高产香兰素的基因缺陷型拟无枝酸菌、其构建方法及应用
阅读说明：本技术 高产香兰素的基因缺陷型拟无枝酸菌、其构建方法及应用 (Gene-deficient amycolatopsis capable of producing vanillin at high yield, and construction method and application thereof ) 是由 孟永宏 强珊 郭建琦 牛永洁 杨璐 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供ROK家族转录调控基因ROK-TR1、ROK-TR2或ROK-TR3的缺失在提高拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)产香兰素中的应用,特别涉及一株高产香兰素的基因缺陷型拟无枝酸菌,该菌缺失了拟无枝酸菌的ROK家族中转录调控基因ROK-TR1。本发明还提供所述拟无枝酸菌的构建方法及产香兰素的应用。敲除ROK-TR1基因后,拟无枝酸菌的香兰素产量较出发菌株提高33％,在3个ROK家族中转录调控基因中表现最为突出,而过表达ROK-TR1基因时,香兰素产量较出发菌株降低34％,这为工业生产进一步提高香兰素发酵产量提供技术支撑。(The invention provides application of deletion of ROK family transcription regulatory gene ROK-TR1, ROK-TR2 or ROK-TR3 in improving vanillin production of Amycolatopsis sp, in particular to a gene-deficient Amycolatopsis strain for high-yield vanillin, wherein the gene-deficient Amycolatopsis strain lacks the transcription regulatory gene ROK-TR1 in the ROK family of Amycolatopsis sp. The invention also provides a construction method of the amycolatopsis and application of the amycolatopsis in producing vanillin. After the ROK-TR1 gene is knocked out, the vanillin yield of the amycolatopsis is improved by 33% compared with that of the starting strain, the expression is most prominent in the transcriptional regulatory genes in 3 ROK families, and when the ROK-TR1 gene is overexpressed, the vanillin yield is reduced by 34% compared with that of the starting strain, so that technical support is provided for further improving the vanillin fermentation yield in industrial production.)
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技术领域
】本发明属于基因工程技术领域。更具体地，本发明涉及一种基因缺陷型拟无枝酸菌，还涉及所述拟无枝酸菌在生产香兰素中的应用。
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背景技术
】香兰素又称香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)，是世界上使用最广泛的调味料之一，在食品、药品、化妆品、农业等领域被广泛应用。香兰素具有“食品香料之王”的美称，有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，可在食品中起到助香、增味的作用；在医药方面，香兰素是合成多种药物的重要原料；香兰素在化妆品、香水等领域可作为调香剂；在农业生产中也可作为农作物的催熟剂和增产剂。由于其广泛的使用领域，国内外所生产出的香兰素远远不能满足目前的市场需求。
