表面展示碳酸酐酶的重组工程菌及其构建方法与应用
阅读说明：本技术 表面展示碳酸酐酶的重组工程菌及其构建方法与应用 (Recombinant engineering bacterium for displaying carbonic anhydrase on surface as well as construction method and application thereof ) 是由 贾晓强 朱银壮 刘亚茹 于 2021-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及表面展示碳酸酐酶的重组工程菌及其构建方法与应用。包括构建基于冰核蛋白的表面展示碳酸酐酶的重组工程菌,将碳酸酐酶重组工程菌接种到培养基中振荡培养,加入IPTG和ZnSO-(4)诱导碳酸酐酶的表达,收集的表面展示碳酸酐酶重组菌制备全细胞催化剂,并用于CO-(2)矿化沉积CaCO-(3)。避免了常规表达胞内酶存在外膜屏障导致催化效率低等缺陷,将酶展示到细胞表面,既保留了细胞内酶的代谢潜能,又让酶底物和酶促反应产物不需要穿过膜屏障可以与酶直接接触,降低底物和产物传质阻力,提高全细胞催化剂酶活力。本发明制备酶活力更高、更加稳定新型全细胞生物催化剂有望实现CO-(2)矿化沉积CaCO-(3)以捕集CO-(2),为工业应用奠定基础。(The invention relates to a recombinant engineering bacterium for displaying carbonic anhydrase on the surface, a construction method and application thereof. Comprises constructing recombinant engineering bacteria of surface display carbonic anhydrase based on ice nucleoprotein, inoculating the recombinant engineering bacteria of carbonic anhydrase into culture medium, shake culturing, adding IPTG and ZnSO 4 Inducing expression of carbonic anhydrase, collecting recombinant bacteria with surface display carbonic anhydrase to prepare whole-cell catalyst, and using the whole-cell catalyst in CO 2 Mineralizing deposited CaCO 3 . Avoids the defects of low catalytic efficiency and the like caused by the outer membrane barrier existing in the conventional expression intracellular enzyme, displays the enzyme on the cell surface, and not only ensures the stabilityThe metabolic potential of enzyme in the cell is reserved, and the enzyme substrate and the enzymatic reaction product can directly contact with the enzyme without penetrating through a membrane barrier, so that the mass transfer resistance of the substrate and the product is reduced, and the enzyme activity of the whole-cell catalyst is improved. The novel whole-cell biocatalyst prepared by the invention has higher enzyme activity and is more stable, and CO is expected to be realized 2 Mineralizing deposited CaCO 3 To capture CO 2 And lays a foundation for industrial application.)
技术领域
本发明涉及表面展示碳酸酐酶的重组工程菌及其构建方法与应用，属于分子生物学与生物技术领域。
背景技术
二氧化碳(CO2)是导致气候变化的主要温室气体[1]。自工业革命以来，由于化石燃料的使用和大规模的工业生产，大量CO2排放引起的全球气候变化已引起人们的极大关注。CO2浓度的不断提高，已经引起了全球变暖并影响了环境和人类健康。当前，研究和开发经济、安全、高效的CO2捕集、利用和储存技术(CCUS)已经成为全世界的热点[2]。工业上用于捕获CO2的传统方法主要有吸收法、吸附法、低温冷凝法、膜分离技术。上述方法存在工艺复杂、能源消耗大、会生成副产物对环境造成二次污染等问题。利用碳酸酐酶(CA)捕集CO2是目前最具前景的CO2捕获与利用技术手段之一[3]，其终产物CaCO3在整个地质学周期内性质非常稳定，且对环境友好。但由于纯酶纯化成本高、稳定性差、易失活且无法回收再利用，细胞内酶系统存在外膜屏障催化效率低等缺点使其应用受到了限制。因此，通过基因工程手段将CA展示到细胞表面，构建新型的全细胞生物催化剂有望解决目前存在的问题。
微生物细胞表面展示(Cell surface display)是利用基因工程手段将某一蛋白或短肽(靶蛋白)与微生物细胞的外膜蛋白(载体蛋白)以融合蛋白的形式锚定在微生物细胞表面的技术。大肠杆菌已成为使用最广泛的宿主，这主要是由于其完善的遗传系统以及实现全长重组蛋白的高密度表面展示的能力。大肠杆菌细胞表面展示是通过将靶蛋白(乘客蛋白)与锚定在外膜中的天然表面蛋白(载体蛋白)融合后，载体蛋白结合引导靶蛋白通过大肠杆菌内膜和周质的运输，稳定地锚定在细胞外膜上。载体蛋白的性质决定了靶蛋白的方向(即，N-或C-末端融合)和限制了所展示的靶蛋白的分子质量大小。基于冰核蛋白(INP)的表面展示系统能够实现较高的表面展示水平[4]，INP由N端功能域、中间重复序列和C端功能域三个功能域组成，其中相较于其他两个功能域，利用INP-N为载体展示的靶蛋白在单个细胞上的表达量最多，且细胞的酶活最高[5]。此外，INP的中间重复序列是高度简并的区域，该区域可用作可扩展的连接子，以实现在距细胞表面不同距离处展示靶蛋白。
