一种选择性高效提取富硒植物中硒代氨基酸组分的方法
阅读说明：本技术 一种选择性高效提取富硒植物中硒代氨基酸组分的方法 (Method for selectively and efficiently extracting seleno-amino acid components from selenium-rich plants ) 是由 丛欣 李洁 刘海远 徐波 祝振洲 程水源 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于有机硒提取技术领域,公开了一种选择性高效提取富硒植物中硒代氨基酸组分的方法,包括：将富硒植物粉与水混合,调节pH至8.5～9.5后超声处理；加入由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶E组成的复合酶进行酶解,所述碱性蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶E的质量比为1～2:1:1。通过特定的复合酶解体系,配合超声,提高了提取物中蛋白质含量和硒含量,并选择性提高了产物中硒代氨基酸的比例,且保证了提取物中硒代氨基酸的稳定性和活性。(The invention belongs to the technical field of organic selenium extraction, and discloses a method for selectively and efficiently extracting seleno-amino acid components from selenium-enriched plants, which comprises the following steps: mixing the selenium-rich plant powder with water, adjusting the pH value to 8.5-9.5, and then carrying out ultrasonic treatment; and adding a complex enzyme consisting of alkaline protease, trypsin and protease E for enzymolysis, wherein the mass ratio of the alkaline protease to the trypsin to the protease E is 1-2: 1: 1. The protein content and the selenium content in the extract are improved by a specific complex enzymatic hydrolysis system and ultrasound, the proportion of seleno-amino acid in the product is selectively improved, and the stability and the activity of the seleno-amino acid in the extract are ensured.)
技术领域
本发明属于有机硒提取技术领域，具体涉及一种选择性高效提取富硒植物中高活性硒代氨基酸组分的方法。
背景技术
硒是人体必需的微量元素，在体内不储藏且不能自行合成产生，必须依靠外部摄入补充。研究表明，硒不仅参与机体多种酶和蛋白质的代谢，还具有抗氧化、维持正常免疫等作用，并可以降低人的冠心病和癌症发病率等；在动物饲养领域还可以提高母猪的产仔率和产奶量，增强公猪精子的活力，在富硒同时还可以改善肉质，进而直接或间接改善人体健康。自然界中的硒的形态主要包括无机硒和有机硒，无机硒摄入过量会引起中毒现象，而有机硒安全性高，且比无机硒在更少的摄入量情况下有更着更好的吸收率。因此，植物来源的富有机硒产品已经成为硒食品深加工的热点。
植物源有机硒活性组分比如富硒多肽、小肽等的稳态获取前提是高效获得富硒植物蛋白，常用的提取方法为溶剂提取法，同时辅以搅拌、超声或冻融以及脉冲电场辅助等，但高强度长时间的脉冲或冻融处理会破坏硒蛋白结构，甚至降低高活性硒代氨基酸含量，或者使有机硒含量降低，也不利于含硒蛋白活性的保持。此外在提取溶剂选择中，如碱、酸、醇、盐等也均会不同程度对含硒蛋白性状、含硒组分稳定性产生影响。采用水作为提取剂时，虽然蛋白活性变化小，但提取效率低，只能提取游离的水溶性蛋白。
酶法提取与溶剂提取法相比，具备以下优点：反应条件温和、专一性强、副反应少，酶解产物亲水能力升高；肽链长度变短，多肽分子量降低；蛋白质的分子构象发生变化，露出分子内部的疏水基团，使得蛋白质提取纯度较高。
