一种绣球菌胞外多糖醇溶液的制备方法
阅读说明：本技术 一种绣球菌胞外多糖醇溶液的制备方法 (Preparation method of Sparassis crispa extracellular polysaccharide alcohol solution ) 是由 韩丹 杨盼盼 吕旭阳 陈金龙 蒋丽刚 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种绣球菌胞外多糖醇溶液的制备方法,其特征在于采用以下步骤：A、将绣球菌子实体机械粉碎成绣球菌粉末；B、将10～20%的绣球菌粉末、10～20%的甜菜碱、20～40%的多元醇、余量为水,混合后搅拌均匀,得预混物；C、将预混物置于双极性方波高压脉冲电场中进行处理,得待提取混合液；D、将待提取混合液投入反应釜中加热搅拌,加热温度为60-80℃,保温搅拌1～3h后进行抽滤,得绣球菌多糖粗溶液；E、将绣球菌胞外多糖粗溶液与Sevage试剂按照体积比4：1进行混合,搅拌15min后进行离心,取上清液浓缩,得绣球菌胞外多糖醇溶液。本发明绣球菌胞外多糖醇溶液的制备方法具有多糖提取率高的优点。(The invention relates to a preparation method of an Sparassis crispa extracellular polysaccharide alcoholic solution, which is characterized by comprising the following steps of: A. mechanically pulverizing Sparassis crispa fruiting body into Sparassis crispa powder; B. mixing 10-20% of sparassis crispa powder, 10-20% of betaine, 20-40% of polyol and the balance of water, and uniformly stirring to obtain a premix; C. placing the premix in a bipolar square wave high-voltage pulse electric field for treatment to obtain a mixed solution to be extracted; D. putting the mixed solution to be extracted into a reaction kettle, heating and stirring at the temperature of 60-80 ℃, keeping the temperature, stirring for 1-3 hours, and then performing suction filtration to obtain a crude Sparassis crispa polysaccharide solution; E. mixing the crude sparassis crispa exopolysaccharide solution with a Sevage reagent according to a volume ratio of 4: 1, stirring for 15min, centrifuging, and concentrating the supernatant to obtain the extracellular polysaccharide alcoholic solution of Sparassis crispa. The preparation method of the Sparassis crispa extracellular polysaccharide alcoholic solution has the advantage of high polysaccharide extraction rate.)
技术领域