大肠杆菌是生产重组蛋白和作为表达平台的宿主细胞中最重要和最受欢迎的选择之一[6,7]。通过重组大肠杆菌生产碳酸酐酶是增加蛋白质产量的有益且有效的选择[8]。目前，大肠杆菌胞内表达CA的技术已经非常成熟，但其在实际应用中由于其催化效率低、不稳定仍存在较大缺陷。虽然理论上CO2和HCO3-属于小分子物质，可以自由进出细胞，但是由于细胞膜的阻力作用依然会在很大程度上限制胞内CA与底物的接触，同时也会限制产物的及时排出，进而降低了CA的催化效率。因此，如果将酶展示到细胞表面，既保留了细胞内酶的代谢潜能，又可以让酶底物和酶促反应产物都不需要穿过膜屏障就可以与酶直接接触，降低了底物和产物的传质阻力，提高了全细胞催化剂的酶活力。目前，对于碳酸酐酶表面展示的研究还比较少，并且在已经报道的研究中，表面展示工程菌的全细胞催化活力还都较低，主要原因在于所表达碳酸酐酶自身催化活性较低且酶学性质不稳定。因此，利用多种表达载体以不同融合方式将具有高催化活性的碳酸酐酶展示到细胞表面构建表面展示碳酸酐酶重组工程菌，可制备酶活力更高、更加稳定的新型全细胞生物催化剂有望实现CO2矿化沉积CaCO3以捕集CO2，为工业应用奠定基础。
[1]Anderson T R,Hawkins E,Jones P D.CO2,the greenhouse effect andglobal warming:from the pioneering work of Arrhenius and Callendar to today'sEarth System Models[J].Endeavour,2016,40(3):178-187.
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[3]De Simone G,Fiore A D,Capasso C,et al.The zinc coordinationpattern in theη-carbonic anhydrase from plasmodium falciparum is differentfrom all other carbonic anhydrase genetic families[J].Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters,2015,25(7):1385-1389.
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发明内容
鉴于上述，本发明提出一种表面展示碳酸酐酶的重组工程菌及其构建方法与应用，并验证其可行性，具体技术如下：
本发明表面展示碳酸酐酶的重组工程菌的构建方法；包括如下步骤：
(1)通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增编码冰核蛋白N端结构域(INPN)和碳酸酐酶(CA)的核苷酸序列；
(2)将INPN与CA通过酶切连接的方式进行融合，将融合后的CA表面展示模块以酶切连接的方式克隆至表达载体上，构建重组表达载体；
(3)将重组表达载体转化导入宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，通过菌落PCR或提取质粒后酶切筛选阳性重组菌，获得表面展示碳酸酐酶的重组工程菌。
步骤(1)中碳酸酐酶选自Helicobacter pylori 26695的α型碳酸酐酶(HPCA)或Sulfurihydrogenibium azorense的α型碳酸酐酶(SazCA)。
步骤(1)中编码冰核蛋白N端结构域(INPN)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；碳酸酐酶(HPCA)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；碳酸酐酶(SazCA)的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
步骤(2)中融合方式包括：
INPN与CA之间由冰核蛋白中间重复域中前端两个亚重复序列(RE)连接，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
INPN与CA之间由连接子(Flexible Linker，GGGGS)连接；
INPN与CA之间由冰核蛋白的中间重复域中的前端两个亚重复序列和连接子进行融合连接；
优选为INPN与CA之间由冰核蛋白的中间重复域中的前端两个亚重复序列和连接子进行融合连接。
步骤(2)中表达载体包括：质粒pET-28a、融合有助溶蛋白TrxA的pET-32a和融合有PelB信号肽的pET-22b，优选为融合有PelB信号肽的pET-22b。
通过上述构建方法构建得到的表面展示碳酸酐酶的重组工程菌，包括HPCA表面展示工程菌：E-28a-ILH，所含重组质粒p28a-ILH的核苷酸序列为SEQ ID No.5；E-28a-IRH，所含重组质粒p28a-IRH的核苷酸序列为SEQ ID No.6；E-28a-IRLH，所含重组质粒p28a-IRLH的核苷酸序列为SEQ ID No.7和SazCA表面展示工程菌：E-28a-IRLS，所含重组质粒p28a-IRLS的核苷酸序列为SEQ ID No.8；E-22b-IRLS，所含重组质粒p22b-IRLS的核苷酸序列为SEQ IDNo.9；E-32a-IRLS，所含重组质粒p32a-IRLS的核苷酸序列为SEQ ID No.10。
表面展示碳酸酐酶重组工程菌制备全细胞催化剂，其制备步骤如下：
(1)将获得的表面展示碳酸酐酶的重组工程菌接种到LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养以活化菌体，获得种子液；
