法对沙棘籽粕中的总黄酮进行提取，优化大孔吸附树脂的条件后对提取的黄酮进行分离纯化，利用单因素试验确定了较佳的工艺条件。实验结果表明，DPPH自由基清除率与沙棘籽粕发酵液中黄酮含量呈正相关，沙棘黄酮对纤维细胞基本没有毒副作用，能够显著降低活性氧的水平，使基质金属蛋白酶含量降低，增加胶原蛋白的含量，具有一定的抗衰老作用。
当皮肤角质层中水分小于10％时，皮肤就会变得干燥，弹性消失，出现皱纹，皮肤的老化程度会明显加快。因此，使用保湿性好的化妆品能够延缓皮肤的衰老。而消费者更能接受将天然产物添加到化妆品中。如今关于黄芪多糖的研究大多在于体内的药理作用和机制、成药性以及在临床中的应用前景，尚未见其在化妆品中的应用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了黄芪多糖在制备具有吸湿、保湿或舒缓功效的化妆品中的应用。本课题组在实验过程中意外发现黄芪多糖在日常环境中很容易吸潮，不易保存，即黄芪多糖可能具有良好的吸湿性。故本申请人将通过实验研究黄芪多糖的吸湿性和保湿性，探索其是否能替代传统的化妆品保湿剂，希望能够为中药的研究开拓新的方向。
为了实现本发明的技术目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供黄芪多糖在制备具有吸湿、保湿或舒缓功效的化妆品中的应用。
可以用现有技术中的通用方法制备成含有黄芪多糖的各种化妆品，比如霜膏、乳液、膜粉剂、啫喱剂、粉饼、水剂、气雾剂和喷雾剂等。本发明对上述各种化妆品的制备方法没有限制。
作为优选，所述黄芪多糖的制备方法为：将黄芪通过复合酶联合超声提取法进行提取，然后用90％以上乙醇沉淀，将乙醇回收后；再加入乙醇进行纯化，根据溶液中乙醇含量的不同，得到不同的醇沉黄芪多糖；所述复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶。
作为优选，所述纤维素酶为2％，所述木瓜蛋白酶为2％。
作为优选，所述复合酶提取的pH为5.2，温度为54.1℃，提取时间为2h。
作为优选，所述用乙醇进行沉淀是加入浓度为90％以上的乙醇直至溶液中乙醇浓度为80-85％。
作为优选，所述加入乙醇进行纯化是加入浓度为90％以上的乙醇，然后在溶液中乙醇浓度为30-85％时收集沉淀出的黄芪多糖。
作为优选，所述加入乙醇进行纯化是加入浓度在90％以上的乙醇，然后在溶液中乙醇浓度为30％-35％时收集沉淀出的黄芪多糖；或
所述加入乙醇进行纯化是加入浓度在90％以上的乙醇，然后在溶液中乙醇浓度为50％-55％时收集沉淀出的黄芪多糖；或
所述加入乙醇进行纯化是加入浓度为90％以上的乙醇，然后在溶液中乙醇浓度为80-85％时收集沉淀出的黄芪多糖。
本发明还提供一种化妆品，其中具有吸湿、保湿或舒缓功效的成分包括上述的黄芪多糖。
作为优选，所述具有吸湿、保湿或舒缓功效的红芪多糖，是在粗多糖中加入乙醇进行纯化时，在溶液中乙醇浓度为30％、50％或80％时收集沉淀的红芪多糖。
本发明的黄芪多糖具有良好的吸湿、保湿和舒缓功效，在化妆品领域具有一定的研究价值。应用本发明方法制备的30％、50％、80％三种醇沉黄芪多糖的吸湿、保湿和舒缓功效均佳。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施案例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为葡萄糖溶液标准曲线。
图2为黄芪多糖样品在RH为43％(a)和81％(b)时吸湿率与时间的变化关系。
图3为黄芪多糖和甘油在不同湿度环境下的保湿率。