目前，市场上香兰素的生产方式主要包括植物提取、化学合成、微生物转化。植物提取主要是从香荚兰豆中提取香兰素，但由于香荚兰的种植受气候的影响，其产量有限，故从中所提取得到的天然香兰素价格极其昂贵，因此植物提取的香兰素远远不能满足市场需求。化学合成法生产的香兰素价格低廉，但是，化学合成的香兰素香型单一、容易引发环境污染，不符下游应用市场对天然原料的消费趋势。随着消费者对天然香料需求的不断增长，利用微生物转化天然底物生产香兰素受到重视。目前，所用的天然底物主要是可再生资源阿魏酸或丁香酚等。其中阿魏酸，因其在自然界中分布广泛，且对微生物毒性作用小，而被认为是微生物生产香兰素首选的前体物质。研究表明，目前仅Amycolatopsis和Streptomyces两个属的多个菌株能将底物阿魏酸转化生成浓度大于10g/L的香兰素，基本可应用于工业化生产。例如US6133003专利公开了利用拟无枝酸菌DMS9992转化阿魏酸生产香兰素，香兰素的浓度达到11.5g/L。US6235507B1专利公开了一株西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii ATCC39116)转化阿魏酸生产香兰素的产量达到13.9g/L。德国Steinbüchel团队对Amycolatopsis sp.ATCC 39116(以前称为Seteptiices setonii ATCC39116)菌株进行阿魏酸代谢分析(Fleige C,Meyer F,Steinbüchel A.MetabolicEngineering of the Actinomycete Amycolatopsis sp.Strain ATCC 39116towardsEnhanced Production of Natural Vanillin.Applied and EnvironmentalMicrobiology,2016,82(11):3410-3419)，认为阿魏酸在阿魏酰辅酶A合成酶、烯酰-CoA醛缩酶的依次作用下生成香兰素，在香兰素脱氢酶的作用下香兰素会进一步降解为香草酸，香草酸分别在香草酸脱羧酶和香草酸脱甲基酶作用下，降解为愈创木酚和原儿茶酸。其团队通过敲除编码香兰素脱氢酶的vdh基因，并对编码阿魏酰辅酶A合成酶基因(fcs)和编码烯酰-CoA醛缩酶基因(ech)进行过表达，使工程菌株产香兰素的浓度达到22.3g/L，为目前报道的最高水平。目前，拟无枝酸菌生物转化阿魏酸生产香兰素的基因已被解析，香兰素合成通路非常清晰。然而，关于拟无枝酸菌生产香兰素调控方面的研究还未见报道，这限制了通过拟无枝酸菌基因调控改造进一步提高香兰素产量的技术发展。
2015年，Sánchez等(Romero-Rodríguez A,Robledo-Casados I,Sánchez S.Anoverview on transcriptional regulators in Streptomyces.Biochimica etbiophysica acta,2015,1849(8):1017-1039)将链霉菌的初级代谢转录调控因子分成GntR、AraC/XylS、AsnC/Lrp、LuxR、IclR、LacI/GalR、DeoR、ROK共8个家族。其中，ROK家族调控基因广泛分布于原核生物中，但链霉菌中对这一家族的转录因子研究较少，也没有关于拟无枝酸菌中ROK家族调控基因次级代谢的研究。
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发明内容
】本发明的目的是克服现有技术方案，通过基因改造提供一种高产香兰素的拟无枝酸菌。
为了实现上述目的，本发明的思路是研究ROK家族调控基因与拟无枝酸菌在转化阿魏酸生产香兰素的关系，确认ROK家族调控基因的敲除在提高拟无枝酸菌的香兰素产量中意义。
基于上述思路，本发明提供高产香兰素的基因缺陷型拟无枝酸菌，所述基因缺陷型拟无枝酸菌敲除了拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的ROK家族中转录调控基因ROK-TR1、ROK-TR2或ROK-TR3。
在本发明中，基因ROK-TR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因ROK-TR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，基因ROK-TR3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
特别优选地，本发明提供一株高产香兰素的基因缺陷型拟无枝酸菌，所述基因缺陷型拟无枝酸菌敲除了拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的ROK家族中转录调控基因ROK-TR1。
基于此，本发明还提供上述基因缺陷型拟无枝酸菌的构建方法，即缺失了ROK-TR1、ROK-TR2或ROK-TR3基因的拟无枝酸菌，所述方法包括以下步骤：