(2)将种子液以1-3％接种量转接到新的LB培养基中，培养温度30-37℃，转速200-220rpm，振荡培养至OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.2-1.0mM IPTG诱导剂和终浓度为0.0-2.0mM ZnSO4诱导剂后，于15-37℃继续培养6-60h诱导碳酸酐酶表达。
(3)将诱导完成后的菌液在冷冻离心机中，4-8℃，6000-9000rpm离心7-10min收集菌体，用去离子水至少洗涤两次，用Tris-HCl缓冲液至少洗涤两次后，将菌体悬浮于5-15mLTris-HCl缓冲液中得到全细胞催化剂样品。
利用表面展示碳酸酐酶重组工程菌制备得到的全细胞催化剂，相较于游离碳酸酐酶，表面展示碳酸酐酶全细胞催化剂的热稳定性、pH稳定性和长期储存稳定性均有所提高。
本发明所构建表面展示碳酸酐酶的重组工程菌的应用，利用表面展示碳酸酐酶的重组工程菌用于CO2矿化催化CaCO3沉淀生成。表面展示碳酸酐酶重组工程菌生成CaCO3沉淀241mg大于胞内表达碳酸酐酶菌株生成的173mg。在相同时间内表面展示菌株催化产生的CaCO3的量大于胞内表达菌株E-22b-S，说明将SazCA锚定在细胞外膜上，提高了全细胞催化剂的酶活力，从而提高了催化CaCO3沉积的速率。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明利用表面展示技术，利用INPN将碳酸酐酶展示到大肠杆菌细胞表面，获得了表面展示碳酸酐酶的重组工程菌，解决了碳酸酐酶纯酶纯化成本高、稳定性差、易失活且无法回收再利用等限制。
(2)本发明所构建表面展示碳酸酐酶的重组工程菌，与重组表达胞内酶相比，酶底物或酶促反应产物都不需要穿过膜屏障就可以与酶直接接触，降低了底物和产物的传质阻力，提高了全细胞催化酶活力。
(3)本发明将碳酸酐酶锚定在细胞表面，省去了酶的准备和纯化步骤，降低了应用成本，并且细胞膜可以起到固定化酶的效果，使酶的各项性能更加稳定。本发明为制备高表观活力碳酸酐酶全细胞生物催化剂提供了一种低成本、简便方法。
(4)利用本发明所构建表面展示碳酸酐酶的重组工程菌用于CO2矿化沉积CaCO3，用于实际CO2的捕集，重组工程菌相较于游离酶稳定性较好，且可有效催化CO2水合转化为CaCO3沉淀，为表面展示全细胞生物催化剂的工业化应用奠定了基础。
附图说明
图1不同融合方式表面展示HPCA表达载体构建流程图
图2重组质粒p28a-ILH、p28a-IRH和p28a-IRLH图谱
图3胞内表达与表面展示SazCA表达载体构建流程图
图4重组质粒p28a-S、p22b-S、p32a-S、p28a-IRLS、p22b-IRLS和p32a-IRLS图谱
图5碳酸酐酶表面展示菌株的细胞质，细胞内膜和细胞外膜组分的免疫印迹分析
图6不同诱导温度对碳酸酐酶表面展示菌株和胞内表达菌株全细胞酶活性的影响
图7不同ZnSO4浓度对碳酸酐酶表面展示菌株和胞内表达菌株全细胞酶活性的影响
图8不同IPTG浓度对碳酸酐酶表面展示菌株和胞内表达菌株全细胞酶活性的影响
图9不同诱导时间对碳酸酐酶表面展示菌株和胞内表达菌株全细胞酶活性的影响
图10重组碳酸酐酶全细胞催化剂与游离碳酸酐酶的热稳定性示意图
图11重组碳酸酐酶全细胞催化剂与游离碳酸酐酶的pH稳定性示意图
图12重组碳酸酐酶全细胞催化剂与游离碳酸酐酶的长期稳定性示意图
图13表面展示碳酸酐酶重组工程菌用于CO2矿化催化CaCO3沉积量
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明做进一步详细说明:
本发明以下实施例中使用的培养基配方与溶液配方如下：
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，NaCl 10.0，酵母浸粉5.0，pH 7.0-7.2。
100mM IPTG溶液：1.1915g IPTG溶于48mL水中，容量瓶中定容至50mL，于超净工作台中通过0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，-20℃保存。
100mM ZnSO4溶液：1.4378g ZnSO4溶于48mL超纯水中，容量瓶中定容至50mL，于超净工作台中通过0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，-20℃保存。
Tris-HCl(pH＝8.3)缓冲溶液：2.4228g Tris溶于980ml去离子水中，用盐酸调节pH至8.3，容量瓶中定容至1L，于4℃保存。
PBS(pH＝7.4)缓冲溶液：0.272g KH2PO4，1.136g Na2HPO4，10.676g NaCl，0.295gKCl，溶于980mL去离子水中，容量瓶中定容至1L，于4℃保存。
饱和CO2水溶液：在螺口瓶中加入一定量的去离子水，然后用带孔胶塞封住瓶口，将与CO2气体罐相连的橡胶管的一头从胶塞的孔中放入液体底部，始终将螺口瓶离置于冰水浴中，持续通入CO2气体1h以上，用pH计测量液体pH达到3.89，即配即用。
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4～6)：首先分别配置0.1M的柠檬酸和柠檬酸钠母液，准确称取21.01g柠檬酸溶解于980ml去离子水中后容量瓶中定容至1L获得母液Ⅰ，准确称取29.41g柠檬酸钠溶解于980ml去离子水中后容量瓶中定容至1L获得母液Ⅱ。准确量取13.1mL母液Ⅰ与6.9mL母液Ⅱ混匀后即为pH＝4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；准确量取8.2mL柠檬酸母液与11.8mL母液Ⅱ混匀后即为pH＝5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；准确量取3.8mL柠檬酸母液与16.2mL母液Ⅱ混匀后即为pH＝6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。于4℃冰箱保存。
Tris-HCl(pH＝7～9):准确称取三份2.4228g Tris，分别溶于980mL去离子水中后用盐酸调节pH至7、8、9，容量瓶中定容至1L，于4℃保存。
0.02M甘氨酸-NaOH缓冲液(10～12)：准确称取三份1.5015g甘氨酸，Tris，溶于980mL去离子水中，用NaOH调节pH至10、11、12，定容至1L，于4℃保存。