图4为黄芪多糖刺激性实验测试结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明的黄芪多糖的制备方法如下：
称取脱脂黄芪粉末适量，加入纤维素酶(2wt％，酶与酸水的重量百分比)、木瓜蛋白酶(2wt％，酶与酸水的重量百分比)，然后按水料质量比为30:1(每次10、10、10倍溶剂，分三次提取)加入酸水，放入恒温水浴锅内，于53.8-54.4℃酶解1.5-2.5小时，然后再超声提取，使用纱布过滤，药渣继续加酸水超声提取第二次和第三次，每次超声提取30-40min，合并滤液，然后离心(8000-10000r/min)取上层清液，浓缩至原体积的十分之一。边搅拌边向浓缩液中滴加90％以上乙醇，最终至乙醇浓度为80-85％。静置倒出滤液，将沉淀在水浴锅上挥发至无乙醇味，冷冻干燥得到黄芪多糖粗品。
溶液中乙醇浓度为80-85％时，能够将大部分的多糖沉淀完全。
取冷冻干燥后的黄芪多糖粗品适量，加入适量水溶解，边搅拌边滴加90％以上乙醇，使乙醇浓度分别达到30-35％、50-55％、80-85％，离心(8000r/min)取沉淀，然后得到30-35％、50-55％、80-85％的黄芪醇沉多糖，将三部分的醇沉多糖在水浴锅上挥发至无乙醇味，冷冻干燥后放至干燥器中保存，干燥剂为变色硅胶。
所述酸水为用柠檬酸将水调节pH至5.2。
上述乙醇浓度均是使用酒精计在常温下测量得到的。
实施例1黄芪多糖吸湿及保湿功效研究
1试验材料及仪器
1.1实验材料
依次使用95％乙醇和乙酸乙酯将黄芪粉末脱脂3遍，得到脱脂黄芪粉末。
1.2实验用酶及试剂
表1实验中提取黄芪多糖所用的酶及试剂
1.3实验仪器
表2提取黄芪多糖所用的实验仪器
2实验方法
2.1黄芪多糖的制备
称取3200g脱脂黄芪粉末，加入64g纤维素酶、64g木瓜蛋白酶，再加入32000g酸水，放入恒温水浴锅内，于54.1℃酶解2小时，然后再超声提取，提取后使用纱布过滤，药渣继续加酸水超声第二次和第三次，每次超声提取30min，每次加入酸水32000g，合并滤液，然后离心(8000r/min)取上层清液，浓缩至原体积的十分之一。边搅拌边向浓缩液中滴加90％乙醇，最终至乙醇浓度为80％。静置倒出滤液，将沉淀在水浴锅上挥发至无乙醇味，冷冻干燥得到黄芪多糖粗品。
取冷冻干燥后的黄芪多糖粗品适量，加入适量水溶解，边搅拌边滴加90％乙醇，使乙醇浓度分别达到30％、50％、80％，离心(8000r/min)取沉淀，然后得到30％、50％、80％的黄芪醇沉多糖，将三部分的醇沉多糖在水浴锅上挥发至无乙醇味，冷冻干燥后放至干燥器中保存，干燥剂为变色硅胶。
所述酸水为用柠檬酸将水调节pH至5.2。
上述乙醇浓度均是使用酒精计在常温下测量得到的。
2.2黄芪多糖含量的测定
2.2.1葡萄糖标准曲线的制作及结果
称取25mg葡萄糖加水配置成100ml葡萄糖标准品溶液，用精密吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖标准品溶液置于10mL容量瓶中，定容后再分别吸取上述溶液各2mL放入试管中，加入1ml新配置的5％苯酚溶液，混匀后加入5mL 98％浓硫酸，涡旋，15min后用自来水冷却至室温。以蒸馏水按上述方法作空白对照，用紫外分光光度计在490nm处测量反应后各溶液的吸光度。以葡萄糖溶液的浓度为横坐标，溶液的吸光度为纵坐标制作标准曲线，计算得到回归方程。
葡萄糖标准曲线回归方程为：y＝16.722x-0.0146(R2＝0.992)。
图1为葡萄糖溶液标准曲线。
表3葡萄糖标准曲线制作测定结果
2.2.2多糖含量的测定及产率
称取各多糖样品25mg，适量蒸馏水溶解后置于100mL容量瓶中，定容。按照步骤2.2.1中标准曲线的制备方法测定样品溶液的吸光度，代入标准曲线计算得出样品溶液中多糖的浓度。根据样品溶液中多糖的浓度计算出样品中多糖的质量，与称取样品质量的比值即为该样品中多糖的含量。
