具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。

一种电渗析制备1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐的方法，该方法包括以下步骤：

（1）采用发酵法获得腺苷蛋氨酸的酵母发酵液，所述的发酵法包括以下步骤：①将腺苷蛋氨酸产生菌接种于斜面培养基进行斜面培养；②将生长好的斜面接种于种子培养基进行种子培养；③将种子液接种至基础培养基进行好氧发酵；④当培养液糖浓度降至≤0.05g/L时，流加补糖培养基，调节发酵罐参数，使DO≥30%，补糖培养基补加流速为8～12g糖/h/L基础培养基；⑤当发酵液的生物量至0.15g/mL～0.2g/mL（湿菌体/发酵液）时，补加流速为，补加流速为0.8～1.5g蛋氨酸/h/L基础培养基；⑥发酵至48～72h时，获得腺苷蛋氨酸的酵母发酵液，下罐；

（2）获得菌体：下罐后的酵母发酵液，用陶瓷膜设备，去除大部分发酵残留培养基，至湿菌体浓度至50%～60%，获得菌液；

（3）清洗菌体：在陶瓷膜设备中，将上述菌液，加纯化水清洗，至菌体浓度至50%～60%，出水电导率＜1500μs/min；

（4）破碎菌体：采用快速升温降温法，将清洗后的菌体快速升温至70～80℃，保温15～30min后，快速降温至室温；

（5）获得腺苷蛋氨酸粗液：将上述菌体破碎液，过陶瓷膜设备，并加纯化水清洗至出水电导率＜3000μs/min，收集得到透出液；

（6）超滤除杂：将透出液通过截留分子量为5～10KD的聚醚砜材质的有机膜，收集得到滤出液；

（7）纳滤浓缩、除无机盐：将滤出液通过截留分子量为200～400D的聚酰胺材质的有机膜，收集腺苷蛋氨酸浓度在5～10g/L的截留液，获得腺苷蛋氨酸的浓缩液；

（8）电渗析成盐：向腺苷蛋氨酸的浓缩液中加入1,4-丁二磺酸钠，在电渗析装置中采用两室双极膜置换，收集物料回流液，得到1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐粗品。

（9）脱色提纯：将1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐粗品流过大孔吸附树脂，获得溶液中腺苷蛋氨酸HPLC的检测结果≥98%的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐；

（10）干燥：将高纯度的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐通过真空冷冻干燥或喷雾干燥，获得1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐的干燥品。

所述步骤（1）中所述的腺苷蛋氨酸产生菌为本领域常规使用的可以产生腺苷蛋氨酸的菌种，具体为面包酵母菌种；所述斜面培养基含有：酵母粉1%、牛肉蛋白胨2%、葡萄糖2%、琼脂2%，培养温度为25℃～35℃，培养时间24～48h；所述种子培养基含有：酵母粉1%、牛肉蛋白胨2%、葡萄糖2%，培养温度为25℃～35℃，培养时间12-24h；所述发酵基础培养基含有：硫酸铵、七水硫酸镁、七水硫酸锌、葡萄糖、磷酸二氢钾，培养温度为25℃～35℃，pH为4～6。

所述步骤（1）中补糖培养基含有：七水硫酸镁、硫酸钾、硫酸钠、葡萄糖、磷酸二氢钾；所述诱导培养基含有：七水硫酸镁、硫酸钾、硫酸钠、葡萄糖、磷酸二氢钾、蛋氨酸。

所述步骤（2）、步骤（3）和步骤（5）中陶瓷膜孔径均为20～200nm。

所述步骤（8）中的电渗析采用的膜为双极膜和阳离子交换膜二室法，输出电压为25V、输出电流为4.4A，电极液为2%～4%NaOH，出水为去离子水循环使用，置换至物料中Na+含量≤0.005%，收集物料，得到1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐粗品的浓度在10～20g/L。具体的实施原理如图1所示。

所述步骤（8）中向腺苷蛋氨酸的浓缩液中加入1,4-丁二磺酸钠，根据物料中腺苷蛋氨酸的量计算，使1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸的摩尔比在1.6～1.7之间。

