氯丝菌素高产工程菌株及其构建方法
阅读说明：本技术 氯丝菌素高产工程菌株及其构建方法 (High-yield engineering strain of chlorosulicin and construction method thereof ) 是由 谭华荣 李月 张集慧 郑家珍 于 2020-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供了氯丝菌素高产工程菌株及其构建方法。本发明利用强启动子驱动氯丝菌素正调控基因的构思构建了重组工程菌株F2OE及YL04。与野生型相比,以两种不同方式构建的重组工程菌株F2OE及YL04产生的氯丝菌素水平均大幅升高,证实其为高产氯丝菌素的抗生链霉菌工程菌株。(The invention provides a high-yield engineering strain of chloramphenicol and a construction method thereof. The invention constructs recombinant engineering strains F2OE and YL04 by utilizing the concept that a strong promoter drives a positive control gene of the chloramphenicol. Compared with the wild type, the level of the chloramphenicol produced by the recombinant engineering strains F2OE and YL04 constructed in two different ways is greatly increased, and the recombinant engineering strains are proved to be streptomyces antibioticus engineering strains with high yield of the chloramphenicol.)
技术领域
本发明属于抗生素基因工程领域，具体涉及氯丝菌素高产工程菌株及其构建方法，所述工程菌株可以广泛适用于科研研究、医药、畜牧水产业及工业生产。
背景技术
链霉菌是一类高GC含量的革兰氏阳性丝状细菌，属于放线菌门链霉菌属，存在于天然土壤和腐烂植物中，也栖息在淡水，海水，海洋沉积物，动植物甚至海洋生物体内。链霉菌能够产生丰富的、种类繁多的次级代谢产物，这些次级代谢产物具有抗真菌、抗细菌、抗疟疾、抗肿瘤、抗植物病毒、杀虫等多种活性，在临床医疗、农业、畜牧业等行业具有重要的应用价值。
由于工程菌株在培养发酵等工序中需要时间，并使用大量的培养基、大型培养罐等，从菌液中回收目的成分的纯化处理也需要大量耗材，因此期望尽可能提高单位菌体赋予的目的成分的浓度，提高工程菌中对于人类有益的次级代谢产物的产生能力。因此，高产次级代谢产物的菌株有利于提高科研研究中的工作效率，降低工业生产成本。
抗生素的生物合成由一系列成簇排列的结构基因负责，且受到簇内一些途径特异性调控基因编码的调控子控制。这些途径特异性调控子与全局性调控子、多效调控子不同，属于最基础最底层调控。次级代谢产物的生物合成调控涉及到一个非常复杂的调控网络，它们可以对环境或营养因子、信号分子甚至抗生素本身或其合成途径的中间代谢产物进行应答。
氯丝菌素是一类螺环内酯聚酮类抗生素，它由抗生链霉菌(Streptomycesantibioticus Tü 99，德国DSMZ菌种保藏中心保藏号：DSM 40725，下文中也称为Streptomyces antibioticus DSM 40725)产生，1969年被首次分离。其具有抗感染、抗肿瘤、抗疟疾和对胆固醇合成抑制等活性(Lacoske，M.H.，and Theodorakis，E.A.Spirotetronate polyketides as leads in drug discovery.J Nat Prod，2015，78：562-575)。但对其的利用而言，存在现有的能够产生氯丝菌素的野生型链霉菌菌株的氯丝菌素产量较低的问题。
氯丝菌素的生物合成基因簇在2006年，由中科院上海有机所刘文研究团队克隆，并上传了该簇的DNA序列(NCBI网站https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ116941.2，GenBank编号：DQ116941.2)，解析了其生物合成途径(非专利文献1)。已知该簇含有35个与生物合成相关的基因，组成了一个具有101.8kb的DNA序列。