4wt％CaCl2溶液：称取4g CaCl2，加入到96g Tris-HCl(pH＝8.3)缓冲液中溶解。
本发明的实施例中使用的引物及相关测序服务均有北京擎科生物科技有限公司提供；涉及的质粒提取、PCR产物纯化、琼脂糖凝胶回收等操作均按照博迈德生物技术有限公司提供的对应试剂盒进行；所有使用的限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自ThermoFisher公司。
实施例1大肠杆菌以不同融合方式表面展示来源于Helicobacter pylori 26695的α型碳酸酐酶(HPCA)重组工程菌的构建
大肠杆菌表面展示来源于Helicobacter pylori 26695的α型碳酸酐酶(HPCA)重组质粒的构建流程如图1所示，以不同融合方式构建表面展示HPCA重组质粒载体。具体步骤如下：
(1)PCR扩增目的基因片段
大肠杆菌表面展示HPCA相关基因片段扩增：以质粒p2-inak为模板，上游引物为NcoI-INPN-F，下游引物为H-lin-INPN-R，利用高保真聚合酶扩增得到引入酶切位点的SEQID NO.1所示冰晶核蛋白N端序列INPN，并去除INPN的终止密码子，在其后引入柔性连接肽FL(GGGGS)。以质粒p2-inak为模板，上游引物为NcoI-INPN-F，下游引物为H-INPN(Re)-R，利用高保真聚合酶扩增得到引入酶切位点的冰晶核蛋白N端序列INPN，同时带有SEQ ID NO.4所示的INPN中间重复域中的前端两个亚重复序列(RE)，可选择去除该序列的终止密码子，在其后引入柔性连接肽FL(GGGGS)。以质粒p-HPCA为模板，上游引物为H-HPCA-F，下游引物为XhoI-HPCA-R，利用高保真聚合酶扩增得到引入酶切位点的SEQ ID NO.2所示HPCA编码序列，目的片段扩增用到的引物序列如下所示：
NcoI-INPN-F：CATGCCATGGATGACCCTGGATAAAGCACTGG，下划线对应碱基表示NcoI酶切位点；
H-lin-INPN-R：CCCAAGCTTCGAACCGCCACCGCCGGTCTGCAAATTCTGCGGCG，下划线对应碱基表示Hind III酶切位点；
H-INPN(Re)-R：CCCAAGCTTAATTAGATCACTGTGGTTGC，下划线对应碱基表示Hind III酶切位点；
H-HPCA-F：CCCAAGCTTATGGAGAACACCAAGTGGG，下划线对应碱基表示Hind III酶切位点；
XhoI-HPCA-R：CCGCTCGAGATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGGTCTCAGCTGAGC，下划线对应碱基表示XhoI酶切位点。
序列扩增的PCR体系为50μL，包括ddH20 18μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPMix 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶1μL，上游引物、下游引物及模板各1μL；
序列扩增的PCR条件为95℃预变性30s，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s，进行35个循环以后在72℃彻底延伸5min结束。
(2)目的基因片段酶切纯化
步骤(1)中PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，得到NcoI-INPN-Lin-HindIII，NcoI-INPN(RE)-Hind III，NcoI-INPN(RE)-FL-Hind III和Hind III-HPCA-XhoI对应的凝胶条带，按照凝胶回收试剂盒说明对目的条带进行回收。之后将上述凝胶回收后的基因片段进行酶切：
NcoI-INPN-Lin-Hind III，NcoI-INPN(RE)-Hind III和NcoI-INPN(RE)-Lin-HindIII分别利用NcoI和Hind III双酶切，Hind III-HPCA-XhoI利用Hind III和XhoI双酶切。根据PCR产物纯化试剂盒说明书对消化产物进行纯化，测定各个DNA溶液的浓度，将酶切纯化回收后的NcoI-INPN-FL-Hind III，NcoI-INPN(RE)-Hind III和NcoI-INPN(RE)-FL-HindIII片段分别与Hind III-HPCA-XhoI片段按照1：1的比例配制T4连接酶连接体系。连接反应程序为：22℃，30min；70℃，5min。将所得DNA产物再次跑胶并回收融合基因片段，得到HPCA融合模块INPN-FL-HPCA，INPN(RE)-HPCA和INPN(RE)-FL-HPCA，如附图1所示，利用INPN以不同融合方式连接HPCA构建表面展示HPCA模块。
(3)表面展示HPCA重组表达载体及工程菌构建
将质粒pET-28a(+)与纯化回收后的HPCA融合模块INPN-FL-HPCA，INPN(RE)-HPCA和INPN(RE)-FL-HPCA通过限制性内切酶NcoI和XhoI进行酶切，经PCR产物纯化回收后的线性质粒与与纯化回收后的HPCA融合模块INPN-FL-HPCA，INPN(RE)-HPCA和INPN(RE)-FL-HPCA按照1：5的比例配制T4连接酶连接体系进行连接。将连接产物转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取重组质粒送至北京金唯智生物科技有限公司进行测序。得到无任何突变发生的HPCA表面展示重组质粒图谱如附图2所示，以不同融合方式构建的HPCA表面展示表达载体：p28a-ILH(核苷酸序列为SEQ ID No.5)、p28a-IRH(核苷酸序列为SEQ ID No.6)和p28a-IRLH(核苷酸序列为SEQ ID No.7)，得到的阳性克隆菌株即为大肠杆菌表面展示HPCA重组工程菌E-28a-ILH、E-28a-IRH和E-28a-IRLH。
实施例2大肠杆菌胞内表达与表面展示来源于Sulfurihydrogenibium azorense的α型碳酸酐酶(SazCA)重组工程菌的构建
大肠杆菌胞内表达与表面展示来源于Sulfurihydrogenibium azorense的α型碳酸酐酶(SazCA)重组质粒的构建流程如图3所示，利用不同载体构建胞内表达与表面展示SazCA重组质粒载体。具体步骤如下：