2.3吸湿性试验
将称量瓶放于烘箱中恒重6h，准确称取步骤2.1制备的0.5g冷冻干燥后的30％、50％、80％的黄芪醇沉多糖样品以及对照品甘油各3份，分别加入恒重后的称量瓶中，将药品稳定性试验箱设置为温度20℃，相对湿度(RH)43％，待药品稳定性试验箱稳定后放入盛有样品的称量瓶，放置1h，3h，6h，10h，24h，34h和48h后精确称取各称量瓶的质量，根据各样品及甘油吸湿前后的质量差求取其吸湿率。吸湿率＝(Mn-M0)/M0×100％，M0为各样品未吸湿前的质量，Mn为各样品在药品稳定性试验箱内放置相应时间后的质量。
将各样品继续在温度为20℃，RH为43％的高湿度药品稳定性试验箱内放置，直至各样品吸湿达到饱和。
再准确称取干燥的30％、50％、80％的黄芪多糖样品和对照品甘油各3份，分别加入恒重后的称量瓶中，将药品稳定性试验箱的温度设置为20℃，RH设置为81％，同RH为43％时吸湿率的测定步骤测定RH为81％时各样品的吸湿率。
将各样品继续在温度为20℃，RH为81％的高湿度药品稳定性试验箱内放置，直至各样品吸湿达到饱和。
2.4保湿性试验
将步骤2.3中在RH为43％和81％分别达到吸湿饱和的样品继续放置在温度为20℃，RH分别为43％和81％的药品稳定性试验箱内，放置48h后，精确称取各样品的质量，根据样品放入前后的吸湿质量差计算得到各样品的保湿率。保湿率＝Cn/C0×100％，式中C0为各样品吸湿饱和后的吸湿量，Cn为放置48h后各样品的吸湿量。
3结果与讨论
3.1黄芪多糖含量及产率
黄芪各部分的多糖产量见表4，多糖含量及产率如表5所示。从表5中可以看出黄芪多糖含量最高的均为80％醇沉多糖，最低的均为30％醇沉多糖；产率最高的均为80％醇沉多糖，最低的均为50％醇沉多糖。
多糖含量＝CV/1000M×100％，式中的C为由回归方程求得的多糖液的质量浓度(mg.L-1)；V为冻干多糖样品定容的体积(mL)；M冻干多糖的取样量(mg)。
多糖产率＝m/1000M×100％，式中m为冻干多糖样品的质量(mg)；M为脱脂黄芪药粉的质量(g)。
表4黄芪多糖制备中各产物的产量
表5黄芪各部分多糖的含量及产率
3.2黄芪多糖的吸湿性
甘油在RH为43％和81％时的吸湿量随时间的变化关系如表6所示。
表6甘油在RH为43％环境中的吸湿量随时间变化的关系
3.2.1黄芪多糖的吸湿性
各部分黄芪多糖在RH为43％和81％时的吸湿量随时间的变化关系如表7和表8所示。
表7各部分黄芪多糖在RH为43％环境中的吸湿量随时间变化的关系
表8各部分黄芪多糖在RH为81％环境中的吸湿量随时间变化的关系
黄芪30％醇沉多糖、50％醇沉多糖、80％醇沉多糖和甘油在43％和81％的RH环境中吸湿率随着时间变化的曲线如图2所示。
图2为黄芪多糖样品在RH为43％(a)和81％(b)时吸湿率与时间的变化关系。
从图2的a图中可以看出，在环境湿度相对较低(RH＝43％)时，三种黄芪多糖的吸湿率和明显低于甘油。在24h前三种黄芪多糖吸湿率的大小顺序为30％醇沉多糖＞80％醇沉多糖＞50％醇沉多糖，在24h后三种黄芪多糖吸湿率的大小顺序为50％醇沉多糖＞30％醇沉多糖＞80％醇沉多糖，24h前三种黄芪多糖的吸湿性差异比24h后三种黄芪多糖的吸湿性差异大。30％醇沉多糖和80％醇沉多糖的吸湿率在10h前随时间增加而增大，在10h达到最大值，30％醇沉多糖最大吸湿率为5.98％，80％醇沉多糖最大吸湿率为5.61％。随后这两种黄芪多糖的吸湿率随时间增加先减小后增大。而50％醇沉多糖在测定时间范围内的吸湿率一直随时间增加而增大，在48h达到最大值，50％醇沉多糖最大吸湿率为5.90％。三种黄芪多糖在48h后基本都达到了吸湿饱和。