分别用TR1-U-FOR/TR1-U-REV和TR1-D-FOR/TR1-D-REV、TR2-U-FOR/TR2-U-REV和TR2-D-FOR/TR2-D-REV或TR3-U-FOR/TR3-U-REV和TR3-D-FOR/TR3-D-REV为引物，以拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)基因组为模板，PCR扩增ROK-TR1、ROK-TR2或ROK-TR3基因的上下游同源臂；
所得上下游同源臂片段通过Assembly试剂盒连接到pKC1139质粒的HindIII/EcoRI位点，构建得到质粒pKC1139-TR1、pKC1139-TR2或pKC1139-TR3；
利用接合转移实验方法，将pKC1139-TR1、pKC1139-TR2或pKC1139-TR3质粒转化到拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)中，经阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得敲除ROK-TR1、ROK-TR2或ROK-TR3基因的基因缺陷型拟无枝酸菌。
其中，所述阿伯拉霉素抗性筛选是将拟无枝酸菌涂布于含有50μg/mL阿伯拉霉素和25μg/mL萘啶酮酸溶液GYM固体培养基中，在30℃培养4d至长出单菌落，所得单菌落经PCR验证正确后即为阳性突变株；
上述GYM固体培养基配方为：葡萄糖4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、碳酸钙2g/L、琼脂粉20g/L。
本发明提供并验证了上述基因缺陷型拟无枝酸菌在转化阿魏酸生产香兰素中的应用。
作为一种优选的实施方式，将所述基因缺陷型拟无枝酸菌接种于50mL种子培养基M1中，在30℃、200rpm条件下培养72h；
将种子液按照质量比5％的接种量接种到含有4L发酵培养基M2的5L发酵罐中，在30℃、搅拌转速800rpm、通气比为1vvm条件下发酵培养24h；
然后加入底物阿魏酸27g/L，调节pH为8.2继续发酵48h，发酵结束用HPLC测定发酵液中香兰素的浓度。
经HPLC测定，发酵液中香兰素的浓度为17.52-20.13g/L。
上述M1培养基配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2。上述M2培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2。
在本发明中，构建基因缺陷型拟无枝酸菌时，将pKC1139-TR1、pKC1139-TR2或pKC1139-TR3质粒转化到拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)时的出发菌株为拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141，该菌株已于2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.22871。该拟无枝酸菌HM-141也记载于中国发明专利申请CN2021109397312。
拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141是从西安、咸阳、渭南等地果树周围采集的土壤样品后，经常规技术进行分离，然后诱变后鉴定获得的。其中，所述诱变是以分离所得的原始菌株为出发菌株，进行复合诱变选育，紫外-亚硝酸钠复合诱变筛出高产香兰素的菌株：
将出发菌株在平板培养基上进行活化，然后挑取菌落溶于装有玻璃珠的10mL无菌水中，震荡混匀后得到菌悬液，梯度稀释获得OD600为0.4-0.6的菌悬液。取10mL菌悬液置于无菌培养皿中，在15W紫外灯的30cm处照射30s，然后避光培养1h，再向培养皿中加入0.1M的亚硝酸钠，在30℃，200rpm培养3min。
诱变结束后，立即加入磷酸氢二钠溶液终止反应。将诱变后的菌悬液进行梯度稀释，然后涂布于平板培养基上，挑取长出的单菌落接入装有种子培养基(种子培养基：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2，在121℃下灭菌20min)的96孔板中培养，种子液以5％的接种量接入96孔板发酵培养基(发酵培养基：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节初始pH为7.2，发酵培养基在121℃下灭菌20min)中，在30℃、200rpm摇床中培养，加入0.5g/L的底物阿魏酸，结合2，4-二硝基苯肼显色法，用酶标仪在520nm处测吸光度，以此测定发酵液中香兰素的含量。
采用2，4-二硝基苯肼显色法测定香兰素的产量：发酵转化后期每4h从96孔板的培养液中取出10μL菌液于24深孔板内，加入100μL 2，4-二硝基苯肼溶液和5mL 0.8mol/L的NaOH溶液，混匀，以蒸馏水作为空白对照，同时以出发菌株作为对照组，然后检测吸光度。筛选出正突变株进行摇瓶复筛，将在平板培养基上活化的正突变株分别接种于种子培养基，30℃、200rpm培养48-72h，然后按照5％的接种量接种于发酵培养基中，30℃、200rpm条件下进行转化，底物阿魏酸初始浓度为10g/L。通过HPLC测定最终发酵液中香兰素的含量。最终筛选出高产香兰素的菌株。