另外，硒在植物中主要是与蛋白质结合，通常以硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸、硒代乙硫氨酸以及其它硒-氨基酸衍生物形式存在，而在动物体内多以硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等形式存在，其中主要以硒蛋白(硒酶)形式产生抗氧化等生理活性且活性中心是硒代半胱氨酸，并形成调节性硒储存库，以硒代蛋氨酸存在于非调节性硒存储库中。目前所发现的多个具有生理活性的硒蛋白中能够在人体或动物体内发挥生理功能的仅限于含有硒代半胱氨酸的蛋白质，如谷胱甘肽过氧化物酶。因此硒代半胱氨酸被称为人体的第21种氨基酸，可以在人和动物体内特异性地参与硒蛋白合成，并成为谷胱甘肽过氧化物酶氧化还原反应的活性中心。
然而，现有技术中针对富硒植物的高活性硒代氨基酸(包括硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸)类有机硒形态的高效提取分离以及检测前处理技术还处于探索阶段。本发明的发明人在对富硒植物硒形态检测酶解前处理方法的探索中，发现不同复合酶解体系对硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸类组分的稳定性不同。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明通过特定的复合酶解体系，实现了硒代氨基酸，尤其是硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸的选择性高效提取，且保证了提取物中硒代氨基酸的稳定性和活性。
本发明的技术方案具体如下：
一种选择性提取富硒植物中硒代氨基酸组分的方法，具体包括以下步骤：
S1、将富硒植物粉与水混合，调节pH至8.5～9.5后超声处理；
S2、加入由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶E组成的复合酶进行酶解，所述复合酶用量为富硒植物粉的1～10wt％，碱性蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶E且其质量比为1～2:1:1。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S1所述富硒植物粉与水的质量比为1:10～20，pH调节剂为氢氧化钠或氢氧化钾，也可以直接使用pH符合上述条件的Tris-HCl缓冲液。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S1所述超声处理时，溶液温度为50～60℃，超声功率为150～200W，超声时间为10～30min。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S2所述酶解过程为：在50～60℃下，搅拌反应0.5～2.5h。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤S2所述酶解过程中，取酶解反应液离心过滤后，直接进行HPLC-AFS检测以实时监测硒代氨基酸组分含量。采用HPLC-AFS进行检测时，检测条件同T/CHC 1001-2019植物源高有机硒食品原料附录A。可以理解的是，本发明提供的提取方法能直接用于样品中硒形态的检测，并由此实现酶解过程中对硒代氨基酸组分含量的实时检测。
进一步地，在上述技术方案中，对步骤S2得到的酶解反应液做进一步的处理，可以得到富含硒代氨基酸组分的产品，所述处理过程如下：
酶解反应结束后对酶解反应液进行灭酶处理，离心取上清液；
在上清液中加入活性炭处理，过滤后的上清液再用纳滤膜除去无机盐；
对滤液真空浓缩，再喷雾干燥。
更进一步地，所述灭酶处理过程具体为：将酶解反应液快速将温度升至80～90℃保持10～30min，然后迅速降温至室温后进行高速低温离心取上清液；更进一步地，所述离心温度为4℃，离心速度为4000～5000r/min。
更进一步地，所述活性炭加入量为上清液质量的1～2.5wt％，处理温度为50～60℃，在搅拌条件下反应10～30min；所述过滤采用涂有硅藻土的过滤板。
更进一步地，所述真空浓缩的参数为：-0.06～-0.08MPa的真空度，60～70℃，浓缩至固形物含量25～30％。
更进一步地，所述喷雾干燥采用喷雾干燥机，且喷雾干燥机的工作参数为：进风温度140～170℃，出风温度85～100℃，进料速度控制在5.5～7L/h。
本发明的有益效果为：
1)通过特定的复合酶组合，可以在水相体系的温和条件下，充分酶解溶出植物细胞中的富硒植物蛋白成分，相比于溶剂提取，含硒蛋白含量可以提升至超过40％；同时将植物含硒蛋白酶切为硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸(以硒代胱氨酸计)，使之含量从10％～20％左右提高至40％左右，大大提高工业化应用价值。