本发明涉及化妆品制备技术领域，特别涉及一种绣球菌胞外多糖醇溶液的制备方法。
背景技术
绣球菌(Sparassis Crispa)是一种珍贵的药食两用真菌，享“万菇之王”之美誉，有效成分主要有蛋白质、多糖、麦角固醇、葡糖苷酰鞘氨醇、腺苷和其他一些小分子化合物等；绣球菌中含有大量β-葡聚糖、抗氧化物质、维生素和矿物质，其超氧化物歧化酶和维生素E的含量居菌藻类食物前列，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗高血压、抗糖尿病等多种药理活性。绣球菌中主要的活性物质为多糖，尤以绣球菌β-葡聚糖含量最高。天然的β-葡聚糖主要有2种存在形式：一种是β-(1→3)-葡聚糖，另一种是β-(1→6)-葡聚糖。其中β-(1→ 3)-葡聚糖具有广泛的生物学活性，存在的结构形式为β-(1→3)糖苷键链接的线性主链并带有β-(1→6)糖苷键链接的分支结构。目前对β-(1→3)-葡聚糖生物活性研究和应用较多，包括免疫药理学活性、造血功能等，广泛应用于化妆品、保健品等领域。绣球菌中β-葡聚糖的含量很高，据日本东京实验研究实验室的检测结果，可高达干重的43.6％，Kim等实验测定绣球菌水提物中β-葡聚糖含量为39.3％；廉添添等测定绣球菌柄部和瓣片部分中β-葡聚糖含量达40％以上。
中国专利文献CN104448014A公开了一种绣球菌碱溶多糖的提取方法，采用碱提取法，选用氢氧化钠、乙醇/乙醚、糖液/三氯乙酸、乙醇多次提取得到绣球菌多糖。但该发明使用多种溶剂，步骤繁琐，利用率低，原料损耗较大，仍需改进；中国专利文献CN104958314A公开了一种具有神经保护作用的绣球菌SC031多糖提取物的制备方法，先将绣球菌伞菌粉进行发酵、离心、沉淀冻干得到绣球菌伞菌粉，再用热水提取回收的绣球菌多糖，该发明采用冻溶法，采用反复冷冻与融化的过程使细胞破裂，活性成分析出，但该发明需要进行反复冷冻，生产耗时较长，存在细胞难以破裂的风险，且后期使用热水提取效率较低；中国专利文献CN106188333A公开了一种绣球菌多糖的提取方法。该发明采用超声波热水提取法，再通过超滤膜分离纯化得到绣球菌多糖，存在难以大规模工业化生产等问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种绣球菌胞外多糖醇溶液的制备方法，该方法提取率高，制备的绣球菌胞外多糖醇溶液具有能促进皮肤益生菌增殖，提高皮肤免疫力的作用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种绣球菌胞外多糖醇溶液的制备方法，其特征在于采用以下步骤：
A、将绣球菌子实体机械粉碎，过80目筛，得绣球菌粉末；
B、按如下质量比称取10~20%的绣球菌粉末、10~20%的甜菜碱、20~40%的多元醇、余量为水，混合后搅拌均匀，得预混物；所述多元醇为甘油、丁二醇、丙二醇、木糖醇中的一种或他们任意比的混合物；
C、将步骤B所得预混物置于双极性方波高压脉冲电场中进行处理，处理条件为：脉冲电场强度为15-60kv/cm ,频率为100-800Hz，处理时间为20min，处理完成得待提取混合液；
D、将步骤C所得待提取混合液投入反应釜中加热搅拌，控制搅拌速度为300-600r/min，加热温度为60-80℃，保温搅拌1~3h后进行抽滤，收集过滤后的溶液即为绣球菌多糖粗溶液；
E、将步骤D所得绣球菌胞外多糖粗溶液与Sevage试剂按照体积比4：1进行混合，搅拌15min 后进行离心，离心转速为4000r/min，离心时间10min，取上清液浓缩，得绣球菌胞外多糖醇溶液。
本发明所述绣球菌购于福建容益菌业科技研发有限公司。
本发明所述甜菜碱购于DANISCO公司，INCI为甜菜碱，在中国《已使用化妆品原料名称目录（2015版）》中序号为06665；本发明所述的甘油采购于嘉里油脂有限公司，INCI名称为甘油，在中国《已使用化妆品原料名称目录（2015版）》中序号为02421；所述丁二醇采购于日本协和公司，INCI名称1，2-丁二醇，在中国《已使用化妆品原料名称目录（2015版）》中序号为00003；所述丙二醇采购于中国壳牌有限公司， INCI名称为丙二醇，在中国《已使用化妆品原料名称目录（2015版）》中序号为00006；所述木糖醇采购于浙江华康药业股份有限公司， INCI名称为木糖醇，在中国《已使用化妆品原料名称目录（2015版）》中序号为04786。