所得菌株采用16s rDNA方法鉴定，确认筛选的菌株的16s rDNA与拟无枝酸菌具有99％的同源性，因此，将拟无枝酸菌HM-141定名为Amycolatopsis sp.HM-141。其生物学特性为：在固体培养基上能形成明显的菌落，其菌落形态见附图1，菌落为白色或淡黄色、不透明，表面干燥。革兰氏染色为阳性，菌体为细丝状。
拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.HM-141产香兰素测定：
取一管-80℃保藏的甘油菌种Amycolatopsis sp.HM-141，在固体平板(固体培养基：葡萄糖4g/L，酵母浸粉4g/L，麦芽提取物10g/L，琼脂20g/L，其余为水)上稀释涂布，平板倒置于30℃培养箱中培养3-4d至长出菌落。
从活化平板上接一环菌到种子培养基中，在30℃培养48-72h，转速为200rpm。
将种子液按照5％的接种量接种到5L发酵罐中(含有4L发酵培养基)，在30℃发酵培养，搅拌转速为800rpm，通气比为1vvm。培养24h后，加入底物阿魏酸22.5g/L(共90g，按照4L发酵液体积计算的阿魏酸浓度，将阿魏酸溶于0.5M NaOH溶液中使其浓度为100g/L)，然后调节pH为8.2，继续发酵48h。
由于在4L发酵液的基础上加了0.9L的阿魏酸溶液，而在发酵期间对发酵液取样导致发酵液有所减少，在发酵结束时，测得实际的发酵液体积为4.5L，为了保持数据一致，以下数据均用4L发酵液进行计算。用HPLC测定发酵液中香兰素的浓度为15g/L，残留的阿魏酸浓度为0.5g/L，如果计入未参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为85％；如果不计入未参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为87％。副产物香兰酸的含量为0.25g/L，发酵液中未检测到香兰醇。
可见，作为本发明的出发菌株的拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.HM-141能够以阿魏酸为底物生产香兰素，实现的摩尔转化率高达87％，且产物中的杂质含量少，香兰醇的检出量为0，香兰酸的检出量为0.25g/L。
本发明验证了通过基因工程手段敲除拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.的ROK家族中转录调控基因ROK-TR1、ROK-TR2或ROK-TR3后，能够有效提高野生型拟无枝酸菌的香兰素，并通过过表达调控基因ROK-TR1、ROK-TR2或ROK-TR3确认所述基因与拟无枝酸菌的香兰素产量呈负相关，为工业生产进一步提高香兰素发酵产量提供技术支撑；
特别突出地，本发明中敲除拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.的ROK-TR1基因后，香兰素产量较野生型提高33％，而过表达ROK-TR1基因时，香兰素产量较野生型降低34％，此外，ROK-TR2基因和ROK-TR3基因均有类似作用，表明ROK家族调控因子ROK-TR1、ROK-TR2基因和ROK-TR3是一个参与香兰素生物合成的负调控因子。
本发明涉及的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)HM-141已于2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.22871。
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附图说明
】图1为本发明中pKC1139-TR1质粒的图谱
图2为本发明中pKC1139-TR2质粒的图谱
图3为本发明中pKC1139-TR3质粒的图谱
图4为本发明中ΔROK-TR1突变体的PCR验证：M，2K Plus DNA Marker，1，2，3为TR1-U-F验/TR1-U-R验引物验证结果，4，5，6为TR1-D-F验/TR1-D-R验引物验证结果，1，6为对照基因组，2，3，4，5为阳性突变株。
图5为本发明中ΔROK-TR2突变体的PCR验证：M，2K Plus DNA Marker，1，2，3为TR2-U-F验/TR2-U-R验引物验证结果，4，5，6为TR2-D-F验/TR2-D-R验引物验证结果，1，4为对照基因组，2，3，5，6为阳性突变株。
图6为本发明中ΔROK-TR3突变体的PCR验证：M，2K Plus DNA Marker，1，2，5为TR3-U-F验/TR3-U-R验引物验证结果，3，4，6为TR3-D-F验/TR3-D-R验引物验证结果，5，6为对照基因组，1，2，3，4为阳性突变株。