由图2的b图可以看出，在环境湿度相对较高(RH＝81％)时，三种黄芪多糖均具有一定的吸湿性，但仍然明显小于甘油的吸湿率。3h前三种黄芪多糖吸湿率的大小顺序为30％醇沉多糖＞80％醇沉多糖＞50％醇沉多糖，3h后三种黄芪多糖吸湿率的大小顺序为80％醇沉多糖＞30％醇沉多糖＞50％醇沉多糖。三种黄芪多糖在24h前的吸湿率均随时间的增加而不断增大，24h三种黄芪多糖的吸湿率达到最大值，此时30％醇沉多糖最大吸湿率为20.24％，50％醇沉多糖最大吸湿率为19.26％，80％醇沉多糖最大吸湿率为23.43％。在24h后三种黄芪多糖的吸湿率均随时间的增加而先减小后增大，48h后三种黄芪多糖基本达到饱和状态。
由图2可以看出在低湿度环境中30％醇沉多糖样品的吸湿性相对较好，在高湿度环境中80％醇沉多糖样品的吸湿性较优于另外两种多糖样品。
3.2.2黄芪多糖与甘油的吸湿率的方差分析
黄芪多糖与对照品甘油在RH为43％和81％时的吸湿率的方差分析结果如表9所示。由表中结果可知，在RH为43％和81％时，按α＝0.05水准黄芪多糖和甘油吸湿率的差异均有统计学意义，认为黄芪多糖和甘油的吸湿率的总体均数不全相等。由图2可知，甘油的吸湿率最高。
表9黄芪多糖和甘油在不同RH环境中的吸湿率方差分析结果
3.3黄芪多糖的保湿性
3.3.1黄芪多糖的保湿性
黄芪的30％醇沉多糖、50％醇沉多糖、80％黄芪多糖和甘油在不同湿度环境中的保湿率如图3和表10所示。从表10和图3中数据可以看出在43％的相对湿度环境中，三种黄芪多糖和甘油保湿率的大小顺序为30％醇沉多糖＞80％醇沉多糖＞甘油＞50％醇沉多糖。在81％的相对湿度环境中，80％醇沉多糖保湿率最大，达到98.21％，黄芪50％醇沉多糖的保湿性最差，三种黄芪多糖的保湿率略小于甘油。
图3为黄芪多糖和甘油在不同湿度环境下的保湿率。
表10黄芪多糖和甘油在不同湿度环境中的保湿率
3.3.2黄芪多糖与甘油的吸湿率的方差分析
黄芪多糖与对照品甘油在RH为43％和81％时的保湿率的方差分析结果如表11所示。由结果可知，在RH为43％时，按α＝0.05水准黄芪多糖和甘油吸湿率的差异有统计学意义，认为黄芪多糖和甘油的保湿率的总体均数不全相等。
表11黄芪多糖和甘油在不同RH环境中的保湿率方差分析结果
3.4结语
黄芪多糖中产率最高和含量最高的均为80％醇沉多糖部分。吸湿性实验结果显示在20℃，RH为43％时，黄芪多糖中吸湿率最大的为30％醇沉多糖部分，为5.98％；在RH为81％时，黄芪多糖中80％醇沉多糖吸湿率最大，达到23.43％。在20℃，RH为43％时，黄芪多糖中保湿率最大的为30％醇沉多糖部分，为36.76％；在RH为81％时，黄芪多糖中80％醇沉多糖保湿率最大，达到98.21％。
方差分析结果显示在RH为43％和81％时，黄芪多糖的吸湿性与甘油均具有明显的统计学差异，黄芪多糖的吸湿性与甘油相比具有一定的差距。在RH为81％时，黄芪多糖具有良好的保湿性。
黄芪作为我国传统的中药材，作为补气良药被广泛应用，黄芪多糖的药理作用及作用机制一直是研究的热点。本申请另辟蹊径，研究黄芪多糖的吸湿和保湿效果，为进一步将黄芪多糖应用到化妆品中提供了理论依据，拓展中药的新用途。
实施例2黄芪多糖成分舒缓功效(斑马鱼急性刺激性实验结果)
在前期保湿性质评价的基础上，本申请人继续参照广州开发区黄埔化妆品产业协会发布的《化妆品安全性实验(斑马鱼)实验方法》标准，对相关中药多糖成分的舒缓功效通过温和刺激性测试给予了评价。
(一)实验方法：化妆品温和刺激性的测定斑马鱼胚法