(1)PCR扩增目的基因片段
大肠杆菌胞内表达SazCA片段扩增：以质粒p-SazCA为模板，上游引物为NcoI-SazCA-F，下游引物为XhoI-SazCA-R，利用高保真聚合酶扩增得到引入酶切位点的SEQ IDNO.3所示SazCA编码序列，目的片段扩增用到的引物序列如下所示：
NcoI-SazCA-F：CATGCCATGGGCGTGGCCGAGGTCCACCACTGGTC，下划线对应碱基表示NcoI酶切位点；
XhoI-SazCA-R：CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTGCTTTCCAGGATGTAGC，下划线对应碱基表示XhoI酶切位点。
大肠杆菌表面展示SazCA相关基因片段扩增：以质粒p2-inak为模板，上游引物为NcoI-INPN(Re)-F，下游引物为H-lin-INPN(Re)-R，利用高保真聚合酶扩增得到引入酶切位点的冰晶核蛋白N端序列INPN，同时带有SEQ ID NO.4所示的INPN中间重复域中的前端两个亚重复序列(RE)，并去除INPN的终止密码子，在其后引入柔性连接肽FL(GGGGS)。以质粒p-SazCA为模板，上游引物为H-SazCA-F，下游引物为XhoI-SazCA-R，利用高保真聚合酶扩增得到引入酶切位点的SEQ ID NO.3所示SazCA编码序列，目的片段扩增用到的引物序列如下所示：
NcoI-INPN(Re)-F：CATGCCATGGGCATGACCCTGGATAAAGCACTGG，下划线对应碱基表示NcoI酶切位点；
H-lin-INPN(Re)-R：CCCAAGCTTGCTGCCACCACCACCAATC，下划线对应碱基表示HindIII酶切位点；
H-SazCA-F：CCCAAGCTTATGGCCGAGGTCCACCACTGGTC，下划线对应碱基表示Hind III酶切位点；
Xh-SazCA-R：CCGCTCGAGATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGGTCTCAGCTGAGC，下划线对应碱基表示XhoI酶切位点。
序列扩增的PCR体系为50μL，包括ddH20 18μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPMix 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶1μL，上游引物、下游引物及模板各1μL；
序列扩增的PCR条件为95℃预变性30s，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s，进行35个循环以后在72℃彻底延伸5min结束。
(2)目的基因片段酶切纯化
步骤(1)中PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，得到NcoI-SazCA-XhoI，NcoI-INPN-Hind III和Hind III-SazCA-XhoI对应的凝胶条带，按照凝胶回收试剂盒说明对目的条带进行回收。之后将上述凝胶回收后的基因片段进行酶切：NcoI-SazCA-XhoI利用NcoI和XhoI双酶切，NcoI-INPN-Hind III利用NcoI和HindIII双酶切，Hind III-SazCA-XhoI利用Hind III和XhoI双酶切。根据PCR产物纯化试剂盒说明书对消化产物进行纯化，测定各个DNA溶液的浓度，将酶切纯化回收后的NcoI-INPN-Hind III片段与Hind III-SazCA-XhoI片段按照1：1的比例配制T4连接酶连接体系。连接反应程序为：22℃，30min；70℃，5min。将所得DNA产物再次跑胶并回收融合基因片段，得到SazCA融合模块INPN(RE)-FL-SazCA，如附图3所示，不同胞内表达与表面展示载体中INPN与SazCA之间均由冰核蛋白的中间重复域中的前端两个亚重复序列和连接子进行融合连接。
(3)重组表达载体及工程菌构建
将质粒pET-28a(+)、pET-22b(+)、pET-32a(+)通过限制性内切酶NcoI和XhoI进行酶切，经PCR产物纯化回收后的线性质粒与与纯化回收后的基因片段NcoI-SazCA-XhoI按照1：5的比例配制T4连接酶连接体系进行连接。将连接产物转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取重组质粒送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。得到无任何突变发生的SazCA胞内表达重组质粒图谱如附图4所示，利用不同表达载体分别构建得到SazCA胞内表达重组质粒：p28a-S、p22b-S和p32a-S，得到的阳性克隆菌株即为大肠杆菌胞内表达SazCA重组工程菌E-28a-S、E-22b-S和E-32a-S。
将质粒pET-28a(+)、pET-22b(+)、pET-32a(+)与纯化回收后的SazCA融合模块INPN(RE)-FL-SazCA通过限制性内切酶NcoI和XhoI进行酶切，经PCR产物纯化回收后的线性质粒与与纯化回收后的SazCA融合模块INPN(RE)-FL-SazCA按照1：5的比例配制T4连接酶连接体系进行连接。将连接产物转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取重组质粒送至北京金唯智生物科技有限公司进行测序。得到无任何突变发生的SazCA表面展示重组质粒图谱如附图4所示，利用不同表达载体分别构建得到SazCA表面展示重组质粒：p28a-IRLS(核苷酸序列为SEQ ID No.8)、p22b-IRLS(核苷酸序列为SEQ IDNo.9)和p32a-IRLS(核苷酸序列为SEQ ID No.10)，得到的阳性克隆菌株即为大肠杆菌表面展示SazCA重组工程菌E-28a-IRLS、E-22b-IRLS和E-32a-IRLS。
实施例3大肠杆菌重组表面展示SazCA的表达与定位
(1)菌株活化：从保存于-20℃的甘油管中取100μL工程菌株E-22b-IRLS接种于载有3mL LB培养基的试管中，37℃，220rpm过夜培养得到种子液。