已知氯丝菌素生物合成途径存在特异性调控子ChlF1、ChlF2。发明人前期的工作表明，ChlF1对于氯丝菌素的合成是一个重要的激活子，它直接激活与氯丝菌素合成密切相关的乙酰辅酶A羧基转移酶编码基因chlJ的转录，并负调控自身编码基因chlF1，II型硫酯酶编码基因chlK和主动协运蛋白编码基因chlG的转录。
但发明人也发现，只有经过糖基化的氯丝菌素和其中间体才能作为信号分子对调控子ChlF1进行应答，提示信号分子的生物活性和信号分子对ChlF1的应答与氯丝菌素的糖基化之间有着某种关联(非专利文献2)。并且，在所报道的chlF1高表达菌株中，氯丝菌素产量虽然有所提高，但提高幅度并不大(不到一倍)。
另一个途径特异性调控子ChlF2则属于SARP家族调控蛋白(Streptomycesantibiotic regulatory proteins，SARPs)。SARPs是转录激活子中的一个大家族，通常含有N端OmpR型的DNA结合结构域和细菌转录激活结构域(非专利文献3)。例如天蓝色链霉菌中的ActII-ORF4、RedD以及波赛链霉菌中的DnrI都属于经典的SARP家族，它们分别调控放线紫红素、十一烷基灵菌红素和道诺霉素的生物合成(非专利文献4、5)。然而ChlF2在氯丝菌素生物合成途径中的调控机制仍不清晰。
因此，本发明人以链霉菌S.antibioticus DSM40725为研究材料，对ChlF2调控氯丝菌素生物合成的分子机制进行了研究，并建立了通过基因工程手段提高氯丝菌素的产量的方法，获得了氯丝菌素高产工程菌株。
参考文献
非专利文献
非专利文献1：Jia，X.Y.，Tian，Z.H.，Shao，L.，et al.Genetic characterizationof the chlorothricin gene cluster as a model for spirotetronate antibioticbiosynthesis.Chem Biol，2006，13：575-585)
非专利文献2：Li，Y.，Li，J.，Tian，Z.，et al.(2016)Coordinative Modulationof Chlorothricin Biosynthesis by Binding of the Glycosylated Intermediatesand End Product to a Responsive Regulator ChlF1.J Biol Chem 291，5406-5417
非专利文献3：Tanaka，A.，Takano，Y.，Ohnishi，Y.，and Horinouchi，S.AfsRrecruits RNA polymerase to the afsS promoter：a model for transcriptionalactivation by SARPs.J Mol Biol，2007，369：322-333.
非专利文献4：Arias，P.，Fernandez-Moreno，M.A.，and Malpartida，F.Characterization of the pathway-specific positive transcriptional regulatorfor actinorhodin biosynthesis in Streptomyces coelicolor A3(2)as a DNA-binding protein.J Bacteriol，1999，181：6958-6968.
非专利文献5：Tang，L.，Grimm，A.，Zhang，Y.X.，and Hutchinson，C.R.Purification and characterization of the DNA-binding protein DnrI，atranscriptional factor of daunorubicin biosynthesis in Streptomycespeucetius.Mol Microbiol，1996，5：801-13.
发明内容
本发明涉及高表达氯丝菌素的抗生链霉菌及其构建方法。