2)超声处理可以快速将植物细胞壁打破并将植物纤维结构破坏，且可以有效去除结合在含硒蛋白上杂质，同时可促进蛋白质螺旋结构的打开，有利于复合酶的快速酶解，大大降低复合酶用量及酶解时间，并有效提高含硒蛋白提取物质量收率从10％左右提升至超过25％；实验证明，在确保含硒代半胱氨酸类组分溶出效率的基础上，将单一酶解通常反应时间由8～12h缩短至0.5～2.5h左右，而复合酶解反应也反过来有效降低超声频率以及超声时间，有效保障了提取转化获得的硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸类组分的稳定性，还大大节约生产工艺能耗和工业化应用成本。
3)在酶解过程中，可以直接取酶解反应液，经过快速简单处理(离心取上清液，再用滤膜过滤)后进行硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸的表征鉴定，有效提高生产品控效率。
4)先采用活性炭和硅藻土快速前处理，再用纳滤膜精滤；涂有硅藻土的滤板能高效除去脱色液中的各种颗粒杂质，纳滤可以除去过滤液中的无机盐成分，有效提高有机硒的比例的同时确保植物来源硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸类组分的稳定性。
附图说明
图1为硒形态混合标准溶液色谱图；
图2为复合酶酶解时间对硒形态标准样稳定性的影响。
具体实施方式
下面结合各实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
高硒代氨基酸组分含量的富硒产品的制备，包括以下步骤：
称取10kg的60目堇叶碎米荠干粉(总硒含量为1758mg/kg)，按照料液比1：10用水混合均匀，水温设定为55℃，采用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5，搅拌速度为150～200r/min，超声功率设定为200W，超声10min后，加入400g碱性蛋白酶，200g蛋白酶E和200g胰蛋白酶，酶解反应1h。
酶解反应完毕后快速升温至85℃保持10min进行灭酶，然后快速降温至20～30℃，然后采用高速低温(4℃)离心机5000r/min，离心3min，取上清液。
在上清液中添加1.5wt％的200目食品级活性炭进行脱色，脱色温度55℃，150r/min搅拌30min后，将脱色液通过均匀的涂有食品级硅藻土的300目过滤纸板，取过滤澄清液。
将过滤澄清液通过250Da的纳滤膜循环脱盐浓缩处理，然后于-0.06～-0.08MPa的真空中浓缩浓缩至固形物含量25～30％。最后用喷雾干燥机干燥，喷雾干燥机的工作参数为：进风温度140～170℃，出风温度100℃，进料速度控制在5.5～7L/h。干燥产物即为植物源富有机硒组分提取物。
共获得提取物2.82公斤，质量收率28.2％，特征成分检测数据如下表：
成分
含量
提取物组分蛋白质
45％
提取物组分总硒含量
2040mg/kg
提取物组分硒代胱氨酸占比
40.5％
提取物组分无机硒占比
3.9％
实施例2
高硒代氨基酸组分含量的富硒产品的制备，包括以下步骤：
与实施例1的区别在于，酶解反应时间为4小时，其余与实施例1相同。
共获得提取物2.7公斤，质量收率27％，特征成分检测数据如下表：
成分
含量
提取物组分蛋白质
40.5％
提取物组分总硒
1990mg/kg
提取物组分硒代胱氨酸占比
28.8％
提取物组分无机硒占比
4.2％
实施例3
高硒代氨基酸组分含量的富硒产品的制备，包括以下步骤：
与实施例1的区别在于，添加300g碱性蛋白酶、200g胰蛋白酶和200g蛋白酶E，其余与实施例1相同。
共获得提取物2.55公斤，质量收率25.5％，特征成分检测数据如下表：
成分
含量
提取物组分蛋白质
39.8％
提取物组分总硒
1966mg/kg
提取物组分硒代胱氨酸占比
37.6％
提取物组分无机硒占比
3.5％
对比例1
与实施例1的区别在于，用蛋白酶K代替蛋白酶E，复合酶解反应时间为4小时，其余与实施例1相同；
共获得提取物2.45公斤，质量收率24.5％，特征成分检测数据如下表：
成分
含量
提取物组分蛋白质
38.7％
提取物组分总硒
1956mg/kg
提取物组分硒代胱氨酸占比
9.6％
提取物组分无机硒占比
11.5％
对比例2
与实施例1的区别在于，只使用超声辅助提取且增加超声时间至1h，不使用复合酶酶解，其他步骤与实施例1相同。
共获得提取物1.12公斤，质量收率11.2％，特征成分检测数据如下表：
成分
含量
提取物组分蛋白质
15％
提取物组分总硒含量
1740mg/kg
提取物组分硒代胱氨酸占比
10.5％
提取物组分无机硒占比
4.9％
对比例3
与实施例1的区别在于，只使用单一的4wt％碱性蛋白酶，其他步骤与实施例1相同。
共获得植物有机硒提取物2.41公斤，质量收率24.1％，特征成分检测数据如下表：
成分
含量