(2)将步骤(1)得到的种子培养液取2mL接入100mL LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.4mM的诱导剂IPTG和终浓度为0.5mM的ZnSO4，并设置摇床温度为25℃，诱导24h后，收集所有细胞沉淀物，用PBS溶液洗三次，然后用10mLPBS重悬。
(3)用超声波破碎仪破碎细胞10分钟(每超声波破碎5秒，间歇5秒)，然后以8000rpm离心10分钟以除去破碎不完全的细胞碎片。收集离心后的上清液，转移到贝克曼超速离心机的专用离心管中，以39000rpm的转速离心1h，细胞质组分存在于上清液中，而膜组分在沉淀部分。用含有0.01mM氯化镁(MgCl2)和2％TritonX-100的PBS缓冲液重新悬浮沉淀并加将其置于室温下孵育30min以使膜成分充分溶溶解，之后再次以39000rpm的转速离心1h。最终得到的沉淀部分即工程菌的细胞外膜成分，而上清液则是工程菌的细胞内膜内成分。
(4)通过Western bloting分析不同细胞成分。INPN-SazCA的预期分子量为52.59kDa。如图5所示，SazCA表面展示工程菌E-22b-IRLS的细胞质，细胞内膜和细胞外膜组分免疫印迹分析表明，在细胞外膜组分中在大于50kDa有明显条带，与INPN-SazCA的融合蛋白大小相符，说明碳酸酐酶表面展示菌株中融合蛋白在工程菌中成功表达，并且SazCA与INPN以融合蛋白的形式被锚定在细胞的外膜上。
实施例4重组工程菌制备全细胞催化剂及其酶活力分析
(1)菌株培养与蛋白诱导表达：从保存于-20℃的甘油管中取100μLSazCA胞内表达菌株E-22b-S和表面展示菌株E-22b-IRLS接种于载有3mL LB培养基的试管中，37℃，220rpm过夜培养得到种子液，取2mL种子液接入100mL LB液体培养基中，37℃，220rpm培养110min，用新鲜的LB培养基调整每瓶发酵液OD600＝0.6±0.02，进行诱导条件优化，优化实验如下：①加入0.2mM诱导剂IPTG，0.5mM ZnSO4，分别于15℃、20℃、25℃、30℃、37℃这五个温度下诱导12h后，收集菌体；②加入0.2mM诱导剂IPTG，加入ZnSO4浓度梯度为0mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM，25℃低温诱导12h后，收集菌体；③加入诱导剂IPTG 0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM，ZnSO4 0.5mM，25℃低温诱导12h后，收集菌体；④加入诱导剂IPTG 0.4mM，ZnSO40.5mM，25℃低温分别诱导6h、12h、24h、36h、48h、60h后，收集菌体。
(2)全细胞催化剂制备：将诱导完成后的菌液在冷冻离心机中，4℃，7000rpm离心10min收集菌体，用去离子水洗2次，用Tris-HCl缓冲液洗2次后，将菌体悬浮于10mL Tris-HCl缓冲液中得到全细胞催化剂样品，测OD600，保存于4℃冰箱待测酶活。
(3)酶活力分析：利用电极法测量步骤(2)得到的全细胞催化剂酶活力。SazCA胞内表达工程菌E-22b-S与SazCA表面展示重组工程菌E-22b-IRLS在不同诱导条件下的全细胞酶活力如图6～9所示(图6：不同诱导温度；图7：不同ZnSO4浓度；图8：不同IPTG浓度；图9：不同诱导时间)，E-22b-S的最适诱导温度为25℃，最优IPTG诱导浓度为0.4mM，最优外源添加Zn2+浓度选为0.5mM，最优诱导时长为12h，全细胞酶活为8.355UmL-1OD600 -1。细胞表面展示菌株E-22b-IRLS的最适诱导温度为25℃，最优IPTG诱导浓度为0.4mM，最优外源添加Zn2+浓度选为0.5mM，最优诱导时长为24h，全细胞酶活为11.43UmL-1OD600 -1。诱导导条件优化前，E-22b-S的全细胞酶活为6.59UmL-1OD600 -1，E-22b-IRLS的全细胞酶活为9.475UmL-1OD600 -1。同时优化后，在最适诱导条件下表面展示菌株的酶活依然明显优于胞内表达菌株。进一步证实了通过基因工程手段将碳酸酐酶展示到细胞表面，构建新型的全细胞催化剂。既能保留细胞内酶的代谢潜能，又可以让酶底物和酶促反应产物都不需要穿过膜屏障就可以与酶直接接触，降低了底物和产物的传质阻力，提高了全细胞催化剂的酶活。
实施例5表面展示SazCA全细胞催化剂酶学性质分析
(1)热稳定性分析：将实施例3中酶活力最高的全细胞催化剂样品放在25℃、50℃和70℃的水浴锅中温育在不同时间(0h、1h、2h、3h、4h、6h、12h)取出适量的表面展示细胞和游离酶液，以CO2为底物测量酶活，将0h时的酶活设置为100％，计算不同温度下不同样品的残余酶活，通过三个独立测定的平均值获得所有数据。
(2)pH稳定性分析：将实施例3中酶活力最高的全细胞催化剂样品放在不同pH的缓冲液中(pH＝4.0～12.0)，4℃放置24h，然后在pH8.3的Tris-Hcl中测量酶活，将测定的最高酶活力设定为100％，计算E-22b-IRLS和游离SazCA在不同pH中处理后相对酶活。其中缓冲液为：pH 4.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液，以及pH 10.0～12.0的甘氨酸-NaOH缓冲液。通过三个独立测定的平均值获得所有数据。
(3)长期稳定性分析：将实施例3中酶活力最高的全细胞催化剂样品放置在25℃的恒温培养箱内，使用CO2作为底物在适当的时间(0d、2d、4d、6d、10d)分别取出等量的试样测定酶活，使用预先灭菌的0.22μm的滤膜对所有用于长期稳定性分析的缓冲液进行灭菌避免污染。将0d时测定的酶活力设定为100％，计算表面展示的SazCA和游离SazCA的随着时间变化的剩余酶活，通过三个独立测定的平均值获得所有数据。