本发明所述双极性方波高压脉冲电场采用美国俄亥俄州立大学的OSU-4L 型高压脉冲电场，该电场是一种连续的流动性的处理式装置，由脉冲电源、数字示波器和样品处理室3 部分构成。
本发明采用高压脉冲电场结合天然低共熔溶剂制备绣球菌胞外多糖醇溶液，高压脉冲电场可有效地破坏绣球菌细胞，有利于绣球菌多糖的释放，溶于溶剂中，提高多糖的提取效率。同时采用高压脉冲电场会导致部分高分子量多糖组分被破坏，降低其相对分子质量，增强其生物活性。本发明采用合适的天然低共熔溶剂可通过提供或接受外部电子或质子行成氢键来提高多糖的溶解率，从而提高多糖在溶剂中的提取效率。
绣球菌胞外多糖传统方法（采用热水、碱溶液提取等）的提取率一般为10.5~22.3%。而本发明采用高压脉冲电场结合特定的天然低共熔溶剂制备的绣球菌胞外多糖醇溶液中多糖提取率则不低于26.0%，显著提高了绣球菌胞外多糖的提取率。
本发明选用特定的甜菜碱和多元醇，但并未提前制备天然低共熔溶剂，而是在提取过程中同步制备，步骤D加热搅拌的过程中，甜菜碱和多元醇形成天然低共熔溶剂的同时提取绣球菌多糖，有效简化步骤和减少能源损耗。
本发明采用的甜菜碱、多元醇，原料来源天然，选用甜菜碱作为天然低共熔溶剂氢键受体，甘油、丁二醇、丙二醇、木糖醇中的任意一种为天然低共熔溶剂氢键供体制备。其中甜菜碱具有保湿、抗氧化、提高皮肤适应环境能力的作用，甘油、丁二醇、丙二醇、木糖醇则具有优异的补水保湿锁水的功效，采用此方法既可提高绣球菌胞外多糖的提取效率，又减少了后续的纯化过程，所得绣球菌胞外多糖醇溶液可以直接添加到化妆品中使用。
本发明制备的绣球菌胞外多糖醇溶液具有保湿，调节皮肤免疫的效果。该多糖溶液为液态，可直接加入护肤品中，安全性好，稳定性高。
为验证实施例1所得本发明制备的绣球菌胞外多糖醇溶液具有多糖提取率，且具有调节皮肤免疫的作用，本发明进行了以下测试。
1、实施例1所制备的绣球菌胞外多糖醇溶液中绣球菌多糖的测定和提取率的计算。
本发明采用苯酚-硫酸法测定绣球菌胞外多糖提取率。苯酚-硫酸法指浓硫酸水解多糖或寡糖为单糖，并使得单糖迅速脱水为糠醛衍生物，强酸条件下糠醛衍生物可与苯酚发生显色反应， 生成的橙黄色物质在490nm处有最大吸收值。由于吸光值与多糖浓度在一定浓度范围内成线性关系，故可用比色法测定多糖含量。
称取100mg葡萄糖,加蒸馏水溶解,转移至1000mL容量瓶定容至刻度， 配成100μg/mL葡萄糖标准溶液。分别取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL于试管中,用蒸馏水补至2.0mL，依次加入5%苯酚溶液1.0mL，然后迅速加入浓硫酸溶液5.0mL， 静置10min后摇匀， 待其冷却后测定其在490nm处的吸光值,以蒸馏水作空白对照。绘制以浓度为横坐标、以吸光值为纵坐标而成的标准曲线即为葡萄糖标准曲线。经线性回归，多糖的线性方程为：Y=9.96X +0.58。
绣球菌胞外多糖醇溶液中加入4倍100%乙醇，静置离心后收集沉淀，再经丙酮、乙醇洗涤后用得绣球菌多糖。将绣球菌多糖用蒸馏水复溶，加水定容至250mL并经过适当稀释后采用苯酚-硫酸法进行测定，得到的吸光度值代入葡萄糖标准曲线中，换算成葡萄糖质量，以葡萄糖计多糖提取率。
多糖提取率=换算得到的葡萄糖质量/绣球菌干粉的质量*100%
样品1为按实施例1方法所制的绣球菌胞外多糖醇溶液，样品2为未使用高压脉冲电场，仅使用天然低共熔溶剂法所制的绣球菌胞外多糖醇溶液，样品3为使用高压脉冲电场，未使用天然低共熔溶剂而使用蒸馏水提取绣球菌多糖所得样品。
分别测定计算样品1的多糖提取率为26.6%，样品2的多糖提取率为20.2%，样品3的多糖提取率为14.2%。证明采用高压脉冲电场辅助天然低共熔溶剂法制备绣球菌多糖醇溶液的胞外多糖提取率高。
2、实施例1中所得绣球菌胞外多糖醇溶液对皮肤有益菌的生长增殖影响测试