图7为本发明中基因回补、过表达菌株的构建，PCR产物为阿伯拉霉素抗性基因：M，2K Plus DNA Marker，1，对照，2，ΔROK-TR1/pSET152-TR1，3，AMY/pSET152-TR1，4，ΔROK-TR2/pSET152-TR2，5，AMY/pSET152-TR2，6，ΔROK-TR3/pSET152-TR3,，7，AMY/pSET152-TR3
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具体实施方式
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通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为质量百分比，用于解释比例的“：”均为质量比。
实施例中使用到的菌株和质粒见表1，合成的引物序列见表2。
表1研究中所用的菌种和质粒
表2研究中所用的引物
本发明涉及以下培养基：
LB培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。
GYM培养基配方为：葡萄糖4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L。
GYM固体培养基配方为：葡萄糖4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、碳酸钙2g/L、琼脂粉20g/L。
M1培养基配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2。
M2培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁1g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2。
以下实施例中使用的接合转移实验包括以下步骤：
(1)将拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.(或其他工程菌株)在GYM固体培养基上进行活化，在30℃培养3-4d至长出菌落，然后接种菌株到50mL GYM液体培养基中在30℃、200rpm培养2d。
(2)将构建好的质粒热激转入E.coli ET12567(pUZ8002)菌株，涂布于含有25μg/mL氯霉素、25μg/mL卡那霉素和50μg/mL阿伯拉霉素抗性的LB固体平板，在37℃培养12h至长出单菌落，接种单菌落于含有抗性的4mL LB液体培养基中37℃、200rpm过夜培养，然后按照1％的接种量接种于20mL LB中在37℃、200rpm培养4-5h至OD600为0.4-0.6。
(3)分别取拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.菌液2mL及携带目标质粒的E.coliET12567(pUZ8002)菌液1mL，5000g离心1min，用无抗LB清洗两遍，加入100μL无抗LB培养基，将拟无枝酸菌和E.coli ET12567(pUZ8002)按体积比7:1混合，将混合好的菌液取30μL点在无抗GYM固体培养基上30℃，14h正置培养。
(4)将长出的菌斑刮下，涂布于含有50μg/mL阿伯拉霉素和25μg/mL萘啶酮酸溶液GYM固体培养基中，在30℃培养4d至长出单菌落，然后对单菌落进行PCR验证。
实施例1：ROK-TR1基因缺失、基因回补、基因过表达菌株的构建
在NCBI网站上根据拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.ATCC 39116菌株的基因序列比对出拟无枝酸菌中ROK家族的转录调控因子ROK-TR1的序列，基因序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质登录号为WP_020420567.1。
1、构建ROK-TR1基因缺失的拟无枝酸菌
以TR1-U-FOR/TR1-U-REV和TR1-D-FOR/TR1-D-REV为引物，拟无枝酸菌基因组为模板，PCR扩增ROK-TR1基因各约1.1kb的上下游同源臂。同时将上述两个TR1-UP和TR1-DOWN片段通过Assembly试剂盒连接到pKC1139质粒的HindIII/EcoRI位点，完成质粒pKC1139-TR1的构建，pKC1139-TR1质粒图谱如图1所示。
利用接合转移实验方法，将pKC1139-TR1质粒转化到拟无枝酸菌HM-141中，根据阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得ROK-TR1基因敲除的基因工程菌株。以TR1-U-F验/TR1-U-R验和TR1-D-F验/TR1-D-R验作为鉴定引物，以拟无枝酸菌基因组为对照进行PCR验证，阳性缺失突变株命名为ΔROK-TR1(见图4)。