在本发明的一个实施方式中，通过同源双交换法在表达氯丝菌素的抗生链霉菌基因组中的染色体上无痕插入Pkan-kan(SEQ ID NO：5)而取代了chlK基因编码区(SEQ ID NO：6)，使得kan及chlF2的表达均在强启动子Pkan的控制之下而驱动了chlF2的高表达，最终实现使抗生链霉菌高表达氯丝菌素。
在本发明的另一个实施方式中，在表达氯丝菌素的抗生链霉菌中导入了整合型质粒，此时，抗生链霉菌染色体上的PchlK-chlK-chlF2序列(SEQ ID NO：8)不变，通过所述整合型质粒利用强启动子Pkan驱动chlK和chlF2基因的表达，最终实现使抗生链霉菌高表达氯丝菌素。
具体而言，本发明包括以下内容：
1.构建表达氯丝菌素菌株的方法，包括：
将产生氯丝菌素的链霉菌基因组中的chlK基因替换为强启动子序列，优选所述强启动子另外连接卡那霉素抗性筛选基因kan，更优选地，所述kan的序列如SEQ ID NO：4所示；
或者，所述方法包括将重组质粒转化产生氯丝菌素的链霉菌，所述重组质粒在质粒骨架中包含强启动子序列，chlK和chlF2基因的表达盒，其中优选chlK基因序列如SEQ IDNO：6所示，chlF2基因序列如SEQ ID NO：2所示。
2.项1所述的方法，其中所述强启动子选自Pkan启动子、PermE*启动子、或PkasO*启动子，优选为Pkan启动子，更优选Pkan序列如SEQ ID NO：3所示。
3.项1所述的方法，其中所述替换通过无痕敲入、重组质粒引入、重组质粒整合的方式进行。
4.项1所述的方法，其中强启动子序列如SEQ ID NO：3所示，chlK和chlF2基因的表达盒的序列如SEQ ID NO：7所示。
5.项1所述的方法，其中所述质粒骨架选自pSET152、pKC1139或pIJ10500，优选为pSET152。
6.项1所述的方法，其中所述产生氯丝菌素的链霉菌为Streptomycesantibioticus Tü 99即Streptomyces antibioticus DSM 40725。
7.项1-6任一项所述的方法产生的表达氯丝菌素菌株。
8.项7所述的表达氯丝菌素菌株在生产氯丝菌素中的应用。
为了明确氯丝菌素的调控机制，本发明人首先分别构建了chlF2的基因阻断突变株ΔchlF2和基因回补株ΔchlF2/pSET152：：Pchlk-chlK-chlF2(均使用了S.antibioticusDSM40725菌株，前者出发质粒是pKC1139，后者出发质粒是pSET152)，对这两种菌株进行了氯丝菌素产量分析，确定了chlF2在氯丝菌素生物合成中的正调控作用。
其后，通过半定量PCR实验证实基因chlK与chlF2为共转录关系，并在此基础上分别利用基因工程手段构建了以下菌株(图3A)并建立了制备高表达氯丝菌素的抗生链霉菌的方法：
在表达氯丝菌素抗生链霉菌(例如，S.antibioticus DSM40725菌株)的染色体上无痕插入Pkan-kan而取代了chlK基因编码区(SEQ ID NO：6)，从而得到了本发明的高表达氯丝菌素重组抗生链霉菌(F2OE)。
或者，构建以强启动子Pkan驱动chlK和chlF2基因的载体(整合型质粒，pSET152：：Pkan-chlK-chlF2质粒)，并导入表达氯丝菌素的抗生链霉菌(例如，S.antibioticusDSM40725菌株，以下有时简写为WT)中，从而得到了本发明的高表达氯丝菌素重组抗生链霉菌WT/pSET152：：Pkan-chlK-chlF2(YL04)。
脱氯氯丝菌素是氯丝菌素生物合成途径中的一个中间体，侧链6-甲基水杨酸和主骨架螺环内酯环都是通过I型PKS合成而来，其中6-甲基水杨酸需要通过甲基化和卤化才能成为一种被修饰的2-甲氧基-5氯-6甲基水杨酸，它与两个脱氧橄榄糖和螺环内酯结构共同构成了氯丝菌素的结构，氯丝菌素和脱氯氯丝菌素在结构上仅相差一个氯原子，在抗部分革兰氏阳性菌的活性上，氯丝菌素要强于脱氯氯丝菌素，因此获得更高活性的氯丝菌素具有重要意义。
本发明人发现，在重组抗生链霉菌(F2OE)及重组抗生链霉菌WT/pSET152：：Pkan-chlK-chlF2(YL04)中，氯丝菌素与脱氯氯丝菌素的产量均显著高于野生型。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和产品效果更加清楚，本发明提供如下附图和表格，并进行洋细说明。