本发明中制备的绣球菌胞外多糖醇溶液对两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及婴儿双歧杆菌的生长增殖有促进作用，以实施例1中制备的产品为例，实验如下：
在MRS培养基中分别添加0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%质量分数的绣球菌胞外多糖醇溶液，再依此接种1.0%的活化好的4种菌株（此时浓度为98CFU/mL），每组3个平行实验，38℃条件下培养24h，利用紫外可见分光光度计测定波长600nm处各培养液的吸光度值（OD600nm）。所用两歧双歧杆菌菌种编号CICC 8061，青春双歧杆菌菌种编号CICC 8060，嗜酸乳杆菌菌种编号CICC8063，婴儿双歧杆菌菌种编号CICC 8066，均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；所用MRS培养基购于青岛海博生物技术有限公司；所用紫外可见分光光度计购于尤尼柯（上海）仪器有限公司，型号UV-2100PC。
四种菌在不同浓度绣球菌胞外多糖醇溶液培养液中OD600nm值列于表1。
表1：四种菌在不同浓度绣球菌胞外多糖醇溶液培养液中的OD600nm值
培养液中的绣球菌多糖醇溶液质量分数
0%
1.0%
2.0%
3.0%
4.0%
两歧双歧杆菌
0.02
0.26
0.47
0.72
0.98
青春双歧杆菌
0.03
0.24
0.42
0.80
1.05
嗜酸乳杆菌
0.05
0.18
0.57
0.65
0.72
婴儿双歧杆菌
0.04
0.42
0.55
0.62
0.68
由表1可知，随着绣球菌胞外多糖醇溶液添加量的增加，典型皮肤益生菌两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及婴儿双歧杆菌的生长均表现为增长的趋势。实验结果可以表明该多糖对益生菌的生长增殖起到很好的促进作用。
3. 实施例1中所得绣球菌胞外多糖醇溶液在提高皮肤免疫力方面的验证实验。
本发明还通过绣球菌胞外多糖醇溶液对最接近于人类SLE的动物模型-自发性SLE模型雌性小鼠NZBWF1/J表皮朗格汉斯细胞密度的影响来表征其在提高皮肤免疫力方面的作用，以实施例1中制备的产品为例，实验如下：
将12只2月龄NZBWF1/J雌性小鼠分为地塞米松组6只，地塞米松1.0mg/kg每日腹腔内注射；绣球菌胞外多糖6只，绣球菌胞外多糖醇溶液3.0mg/kg 每日腹腔内注射，从小鼠2月龄开始连续用药6组个月至小鼠8月龄；SPF级C57BL/6纯系雌性小鼠6只，8月龄作为空白对照组。
小鼠乙醚全麻下剪取同一部位小鼠耳部，利用解剖显微镜将耳两侧皮肤分开，刮除两侧软骨，放入pH7 .2的生物EDTA分离液中，38℃恒温下浸泡2h，显微镜下分离真表皮，表皮固定于4℃丙酮中20min，用PBS磷酸缓冲液冲洗3次，每次3min。分别加入浓度为1:50的抗小鼠Ia抗原OX3、1:200的抗小鼠Ia抗原OX4及小鼠表皮于eppendorf 微型管中，4℃过夜，PBS冲洗，加入生物素化的羊抗鼠IgG血清，38℃孵育2h，PBS冲洗，加ABC（卵白素/生物素/酶）复合物，孵育1h后PBS冲洗。解剖显微镜下，将表皮平铺于载玻片上，加底物3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）室温显色干燥后，甘油明胶封片。
在显微镜下观察，出现橘红色星形细胞即为阳性。表皮朗格汉斯细胞密度（LC/mm2）=每视野平均LC数/表皮面积，表皮面积通过测微尺标定的目镜方格测定。各实验组小鼠表皮LC密度数据列于表2。所用自发性SLE模型雌性小鼠NZBWF1/J购于南京大学-南京生物医药研究院；所用SPF级C57BL/6纯系小鼠，雌性，8月龄，购于广东省医学实验动物中心；解剖显微镜购于深圳市博视达光学仪器有限公司，型号BD-60T。
表2 各实验组小鼠表皮LC密度均值表（LC/mm2）
抗原
OX3
OX4
地塞米松组
208±57
254±33