(4)表面展示SazCA全细胞催化剂酶学性质分析：热稳定性分析如图10所示，25℃下，E-22b-IRLS和Free SazCA的相对剩余酶活几乎保持恒定，25℃下保温12h后，E-22b-IRLS的剩余酶活为初始酶活的95％，Free-SazCA的剩余酶活为初始酶活的87.2％；而较高温度(50℃和70℃)下，Free-SazCA随着水浴时间的延长酶活下降的速率明显较快，50℃处理12h后，E-22b-IRLS剩余相对酶活为72.49％，Free SazCA的相对酶活降为43.75％；70℃处理12h后，E-22b-IRLS剩余酶活在40％以上，Free SazCA的酶活降为15.12％。因此，含有表面展示SazCA的全细胞催化剂E-22b-IRLS显著提高了其在较高温度下的热稳定性。pH稳定性分析如图11所示，E-22b-IRLS和Free SazCA的相对酶活随着pH的升高均显示出先增加后降低的态势，在环境pH接近9时，表面展示菌株与游离酶稳定性无显著差别，但在酸性和强碱性条件下，表面展示菌株E-22b-IRLS作为全细胞催化剂及展现出比游离酶更高的pH稳定性。长期稳定性分析如图12所示，10d后E-22b-IRLS剩余酶活约为初始酶活的75％，而游离SazCA仅剩36.3％，因此经表面展示后酶的储存长期稳定性也得到了显著提升。
实施例6大肠杆菌SazCA胞内表达菌及SazCA重组表面展示菌用于CO2矿化沉积CaCO3
(1)表面展示菌株E-22b-IRLS和胞内表达菌株E-22b-S用于CO2矿化，利用含有空白载体菌株E-22b作对照：在100mL的离心管中加入8mL Tris-HCl，向缓冲液中加入1mg的碳酸酐酶或全细胞催化剂。向混合体系中加入提前制备好的冰冷的CO2饱和溶液，反应5min后。将表面展示SazCA和胞内表达SazCA的细胞通过离心去除，然后向液体中加入25mL CaCl2溶液，维持反应在所需温度下进行10min。提前将水系滤膜在真空干燥箱中放置24h烘干后称重，记为W1，产生的CaCO3沉淀通过真空泵抽滤分离,连同滤膜放入真空干燥箱中放置36h，烘干后称重，记为W2，实际矿化的CaCO3质量W＝W2-W1。
(2)CaCO3沉积量：CO2矿化结果如图13所示，在相同条件下，不同矿化体系生成的CaCO3沉积量顺序为：E-22b-IRLS(241mg)>E-22b-S(173mg)>E-22b(88mg)。在相同时间内表面展示菌株E-22b-IRLS催化产生的CaCO3的量大于胞内表达菌株E-22b-S，说明将SazCA锚定在细胞外膜上，酶底物或酶促反应产物都不需要穿过膜屏障就可以与酶直接接触，降低了底物和产物的传质阻力，提高了全细胞催化剂的酶活力，从而提高了催化CaCO3沉积的速率。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 表面展示碳酸酐酶的重组工程菌及其构建方法与应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgactctcg acaaggcgtt ggtgctgcgt acctgtgcaa ataacatggc cgatcactgc 60
ggccttatat ggcccgcgtc cggcacggtg gaatccagat actggcagtc aaccaggcgg 120
catgagaatg gtctggtcgg tttactgtgg ggcgctggaa ccagcgcttt tctaagcgtg 180
catgccgatg ctcgatggat tgtctgtgaa gttgccgttg cagacatcat cagtctggaa 240
gagccgggaa tggtcaagtt tccgcgggcc gaggtggttc atgtcggcga caggatcagc 300
gcgtcacact tcatttcggc acgtcaggcc gaccctgcgt caacgtcaac gtcaacgtca 360
acgtcaacgt taacgccaat gcctacggcc atacccacgc ccatgcctgc ggtagcaagt 420
gtcacgttac cggtggccga acaggcccgt catgaagtgt tcgatgtcgc gtcggtcagc 480
gcggctgccg ccccagtaaa caccctgccg gtgacgacgc cgcagaattt gcagacc 537
<210> 2
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggagaaca ccaagtggga ctacaagaac aaagagaacg gtccgcaccg ctgggacaag 60
ctgcacaagg acttcgaggt gtgcaagagc ggcaagagcc agtcgccgat caacatcgag 120
cactactatc acacccagga caaggccgac ctgcagttca agtatgccgc cagcaagccg 180
aaggccgtgt tcttcaccca tcacaccctg aaggccagct tcgagccgac caaccacatc 240
aactaccgtg gccatgacta cgtgctggac aacgtgcact tccatgcgcc aatggagttc 300
ctgatcaaca acaagacccg tccgctgagc gcccacttcg tccacaagga cgccaagggt 360
cgcctgctgg tgctggccat cggcttcgag gaaggcaaag aaaacccgaa cctggacccg 420
atcctggaag gcatccagaa gaagcagaac ttcaaagagg tggccctgga cgccttcctg 480
ccgaagtcga tcaactacta ccacttcaac ggcagcctga ccgcgccacc gtgcaccgaa 540
ggcgtggcct ggttcgtgat cgaggaaccg ctggaagtga gcgccaagca gctggccgag 600
atcaagaaac gcatgaagaa cagcccgaac cagcgtccgg tccagccgga ctacaacacc 660
gtgatcatca agagcagcgc ggaaacccgc taa 693
<210> 3
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccgaggtcc accactggtc gtacgagggc gagaacggtc cggaaaactg ggccaagctg 60
aacccggaat acttctggtg caacctgaag aaccagtcgc cagtggacat cagcgacaac 120