所述步骤（9）中的大孔吸附树脂为一种离子交换树脂与吸附树脂的结合，是一种弱极性的吸附树脂，该树脂比表面积≥500m2/g、95%粒度在0.315～1.25mm之间。

所述步骤（9）中流过大孔吸附树脂的流速为1～2BV/h，并且该步骤所得的溶液中腺苷蛋氨酸HPLC的检测结果≥98%。

采用本发明所述的方法获得的1,4-丁二磺酸与腺苷蛋氨酸盐成品，产品纯度大于98%，总收率大于80%，S-S型异构体大于65%。

实施例1

一种1,4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，包括以下步骤：

（1）高密度发酵获得腺苷蛋氨酸：

将面包酵母菌种接种于斜面培养基30℃培养24h。斜面培养基含酵母粉1%，牛肉蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%。

用接种环挑取2～3环菌落至100mL/瓶的种子培养基,种子培养基共约1L，于30℃摇床培养12h。

发酵罐培养，于30L发酵罐中通气发酵，发酵温度28～30℃，pH控制4.8～5.2。发酵过程中当培养液糖浓度降至≤0.05g/L时，流加补糖培养基，调节发酵罐参数，使DO≥30%，补糖培养基补加流速为10g糖/h/L基础培养基；当发酵液的生物量至0.18g/mL（湿菌体/发酵液）时，补加诱导培养基补加流速为1.2g蛋氨酸/h/L基础培养基，发酵至60h时，下罐。

发酵基础培养基含有：硫酸铵，七水硫酸镁，七水硫酸锌，葡萄糖，磷酸二氢钾等。补糖培养基含有：七水硫酸镁，硫酸钾，硫酸钠，葡萄糖，磷酸二氢钾等。诱导培养基含有：七水硫酸镁，硫酸钾，硫酸钠，葡萄糖，磷酸二氢钾，蛋氨酸等。

（2）腺苷蛋氨酸粗液的制备：

将发酵液放入陶瓷膜设备中，陶瓷膜孔径为20nm，陶瓷膜设备循环液的温控控制0～10℃。同时向陶瓷膜物料桶中加入纯化水清洗菌体，直至出水电导率＜1500μs/min，该过程后获得50%浓缩湿菌体,共18.61Kg。主要目的是去除大部分发酵残留培养基，浓缩菌液。

采用快速升温降温法破碎，将清洗后的菌液快速升温至75℃，保温15min后，快速降温至室温。

破碎后的菌液迅速陶瓷膜设备中，陶瓷膜孔径为20nm，陶瓷膜设备循环液的温控控制0～10℃。至接近设备最少循环体积时，加纯化水置换，直至出水电导率＜3000μs/min，收集透出液。获得的透出液为透明的淡黄色液体，共38.31Kg，腺苷蛋氨酸含量为0.6%。

将上述透出液进行超滤和纳滤，超滤膜材质为聚醚砜材质，截留分子量为10KD。纳滤膜的材质为聚酰胺材质，截留分子量为400D，得到2.14Kg 10%的腺苷蛋氨酸浓缩液。

（3）1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液的制备：

向上步骤中制备的腺苷蛋氨酸粗液中加入1,4-丁二磺酸钠，使物料中1,4-丁二磺酸根与腺苷蛋氨酸的摩尔比为1.6，共需加入225g1,4-丁二磺酸钠。物料溶解、混匀后，加入电渗析装置的物料室中，电极液为4%NaOH，出水为去离子水。启动设备，选择二室双极膜模式，设置输出电压为25V、输出电流为4.4A，置换至物料中Na+含量≤0.005%，收集物料，得到1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液2.03Kg，此1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液中腺苷蛋氨酸浓度为10%，1,4-丁二磺酸浓度约8.7%。

（4）1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐提纯：

将上步骤中的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液以1BV/h流速过大孔吸附树脂，收集的出料为无色溶液，共2.22Kg，腺苷蛋氨酸浓度为为9%。经提纯后的溶液中腺苷蛋氨酸HPLC的检测结果≥98%。