图1、图1A为氯丝菌素生物合成基因簇的示意图。图1B左侧是对野生型菌株WT(S.antibioticus DSM 40725，下同)，chlF2基因敲除株ΔchlF2和基因回补株ΔchlF2/pSET152：：Pchlk-chlK-chlF2的HPLC分析，左侧上方示出了氯丝菌素的化学结构图，其中氯原子用方框标注。CHL表示氯丝菌素(Chlorothricin)，Des-CHL表示脱氯氯丝菌素(Deschloro-chlorothricin)。图1B右侧为分别以金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为指示菌对这三个菌株的HPLC流出液进行的生物活性检测结果。
图2、图2为chlK和chlF2基因共转录分析的引物设计位置示意图及半定量PCR实验的结果。其中，“+”为阳性对照，表示以基因组DNA为模板进行的PCR扩增产物；“-”为阴性对照，表示以未反转录为cDNA的RNA为模板时进行PCR扩增的产物；c表示以cDNA为模板时的PCR扩增产物。
图3、图3A为示意两种菌株中利用不同方式驱动chlF2的构建示意图，“来自pSET152载体”代表该段基因是构建在pSET152上的(pSET152载体是整合型载体，即该质粒导入后并不是游离存在的，而是会以整合的形式插入到链霉菌基因组上的attB位点上，该质粒上的DNA序列会随着染色体的复制而复制)，“来自氯丝菌素基因簇”代表各菌株基因组DNA上此段基因的排布状况；图3B为各菌株的氯丝菌素和脱氯氯丝菌素的产量的比较。
具体实施方式
通过以下实例对本发明做进一步说明。
本发明中，作为抗生链霉菌使用的是Streptomyces antibioticus Tü 99，(由上海有机所刘文研究员赠送，非模式菌株，该菌株保藏于德国DSMZ菌种保藏中心，保藏编号DSM 40725，参见非专利文献1，例如可购自中国微生物菌种查询网Http://www.biobw.org)。但是本领域人员应理解，可以产生氯丝菌素的其他菌株以及应用本说明书中的方法达到氯丝菌素产量提高效果的菌株也包括在本发明的范围内。
其中，在本发明中涉及的氯丝菌素生物合成途径特异性调控基因chlF2的基因来自抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)DSM 40725的氯丝菌素生物合成基因簇基因簇(GenBank编号：DQ116941.2)示于序列表序列No.1(SEQ ID NO：1)中。其编码的调控蛋白ChlF2的氨基酸序列示于序列表序列No.2(SEQ ID NO：2)中。
本领域技术人员应理解，对于SEQ ID NO：2所示的蛋白进行一个或者多个氨基酸的突变或修饰，例如替换、增加、缺失部分氨基酸，但是仍具有正调控氯丝菌素的功能甚至使得蛋白活性增强，这样的蛋白仍适用于本发明。且编码该多肽或蛋白的基因同样可以用于本发明，以用来构建可提高氯丝菌素产量的重组菌。
本发明所使用的启动子不限于Pkan启动子(示于SEQ ID NO：3)，也包括其它链霉菌遗传操作常用的启动子如PermE*启动子(Bibb，M.J.，White，J.，Ward，J.M.，and Janssen，G.R.The mRNA for the 23S rRNA methylase encoded by the ermE gene ofSaccharopolyspora erythraea is translated in the absence of a conventionalribosome-binding site.Mol Microbiol，1994，14：533-545.)、PkasO*启动子(Wang，W.，Li，X.，Wang，J.，Xiang，S.，Feng，X.，and Yang，K.An engineered strong promoter forStreptomycetes.Appl Environ Microbiol，2013，79：4484-4492.)等。
本发明中用于高表达chlF2的质粒不限于pSET152(购自Novegen)(Bierman，M.，Logan，R.，O′Brien，K.，Seno，E.T.，Rao，R.N.，and Schoner，B.E.Plasmid cloningvectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli toStreptomyces spp.Gene，1992，116：43-49.)，还可以是游离型高拷贝质粒如pKC1139(Kieser，T.，Bibb，M.J.，Buttner，M.J.，Chater，K.F.，and Hopwood，D.A.PracticalStreptomyces Genetics，2000，John Innes Foundation，Norwich，United Kingdom)，或其他整合型质粒如pIJ10500(Gregory，M.A.，Till，R.，and Smith，M.C.Integration sitefor Streptomyces phage phiBT1 and development of site-specific integratingvectors.J Bacteriol，2003，185：5320-5323)等，这些质粒均可购自Novegen公司。