1本标准规定了评价化妆品温和刺激性的斑马鱼胚实验的方法原理及操作。本标准适用于化妆品(膏霜、乳液、凝胶、精华，等)及化妆品原料(液态水基类、膏霜乳液、凝胶类、可溶性粉剂)的温和刺激性评价。
2化妆品安全技术规范(2015版)QB/T1684-2015化妆品检验规则DB32/T3979-2021实验用斑马鱼饲育技术条件OECD236FishEmbryoAcuteToxicity(FET)Test。
3方法原理
使用24孔细胞培养板，在空白对照或阳性对照控制对照的条件下，将24hpf的斑马鱼胚胎置于不同的样品中，5min内在体式显微镜下观察，根据胚胎对受试样品的温和刺激性反应(温和刺激性反应包括胚胎的刺激摆动、凝结(死亡)情况)，记录好鱼胚刺激摆动(卵黄囊位置的移动)的次数和鱼胚死亡(凝结)数量，用以表征样品的温和刺激性。
4生物模型
4.1成鱼采用性成熟、健康无畸形、产卵量高、产卵质量好的野生型斑马鱼zebrafish(Daniorerio)成鱼(4-18个月)进行产卵。成鱼的体长3-5cm，雄鱼体型修长，柠檬色，腹部扁平。雌鱼体型丰满，腹部膨大、银亮，体色为银灰色。
4.2鱼胚采用处于24hpf时期发育正常的受精卵，实物鉴别参考<化妆品温和刺激性的测定斑马鱼胚法附录A>。
4.3鱼的养殖维护斑马鱼养殖及维护参考<化妆品温和刺激性的测定斑马鱼胚法附录F>。
5材料试剂
5.1材料
5.1.1斑马鱼交配盒。胚胎收集器：100.0mm培养皿。24孔细胞培养板：每孔容积3.5ml。塑料滴管：3.0ml。
5.1.2分析纯试剂：氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl2·2H2O)、硫酸镁(MgSO4·7H2O)。
5.2对照组溶液
5.2.1空白对照组：标准稀释水。标准稀释水配置方法为：精密称取17.2g氯化钠，0.76g氯化钾，4.9g硫酸镁，2.9g氯化钙，用蒸馏水或去离子水溶解并定容至1000ml，得到标准稀释水储备液。取以上标准稀释水储备液16.67ml，再用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml即可。
5.2.2阳性对照组：十二烷基硫酸钠(SDS)标准储备溶液(5.0mg/ml)。
6实验过程
6.1胚胎准备
6.1.1斑马鱼配种时，在产卵盒外缸预先加入2/3容积的养殖水，接着套入带有胚胎分离作用的内缸，插入挡板，隔开雌雄两鱼。于实验前一天晚上选取大于4个月的性成熟的待配种斑马鱼，并按照1:1或1:2的雌雄比置于带有挡板的产卵盒中避光过夜。
6.1.2次日早晨打开光源后抽出产卵盒的挡板，使之交配产卵1h。之后检查各缸成鱼产卵情况，用漏网勺收集胚胎，并用养殖水冲洗从而将胚胎置于培养皿中，平均每个培养皿胚胎数量不超过300枚，然后放入恒温培养箱里孵育。
6.2样品前处理参考斑马鱼胚法附录D化妆品及原料前处理方法。
6.3实验方法
6.3.1实验过程用塑料滴管随机挑选24hpf发育正常的胚胎置于体视显微镜下进行实验(此时的胚胎为体节期)。具体为：在每孔细胞培养板中加入胚胎10-20枚，用塑料吸管吸干养殖水后，每孔加入1.0ml配制好的不同的受试样品液于上述24孔细胞培养板中静置。各浓度组设置3个平行组，同时设置空白对照组或阳性对照组。5min内于体视显微镜下(物镜2-3倍)观察和记录胚胎刺激摆动(卵黄囊位置的移动)及凝结(死亡)的情况。
6.3.2判定标准测试终点和评价指标以胚胎凝结和5min为测试终点，表现形式为：胚胎刺激摆动，凝结(死亡)的任一情形。
6.3.3结果要求鱼胚应位于视频录像画面的正中间，不得损伤鱼胚，使得鱼胚能够正常进行正式实验。
7计算结果