2、构建ROK-TR1基因回补的拟无枝酸菌
用TR1-FOR/TR1-REV为引物，以拟无枝酸菌基因组DNA为模板，PCR扩增含有ROK-TR1基因自身启动子区和ORF的DNA片段，将上述片段通过Assembly试剂盒连接到pSET152质粒的XbaI/BamHI位点，获得质粒pSET152-TR1。
然后利用接合转移实验方法，将pSET152-TR1质粒转化到前述获得的ΔROK-TR1菌株中，通过阿伯拉霉素抗性进行初步筛选，以阿伯拉霉素抗性基因为对象进行鉴定，以Apra-F/Apra-R作为鉴定引物，以pSET152质粒为对照进行PCR验证，获得的菌株命名为ΔROK-TR1/pSET152-TR1(见图7)。
3、构建ROK-TR1基因过表达的拟无枝酸菌
利用接合转移实验方法，将pSET152-TR1质粒转化到拟无枝酸菌HM-141中，通过阿伯拉霉素抗性进行初步筛选，以阿伯拉霉素抗性基因为对象进行鉴定，以Apra-F/Apra-R作为鉴定引物，以pSET152质粒为对照进行PCR验证，获得的回复菌株命名为AMY/pSET152-TR1(见图7)。
实施例2：ROK-TR2基因缺失、基因回补、基因过表达菌株的构建
在NCBI网站上根据拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.ATCC 39116菌株的基因序列比对出野生型拟无枝酸菌中ROK家族的转录调控因子ROK-TR2的序列，其编码的蛋白质登录号为WP_020421841.1。
1、构建ROK-TR2基因缺失的拟无枝酸菌
用TR2-U-FOR/TR2-U-REV和TR2-D-FOR/TR2-D-REV为引物，拟无枝酸菌基因组为模板，PCR扩增ROK-TR2基因各约1.1kb的上下游同源臂。同时将上述两个TR2-UP和TR2-DOWN片段通过Assembly试剂盒连接到pKC1139质粒的HindIII/EcoRI位点，完成质粒pKC1139-TR2的构建，pKC1139-TR2质粒图谱如图2所示。
利用接合转移实验方法，将pKC1139-TR2质粒转化到拟无枝酸菌HM-141中，根据阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得ROK-TR2基因敲除的基因工程菌株。以TR2-U-F验/TR2-U-R验和TR2-D-F验/TR2-D-R验作为鉴定引物，以拟无枝酸菌基因组为对照进行PCR验证，阳性缺失突变株命名为ΔROK-TR2(见图5)。
2、构建ROK-TR2基因回补的拟无枝酸菌
用TR2-FOR/TR2-REV为引物，以拟无枝酸菌基因组DNA为模板，PCR扩增含有ROK-TR2基因自身启动子区和ORF的DNA片段，将上述片段通过Assembly试剂盒连接到pSET152质粒的XbaI/BamHI位点，获得质粒pSET152-TR2。
然后利用接合转移实验方法，将pSET152-TR2质粒转化到ΔROK-TR2菌株中，通过阿伯拉霉素抗性进行初步筛选，以阿伯拉霉素抗性基因为对象进行鉴定，以Apra-F/Apra-R作为鉴定引物，以pSET152质粒为对照进行PCR验证，获得的回补菌株命名为ΔROK-TR2/pSET152-TR2(见图6)。
3、构建ROK-TR2基因过表达的拟无枝酸菌
利用接合转移实验方法，将pSET152-TR2质粒转化到拟无枝酸菌HM-141中，通过阿伯拉霉素抗性进行初步筛选，以阿伯拉霉素抗性基因为对象进行鉴定，以Apra-F/Apra-R作为鉴定引物，以pSET152质粒为对照进行PCR验证，获得的回复菌株命名为AMY/pSET152-TR2(见图7)。
实施例3：ROK-TR3基因缺失、基因回补、基因过表达菌株的构建
在NCBI网站上根据拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.ATCC 39116菌株的基因序列比对出拟无枝酸菌中ROK家族的转录调控因子ROK-TR3的序列，其编码的蛋白质登录号为WP_157358695.1。
1、构建ROK-TR3基因缺失的拟无枝酸菌
用TR3-U-FOR/TR3-U-REV和TR3-D-FOR/TR3-D-REV为引物，拟无枝酸菌基因组为模板，PCR扩增ROK-TR3基因各约1.1kb的上下游同源臂。同时将上述两个TR3-UP和TR3-DOWN片段通过Assembly试剂盒连接到pKC1139质粒的HindIII/EcoRI位点，完成质粒pKC1139-TR3的构建，pKC1139-TR3质粒图谱如图3所示。
利用接合转移实验方法，将pKC1139-TR3质粒转化到拟无枝酸菌HM-141中，根据阿伯拉霉素抗性筛选阳性突变株，获得ROK-TR3基因敲除的基因工程菌株。
以TR3-U-F验/TR3-U-R验和TR3-D-F验/TR3-D-R验作为鉴定引物，以拟无枝酸菌基因组为对照进行PCR验证，阳性缺失突变株命名为ΔROK-TR3(见图6)。