本发明中的上述质粒可以通过接合转移技术、原生质体融合技术、电击转化、化学转化等技术整合到链霉菌基因组上。本发明优选接合转移技术，但对其他技术依然有效。
本发明所使用的重组技术可以是本领域使用的任何适宜的方法，例如将目的基因无痕敲入到菌株基因组的任何位置，将包含目的基因的重组质粒(例如，游离型高拷贝质粒pKC1139等)引入菌株，将包含本目的基因的重组质粒整合到菌体的基因组上等。
氯丝菌素及脱氯氯丝菌素产量分析
如无特殊说明，本发明中的氯丝菌素及脱氯氯丝菌素产量分析试验中均使用以下材料、条件及HPLC参数等。
菌株的发酵和培养材料：
种子培养基：采用YEME：BD公司蛋白胨0.5％，Oxoid公司酵母提取物0.3％，Oxoid公司麦芽提取物0.3％，葡萄糖1％，蔗糖20％，MgCl20.1％，蒸馏水配制，115℃灭菌30分钟。
发酵培养基采用如下配方：黄豆饼粉(冷榨，海明威公司)2％，甘露醇(海科鸿创公司)2％，CaCO3(国药集团)0.2％，蒸馏水配制，115℃灭菌30分钟。
普通培养及接合转移采用MS：黄豆饼粉(普通)2％，甘露醇2％，琼脂(strengt h＞1300)2％，蒸馏水配制，115℃灭菌30分钟。
发酵工艺：
将S.antibioticus DSM40725，或在下文步骤中构建的基于S.antibioticus DSM40725的重组菌株于MS平板上培养6天左右，待孢子成熟(呈灰黑色)后，用20％甘油制备成孢子悬浮液。
将各菌株以孢子悬浮液(30μL)接种到种子培养基YEME(50mL)中(250mL锥形瓶)。于28℃，220rpm培养48h后，按照6％的接种量进一步接种到发酵培养基中，于220rpm，28℃培养7天。发酵后将发酵液(100mL)经10000rpm、10min离心收菌丝体，弃去上清，冷冻抽干后除去水分。用30mL甲醇萃取6h后旋转蒸发除去甲醇，将得到的全部萃取物用1mL无水甲醇溶解后并过滤，进行HPLC分析。
HPLC分析条件：
采用安捷伦液相色谱进行分析，Agilent ZORBAX SB-C18 column(5μm，4.6×250mm)。
流动相A：去离子水(0.05％三氟乙酸)
流动相B：色谱级乙腈(0.05％三氟乙酸)
检测波长：222nm
流速：1ml/min
上样量：40μl
Time(min)
0.00
5.00
20.0
25.0
30.0
流动相B％
40％
40％
85％
85％
40％
抗菌活性
以枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌(均购自北京百欧博伟生物技术有限公司)作为指示菌，以本领域常规方法检测了HPLC流出液的抗菌活性。
本发明实施例中涉及的其他主要材料。
表1研究中所用的质粒
表2研究中所用的菌株
表3引物序列
实施例1.ChlF2对氯丝菌素的生物合成的正调控
1.阻断突变株ΔchlF2和基因回补株ΔchlF2/：：PchlK-chlK-chlF2的构建
阻断突变株ΔchlF2：分别选取S.antibioticus DSM40725菌株中氯丝菌素基因簇(基因簇Genbank No：DQ116941.2)中chlF2基因编码区的上游和下游序列各约1.6kb，作为用于进行同源双交换的上下游同源臂。chlF2基因编码区示于SEQ ID NO：1，ChlF2蛋白序列示于SEQ ID NO：2。
以提取的S.antibioticus DSM 40725基因组DNA为模板，分别以引物F2DML-F/R(5’-3’)和F2DMR-F/R(5’-3’)(序列示于SEQ ID NO：10、11、12、13，所有引物委托Invitrogen公司合成，下同)进行PCR，获得上、下游片段(各1.6kb)。
同时以质粒pUC119：：neo为模板，使用引物Bkan-F/R(示于SEQ ID NO：14、15)，进行PCR，获得包括卡那霉素抗性基因及其启动子的片段(Pkan-kan)。Pkan序列示于SEQ ID NO：3，kan序列示于SEQ ID NO：4，Pkan-kan序列示于SEQ ID NO：5。