7.1分别记录及计算各组别中每个平行组的胚胎(24hpf)在5min内的累计刺激摆动次数、累计死亡率。其中，累计死亡率％＝累计死亡胚胎数/胚胎总数*100％。
7.2使用统计分析软件(比如GraphPadPrism8)对累计刺激摆动次数和累计死亡率进行统计分析，数值用均值±标准误(Mean±SEM)表示。
8质量控制
试验结果符合下列要求，结果方有效。否则，应查明原因后重新进行试验：
8.1空白对照试验5min时间内，空白对照组斑马鱼胚胎死亡率≤10％。
8.2阳性对照试验5min时间内，阳性对照组斑马鱼胚胎死亡率﹥90％。
9废弃物处置试验将斑马鱼胚于2-8℃冰水中灭活处理后按一般废弃物处置。具有温和刺激性的样品、含有十二烷基硫酸钠(SDS)的废液按危险废物处置。
(二)实验结果
在刺激性测试当中，黄芪各组分多糖对于斑马鱼表现均无刺激性(表12和图4)。
图4为肉苁蓉多糖刺激性实验测试结果(图4中各数值均为三组的平均值)。
在温和刺激性实验当中，通过方差分析，黄芪多糖各糖均无刺激性(表13)。
表12刺激性测试结果(单位：次/分钟)
表13刺激性测试方差分析结果
总结
上述实验结果，结合前期的保湿效果实验，结果表明，黄芪多糖30％、50％和80％醇沉组分在保湿方面有一定的效果，而且主要成分不存在明显的刺激效应，结合黄芪中药材本身在健康保健方面的功效，有继续深入研究的价值。
实施例3黄芪多糖的制备
称取1000g脱脂黄芪粉末适量，加入20g纤维素酶、20g木瓜蛋白酶，然后加入10000g酸水，放入恒温水浴锅内，于54.4℃酶解1.5小时，然后再超声提取，使用纱布过滤，药渣继续加酸水超声第二次和第三次，每次超声提取40min，每次加入酸水10000g，合并滤液，然后离心(9000r/min)取上层清液，浓缩至原体积的十分之一。边搅拌边向浓缩液中滴加95％乙醇，最终至乙醇浓度为85％。静置倒出滤液，将沉淀在水浴锅上挥发至无乙醇味，冷冻干燥得到黄芪多糖粗品。
取冷冻干燥后的黄芪多糖粗品适量，加入适量水溶解，边搅拌边滴加95％乙醇，使乙醇浓度分别达到35％、55％、85％，离心(9000r/min)取沉淀，然后得到35％、55％、85％的黄芪醇沉多糖，将三部分的醇沉多糖在水浴锅上挥发至无乙醇味，冷冻干燥后放至干燥器中保存，干燥剂为变色硅胶。
所述酸水为用柠檬酸将水调节pH至5.2。
上述乙醇浓度均是使用酒精计在常温下测量得到的。
实施例4黄芪多糖的制备
称取1000g脱脂黄芪粉末适量，加入20g纤维素酶、20g木瓜蛋白酶，然后加入10000g酸水，放入恒温水浴锅内，于53.8℃酶解2.5小时，然后再超声提取，使用纱布过滤，药渣继续加酸水超声第二次和第三次，每次超声提取35min，每次加入酸水10000g，合并滤液，然后离心(10000r/min)取上层清液，浓缩至原体积的十分之一。边搅拌边向浓缩液中滴加98％乙醇，最终至乙醇浓度为82％。静置倒出滤液，将沉淀在水浴锅上挥发至无乙醇味，冷冻干燥得到黄芪多糖粗品。
取冷冻干燥后的黄芪多糖粗品适量，加入适量水溶解，边搅拌边滴加95％乙醇，使乙醇浓度分别达到30％、55％、80％，离心(10000r/min)取沉淀，然后得到30％、55％、80％的黄芪醇沉多糖，将三部分的醇沉多糖在水浴锅上挥发至无乙醇味，冷冻干燥后放至干燥器中保存，干燥剂为变色硅胶。
所述酸水为用柠檬酸将水调节pH至5.2。
上述乙醇浓度均是使用酒精计在常温下测量得到的。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施案例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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