2、构建ROK-TR3基因回补的拟无枝酸菌
用TR3-FOR/TR3-REV为引物，以拟无枝酸菌基因组DNA为模板，PCR扩增含有ROK-TR3基因自身启动子区和ORF的DNA片段，将上述片段通过Assembly试剂盒连接到pSET152质粒的XbaI/BamHI位点，获得质粒pSET152-TR3。
然后利用接合转移实验方法，将pSET152-TR3质粒转化到ΔROK-TR3菌株中，通过阿伯拉霉素抗性进行初步筛选，以阿伯拉霉素抗性基因为对象进行鉴定，以Apra-F/Apra-R作为鉴定引物，以pSET152质粒为对照进行PCR验证，获得的回复菌株命名为ΔROK-TR3/pSET152-TR3(见图7)。
3、构建ROK-TR3基因过表达的拟无枝酸菌
利用接合转移实验方法，将pSET152-TR3质粒转化到拟无枝酸菌HM-141中，通过阿伯拉霉素抗性进行初步筛选，以阿伯拉霉素抗性基因为对象进行鉴定，以Apra-F/Apra-R作为鉴定引物，以pSET152质粒为对照进行PCR验证，获得的回复菌株命名为AMY/pSET152-TR3(见图7)。
实施例4：
拟无枝酸菌及其工程菌株的发酵实验：分别用野生型拟无枝酸菌、实施例1-3构建的ΔROK-TR1、ΔROK-TR1/pSET152-TR1、AMY/pSET152-TR1、ΔROK-TR2、ΔROK-TR2/pSET152-TR2、AMY/pSET152-TR2、ΔROK-TR3、ΔROK-TR3/pSET152-TR3、AMY/pSET152-TR3菌株进行生物转化阿魏酸生产香兰素的发酵实验：
分别接种上述菌株于50mL种子培养基M1中，在30℃、200rpm培养72h，将种子液按照5％的接种量接种到5L发酵罐中(含有4L发酵培养基M2)，在30℃发酵培养，搅拌转速为800rpm，通气比为1vvm。培养24h后，加入底物阿魏酸22.5g/L或者27g/L(共90g或者108g，将阿魏酸溶于0.5M NaOH溶液中使其浓度为100g/L)，然后调节pH为8.2，继续发酵48h，发酵结束用HPLC测定发酵液中香兰素的浓度，发酵结果如下表3所示。
所述HPLC测定发酵液中香兰素方法：发酵液离心，取上清液进行HPLC分析。采用安捷伦HPLC1260分析转化产物，色谱柱为依利特Hypersil ODS2，5μm，4.6mm×250mm；检测波长295nm；柱温30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；流动相为乙腈和0.5％磷酸水溶液，0-20min，10-20％乙腈，20-30min，20-10％乙腈。
表3拟无枝酸菌及其工程菌株的发酵实验结果
实施例5：
拟无枝酸菌及其工程菌株对碳源(葡萄糖)的利用情况：分别用出发菌株拟无枝酸菌HM-141、实施例1-3构建的ΔROK-TR1、ΔROK-TR1/pSET152-TR1、AMY/pSET152-TR1、ΔROK-TR2、ΔROK-TR2/pSET152-TR2、AMY/pSET152-TR2、ΔROK-TR3、ΔROK-TR3/pSET152-TR3、AMY/pSET152-TR3菌株测定碳源(葡萄糖)的消耗：
分别接种上述菌株于50mL种子培养基M1中，在30℃、200rpm培养72h，然后按照5％的接种量将种子液转接到50mL M1培养基中，在30℃、200rpm发酵72h，发酵结束后检测发酵液中剩余的葡萄糖含量，结果如下表2所示。
上述葡萄糖含量的测定方法：利用生物传感分析仪(SBA-40E)检测葡萄糖的浓度。将25μL的1％标准葡萄糖溶液标准品注入反应池，仪器自动定标，多次反复至指示灯不闪烁，将发酵样品稀释100倍，用微量注射器将25μL待测样品注入反应池，仪器自动完成测定过程，重复三遍。
表2拟无枝酸菌及其工程菌株对碳源(葡萄糖)的消耗情况
以上结果可以看出，ROK家族中转录调控基因ROK-TR1、ROK-TR2或ROK-TR3的缺失能够有效提高拟无枝酸菌的香兰素产量。当过表达调控基因ROK-TR1、ROK-TR2或ROK-TR3时，拟无枝酸菌的香兰素产量显著低于出发菌株，表明调控基因ROK-TR1、ROK-TR2和ROK-TR3均与拟无枝酸菌的香兰素产量呈负相关。
其中，敲除拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.的ROK-TR1基因后，香兰素产量较出发菌株提高33％，在3个基因中表现最为突出，而过表达ROK-TR1基因时，香兰素产量较出发菌株降低34％。
序列表
<110> 陕西海斯夫生物工程有限公司
<120> 高产香兰素的基因缺陷型拟无枝酸菌、其构建方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1197
<212> DNA
<213> 拟无枝酸菌基因ROK-TR1(Amycolatopsis sp.)
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