针对作为PCR产物的所述上、下游片段，以及Pkan-kan序列片段分别进行HindIII/BglII、BglII/XbaI、BamHI/BglII酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。将回收的片段与已经过HindIII/XbaI酶切的温度敏感型质粒pKC1139连接，获得chlF2敲除质粒pLY201(表1)。
通过同源双交换策略将chlF2敲除质粒pLY201导入到WT菌株中，从而卡那霉素抗性筛选基因及其启动子发生插入并从染色体上删除chlF2基因，获得chlF2敲除抗生链霉菌菌株ΔchlF2。
基因回补株ΔchlF2/：：PchlK-chlK-chlF2：
同样，以提取的S.antibioticus DSM40725基因组DNA为模板，使用引物F2zspg-F/F2zspg-R(SEQ ID NO：16、17)进行PCR，得到的扩增产物为chlF2、chlK及其启动子区，共计约3.2kb(5’-3’)，即PchlK-chlK-chlF2序列，示于SEQ ID NO：8。
对上述产物片段进行XbaI/BamHI酶切后，用T4 DNA连接酶与经过同样酶切位点切割的pSET152连接，构建了基因回补质粒pSET152：：PchlK-chlK-chlF2即pLY202。将此质粒通过(大肠杆菌ET12567/pUZ8002)接合转移导入到敲除株ΔchlF2中，获得回补菌株ΔchlF2/pSET152：：PchlK-chlK-chlF2，有时也记作ΔchlF2/pLY202。
2.野生型、阻断突变株和基因回补株中的氯丝菌素产量比较
使用了HPLC进行了三种菌株的氯丝菌素产量比较，菌株的发酵，HPLC条件及参数等与具体实施方式所述的相同。
经检测，如图1B所示，在阻断突变株ΔchlF2中没有确认到属于氯丝菌素的峰，提示在chlF2敲除后的菌株中，氯丝菌素不能正常合成。而在基因回补株ΔchlF2/：：PchlK-chlK-chlF2中确认到氯丝菌素的特征峰，提示了通过chlF2基因回补，使得氯丝菌素的合成能力恢复。
根据以上结果，证明chlF2在氯丝菌素生物合成途径中是起正调控作用的基因。
发明人进一步以枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌(均购自北京百欧博伟生物技术有限公司)作为指示菌检测了野生型、阻断突变株和基因回补株利用HPLC分析时在24.9min的流出液的抗菌活性。结果显示：与HPLC分析的结果同样地，阻断突变株ΔchlF2的流出液不再具有抑制革兰氏阳性菌和金黄色葡萄球菌的活性，而基因回补株ΔchlF2/：：PchlK-chlK-chlF2的流出液具备抑菌的活性。结果见图1B。进一步证实了chlF2在氯丝菌素生物合成中具有必不可缺的重要作用。
综上所述，发明人发现，通过基因工程技术进行chlF2的敲除可导致氯丝菌素不能正常合成，而在chlF2基因回补后氯丝菌素的产量得到恢复，证实ChlF2对于氯丝菌素的生物合成起正调控作用。
实施例2.chlK和chlF2的共转录分析
发明人根据chlK与chlF2基因的ORF方向相同且在排布上紧邻，推测两个基因存在共转录的可能性。为了确定其是否存在共转录关系，进行了半定量PCR实验。
首先，提取作为野生型菌株的S.antibioticus DSM40725的RNA进行反转录，获得cDNA。分别以所述cDNA(试验组)、从菌株中提取的基因组DNA(阳性对照)、未反转录为cDNA的RNA(阴性对照)为模板，使用了内参引物B16S-F/R(SEQ ID NO：18、19，可扩增S.antibioticus DSM40725的16S rRNA编码基因内部序列)，以及用于测试chlK与chlF2的共转录的引物PF2-F/PK-R(SEQ ID NO：20、21)进行了PCR扩增。
结果显示，在以基因组DNA(阳性对照)和cDNA(试验组)为模板的PCR扩增中，使用引物B16S-F/R均获得了大小约为427bp的条带(16S rRNA)，阴性对照组没有扩增出条带。在以基因组DNA(阳性对照)和cDNA(试验组)为模板时，使用引物PF2-F/PK-R均获得了大小约为1397bp的条带，而阴性对照组中没有扩增出条带。以上结果证明，chlK与chlF2基因为共转录的关系(图2)。