绣球菌胞外多糖组
572±38
482±42
C57BL/6纯系（空白对照）
340±52
302±35
由表2可知，与地塞米松组小鼠NZBWF1/J相比，绣球菌胞外多糖组小鼠NZBWF1/J表皮LC密度明显增高，可能是由于绣球菌胞外多糖促进GM-CSF的生成，同时刺激未成熟的粒细胞、巨噬细胞分化成熟，提高机体的免疫功能，地塞米松作为免疫抑制剂广泛应用于人类及动物自身免疫性疾病的治疗与研究；与C57BL/6纯系小鼠相比，胞外多糖小鼠NZBWF1/J表皮LC密度也有显著增长。
实验证明，绣球菌胞外多糖醇溶液可促进皮肤朗格汉斯细胞密度的提高，从而可提升肌肤免疫力，提升肌肤体质。
综上所述，本发明绣球菌胞外多糖醇溶液的制备方法具有多糖提取率高的优点，且制备出的绣球菌胞外多糖醇溶液具有促进皮肤益生菌增殖，提高皮肤免疫力的作用。
具体实施方式
实施例1：一种绣球菌胞外多糖醇溶液的制备方法，其特征在于采用以下步骤：
A、将绣球菌子实体机械粉碎，过80目筛，得绣球菌粉末；
B、按如下质量比称取20%的绣球菌粉末、20%的甜菜碱、40%的多元醇，余量为水，混合后搅拌均匀，得预混物；所述多元醇为甘油、丁二醇、丙二醇、木糖醇中的一种或他们任意比的混合物；
C、将步骤B所得预混物置于双极性方波高压脉冲电场中进行处理，处理条件为：脉冲电场强度60kv/cm，频率800Hz，处理时间20min，处理完成得提取液；
D、将步骤C所得提取液投入反应釜中加热搅拌，搅拌速度为600r/min，温度为80℃，保温搅拌3h，然后进行抽滤，收集过滤后的滤液，得绣球菌胞外多糖粗溶液；
E、将步骤D所得绣球菌胞外多糖粗溶液与Sevage试剂按照体积比4：1进行混合，搅拌15min 后进行离心，离心转速为4000r/min，离心时间10min，取上清液浓缩，得绣球菌胞外多糖醇溶液。Sevage试剂为体积比5：1的氯仿：正丁醇混合物。本实施例采用的绣球菌采购自福建容益菌业科技研发有限公司。
实施例2：一种绣球菌胞外多糖的制备方法，其特征在于采用以下步骤：
A、将绣球菌子实体机械粉碎，过80目筛，得绣球菌粉末；
B、按如下质量比称取10%的绣球菌粉末、10%的甜菜碱、20%的多元醇，余量为水，混合后搅拌均匀，得预混物；所述多元醇为甘油、丁二醇、丙二醇、木糖醇中的一种或他们任意比的混合物；
C、将步骤B所得预混物置于双极性方波高压脉冲电场中进行处理，处理条件为：脉冲电场强度15kv/cm，频率100Hz，处理时间20min，处理完成得提取液；
D、将步骤C所得提取液投入反应釜中加热搅拌，搅拌速度为300r/min，温度为60℃，保温搅拌1h，然后进行抽滤，收集过滤后的滤液，得绣球菌胞外多糖粗溶液；
E、将步骤D所得绣球菌胞外多糖粗溶液与Sevage试剂按照体积比4：1进行混合，搅拌15min 后进行离心，离心转速为4000r/min，离心时间10min，取上清液浓缩，得绣球菌胞外多糖醇溶液。Sevage试剂为体积比5：1的氯仿：正丁醇混合物。本实施例采用的绣球菌采购自福建容益菌业科技研发有限公司。
实施例3：一种绣球菌胞外多糖的制备方法，其特征在于采用以下步骤：
A、将绣球菌子实体机械粉碎，过80目筛，得绣球菌粉末；
B、按如下质量比称取15%的绣球菌粉末、15%的甜菜碱、30%的多元醇，余量为水，混合后搅拌均匀，得预混物；所述多元醇为甘油、丁二醇、丙二醇、木糖醇中的一种或他们任意比的混合物；
C、将步骤B所得预混物置于双极性方波高压脉冲电场中进行处理，处理条件为：脉冲电场强度40kv/cm，频率400Hz，处理时间20min，处理完成得提取液；
D、将步骤C所得提取液投入反应釜中加热搅拌，搅拌速度为450r/min，温度为70℃，保温搅拌1~3h，然后进行抽滤，收集过滤后的滤液，得绣球菌胞外多糖粗溶液；
E、将步骤D所得绣球菌胞外多糖粗溶液与Sevage试剂按照体积比4：1进行混合，搅拌15min 后进行离心，离心转速为4000r/min，离心时间10min，取上清液浓缩，得绣球菌胞外多糖醇溶液。Sevage试剂为体积比5：1的氯仿：正丁醇混合物。本实施例采用的绣球菌采购自福建容益菌业科技研发有限公司。