tacaaggtgc acgccaagct ggaaaagctg cacatcaact acaacaaggc ggtcaacccg 180
gaaatcgtga acaacggcca caccatccag gtgaacgtgc tggaagattt caaactgaac 240
atcaagggca aagagtacca cctgaagcag ttccacttcc atgcgccaag cgagcacacc 300
gtgaacggca agtactaccc gctggaaatg cacctggtgc acaaggacaa ggacggcaac 360
atcgccgtga tcggcgtgtt cttcaaagaa ggcaaggcga accccgagct ggacaaggtg 420
ttcaagaacg ccctgaaaga agagggcagc aaggtcttcg acggcagcat caacatcaac 480
gccctgctgc caccagtgaa gaactactac acctacagcg gcagcctgac caccccaccg 540
tgcaccgaag gcgtgctgtg gatcgtgctg aagcagccga tcaccgccag caagcagcag 600
atcgagctgt tcaagagcat catgaagcac aacaacaacc gtccgaccca accgatcaac 660
agccgctaca tcctggaaag caaccaccac caccaccacc actga 705
<210> 4
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaacctatg gtagcaccct gagcggtgat aatcattcac gtctgattgc aggttatggc 60
agcaatgaaa ccgcaggtaa tcatagcgat ctgatt 96
<210> 11
<211> 6540
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atggatgacc ctggataaag cactggttct 5100
gcgtacctgt gccaataata tggcagatca ttgtggtctg atttggcctg caagcggcac 5160
cgttgaaagc cgttattggc agagcacccg tcgtcatgaa aatggtctgg ttggtctgct 5220
gtggggtgca ggcaccagcg catttctgag cgttcatgca gatgcacgtt ggattgtttg 5280
tgaagttgca gttgcagata ttatcagcct ggaagaacct ggtatggtta aatttccgcg 5340
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agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga 6780
aaggaggaac tatatccgga t 6801
<210> 11
<211> 7216
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960
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aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140
tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260
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gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440
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aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980
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tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220
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tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520
cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580
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tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600
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tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720
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atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020
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ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320
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taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga 7200
ggaactatat ccggat 7216
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