实施例3.通过高表达chlF2基因提高氯丝菌素的表达
1.菌株F2OE的构建：
首先，以提取的S.antibioticus DSM 40725基因组DNA为模板，使用F2H1-F/R与F2H2-F/R(SEQ ID NO：22、23、24、25)进行PCR扩增反应，分别获得chlK基因编码区域的上、下游片段(各约2.5kb)，作为用于进行同源双交换的上下游同源臂。
以pUC119：：neo(表1)为模板，以引物Nkan-F/R(SEQ ID NO：26、27)进行PCR扩增，获得包括卡那霉素抗性基因及其启动子的片段(Pkan-kan)。Pkan-kan序列示于SEQ ID NO：5。
针对作为PCR产物的上、下游片段和Pkan-kan片段分别进行HindIII/NdeI，NdeI/XbaI，NdeI/NdeI酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。将回收的片段与已经过HindIII/XbaI酶切的温度敏感型质粒pKC1139(表1)相连接，获得质粒pLY202(表1)。
将质粒pLY202通过(链霉菌-大肠杆菌ET12567/pUZ8002)接合转移导入到S.antibioticus DSM40725菌株中进行同源双交换，获得重组菌株F2OE菌株(图3A)。
发酵工艺与使用的培养基等与实施例1中所用的相同。此时，在F2OE中，属于S.antibioticus DSM40725的染色体上的chlK基因编码区(SEQ ID NO：6)被替换为Pkan-kan。
需要说明的是，在F2OE菌株的构建中并没有外源质粒的整合，而是染色体上chlK的编码基因被删除并原位替换为Pkan-kan。
2.菌株YL04的构建：
首先，分别以pUC119：：neo质粒(表1)的DNA和S.antibioticus DSM 40725基因组DNA为模板，使用引物Gkan-F/R(SEQ ID NO：28、29)和KP-F/F2P-R(SEQ ID NO：30、31)进行PCR扩增反应，分别获得大小约为0.19kb的片段和约1.78kb的片段。对这两个片段分别进行SpeI和EcoRI酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，将回收的片段与经过XbaI/EcoRI酶切纯化的pSET152质粒(表1)相连接，获得质粒pSET152：：Pkan-chlK-chlF2(表1)。
所述质粒中包含的Pkan-chlK-chlF2的序列示于SEQ ID NO：9。
将上述构建的pSET152：：Pkan-chlK-chlF2质粒通过接合转移的方式(链霉菌-大肠杆菌ET12567/pUZ8002)导入到菌株S.antibioticus DSM40725中，获得重组菌株YL04(图3A)，发酵工艺与使用的培养基等与实施例1中所用的相同。
3.F2OE和YL04的脱氯氯丝菌素和氯丝菌素产量比较
使用HPLC检测了WT、F20E和YL04三个菌株中的脱氯氯丝菌素(des-CHL)和氯丝菌素(CHL)的产量变化，其中，使用的条件及参数同具体实施方式部分。本实验数据来自三次独立实验结果，用标准差±方差的方法表示。
结果显示，与野生型(WT)比较，在F2OE菌株中，脱氯氯丝菌素和氯丝菌素分别提高了6.3倍和54倍(图3B)。特别是，在YL04菌株中，脱氯氯丝菌素和氯丝菌素分别比野生型(WT)提高了11倍和8.4倍(图3B)。
由此可知，在F2OE菌株中，利用Pkan-kan代替了染色体中的chlK绝大部分编码区，在YL04菌株中导入了pSET152：：Pkan-chlK-chlF2质粒均提高了脱氯氯丝菌素和氯丝菌素的产量，并且在两种菌株中，氯丝菌素的产量提高效果优于脱氯氯丝菌素(图3B)。
综上所述，以上结果证明，无论使用强启动子代替染色体中的chlK编码区，或利用含有强启动子-chlK-chlF2序列的质粒的导入，两种策略均可大幅提高产生氯丝菌素的抗生链霉菌中脱氯氯丝菌素(des-CHL)和氯丝菌素(CHL)的产量。
由此，本发明人成功地得到了氯丝菌素的高表达重组抗生链霉菌，并提供了通过基因工程手段建立高表达氯丝菌素的工程菌株的方法。
工业实用性
本发明提供的重组抗生链霉菌及其建立方法可广泛应用于涉及氯丝菌素应用的例如科研工作，临床医疗、制药，农业、水产畜牧业等行业，具有重要的应用价值。
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