提取物组分蛋白质
38％
提取物组分总硒含量
1789mg/kg
提取物组分硒代胱氨酸占比
20.5％
提取物组分无机硒占比
9.7％
对比例4
与实施例1的区别在于，不使用超声辅助提取，其他步骤与实施例1相同。
共获得植物有机硒提取物1.15公斤，质量收率11.5％，特征成分检测数据如下表：
对比例5
与实施例1的区别在于，使用蛋白酶K替换掉碱性蛋白酶，其他步骤与实施例1相同。
共获得植物有机硒提取物2.35公斤，质量收率23.5％，特征成分检测数据如下表：
成分
含量
提取物组分蛋白质
35％
提取物组分总硒含量
1653mg/kg
提取物组分硒代胱氨酸占比
18.5％
提取物组分无机硒占比
9.8％
在上述各实施例和对比例中，堇叶碎米荠粉的总硒含量和提取物组分的总硒含量按照GB 5009.93-2017食品中硒的测定标准进行，提取物组分蛋白质的含量通过GB5009.5-2016食品中蛋白质的测定方法进行；提取物中无机硒占比和硒代胱氨酸占比通过T/CHC 1001-2019植物源高有机硒食品原料附录A进行，具体为：取少量提取物粉末溶于水，用HPLC-AFS检测得到各种硒形态的色谱图，根据色谱图直接计算其比例。
从实施例和对比例可知，通过超声提取与复合酶酶解的协同，能显著提高提取物中蛋白质的含量和硒代胱氨酸的占比。复合蛋白酶相对于单一酶可以提高提取组分中蛋白的含量，还能通过酶切提高硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸的含量(有文献证实硒代半胱氨酸不稳定，极易转化为硒代胱氨酸，故本发明中全以硒代胱氨酸计)；且硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸在本发明的复合酶中有更高的稳定性，可以得到更高含量的硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸。
由于不同酶的酶切位点不同，酶解所得到的产物不用，如对比例1和对比例5所示，更换复合酶中酶的种类后，不仅蛋白质的提取率有所变化，更重要的是产物中硒代胱氨酸比例存在显著变化。
另外，实验发现复合酶作用时间过长，反而会导致硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸含量的下降，具体如下所示：
配置含有各种硒形态的不同浓度的硒标准溶液，采用HPLC-AFS进行检测，检测条件上(图1所示的标准溶液色谱图中，SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、Se(VI)浓度为100ng/ml，SeMet浓度为200ng/ml)。在上述标准溶液中添加复合酶(碱性蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶E的质量比为2:1:1)，图2是五种标准物质在复合酶体系中随着酶解时间的增加，其含量的变化趋势图，由图可知：硒代胱氨酸随着复合酶解时间的增加，其含量在降低，即其稳定性是随着酶解时间的增加而降低，这与实施例2的结果是一致的。推测其原因为：复合酶的长时间酶促反应造成硒代胱氨酸形态发生了转变。
需要说明的是，实施例和对比例为了方便对比，所用样品均为堇叶碎米荠粉，但本发明所述方法同样适用于其它十字花科植物，如西兰花，甘蓝等。
在本提取方法中，样品经过酶解后可将植物中的含硒蛋白成分更高效的分离出来，同时将其酶解为游离的硒氨基酸，并且游离的氨基酸其在本酶解条件下十分稳定，所以可以直接取酶解液经过离心取上清液，稀释，再用滤膜过滤等步骤处理后直接进行检测，实现对酶解过程的实时监测。
可以理解的是，本发明提供的超声提取+复合酶酶解的方法也可以直接用于检测样品中的各种硒形态的含量，具体可参考如下步骤：
1)将富硒植物粉与水混合(调节pH至8.5～9.5)，或直接与Tris-HCl缓冲液(pH同样应在8.5～9.5之间)混合，再进行超声处理10～30min；
2)加入由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶E组成的复合酶进行恒温震荡酶解，所述碱性蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶E的质量比为1～2:1:1；
3)将酶解液转移至离心管，于4000rpm离心30min，吸取上清液，稀释到合适倍数，过0.22μm滤膜。
4)将滤液用HPLC-AFS进行检测。
本发明通过以上实施例来说明本发明的技术方案，但并不局限于上述实施例；所属技术领域的技术人员应该明白，对本发明的任何改进，对本发明各产品原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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