（5）干燥：

采用真空冷冻干燥，将提纯后的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐进行干燥，得到1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐产品，共376.67g。其中1,4-丁二磺酸的含量为46.1%（干重），腺苷蛋氨酸的含量为52.1%（干重），腺苷蛋氨酸HPLC纯度为98.1%，S-S型异构体占比为70%，腺苷蛋氨酸总收率为80.3%。

实施例2

一种1,4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，包括以下步骤：

（1）高密度发酵获得腺苷蛋氨酸：

将面包酵母菌种接种于斜面培养基25℃培养48h。斜面培养基配方同实施例1。

用接种环挑取2～3环菌落至100mL/瓶的种子培养基,种子培养基共约1L，于25℃摇床培养24h。

发酵罐培养，于30L发酵罐中通气发酵，发酵温度25～28℃，pH控制4.0～4.8。发酵过程中当培养液糖浓度降至≤0.05g/L时，流加补糖培养基，调节发酵罐参数，使DO≥30%，补糖培养基补加流速为8g糖/h/L基础培养基；当发酵液的生物量至0.15g/mL（湿菌体/发酵液）时，补加诱导培养基补加流速为0.8g蛋氨酸/h/L基础培养基，发酵至72h时，下罐。

发酵基础培养基、补糖培养基及诱导培养基配方同实施例1。

（2）腺苷蛋氨酸粗液的制备：

将发酵液放入陶瓷膜设备中，陶瓷膜孔径为200nm，陶瓷膜设备循环液的温控控制0～10℃。同时向陶瓷膜物料桶中加入纯化水清洗菌体，直至出水电导率＜1500μs/min，该过程后获得60%浓缩湿菌体,共14.66Kg。主要目的是去除大部分发酵残留培养基，浓缩菌液。

采用快速升温降温法破碎，将清洗后的菌液快速升温至70℃，保温30min后，快速降温至室温。

破碎后的菌液迅速陶瓷膜设备中，陶瓷膜孔径为200nm，陶瓷膜设备循环液的温控控制0～10℃。至接近设备最少循环体积时，加纯化水置换，直至出水电导率＜3000μs/min，收集透出液。获得的透出液为透明的淡黄色液体，共35.62Kg，腺苷蛋氨酸含量为0.65%。

将上述透出液进行超滤和纳滤，超滤膜材质为聚醚砜材质，截留分子量为10KD。纳滤膜的材质为聚酰胺材质，截留分子量为400D，得到4.4Kg 5%的腺苷蛋氨酸浓缩液。

（3）1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液的制备：

向上步骤中制备的腺苷蛋氨酸粗液中加入1,4-丁二磺酸钠，使物料中1,4-丁二磺酸根与腺苷蛋氨酸的摩尔比为1.7，共需加入246g1,4-丁二磺酸钠。物料溶解、混匀后，加入电渗析装置的物料室中，电极液为2%NaOH，出水为去离子水。启动设备，选择二室双极膜模式，设置输出电压为25V、输出电流为4.4A，置换至物料中Na+含量≤0.005%，收集物料，得到1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液4.14Kg，此1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液中腺苷蛋氨酸浓度为5%，1,4-丁二磺酸浓度约4.6%。

（4）1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐提纯：

将上步骤中的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液以2BV/h流速过大孔吸附树脂，收集的出料为无色溶液，共4.76Kg，腺苷蛋氨酸浓度为为4.3%。经提纯后的溶液中腺苷蛋氨酸HPLC的检测结果≥98%。

（5）干燥：

采用喷雾干燥，将提纯后的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐进行干燥，得到1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐产品，共396.2g，其中1,4-丁二磺酸的含量为47.4%（干重），腺苷蛋氨酸的含量为50.9%（干重），腺苷蛋氨酸HPLC纯度为98.8%，S-S型异构体占比为68%，腺苷蛋氨酸总收率为81.9%。

实施例3

一种1,4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制备方法，包括以下步骤：

（1）高密度发酵获得腺苷蛋氨酸：

将面包酵母菌种接种于斜面培养基35℃培养48h。斜面培养基配方同实施例1。

用接种环挑取2～3环菌落至100mL/瓶的种子培养基,种子培养基共约1L，于35℃摇床培养48h。

发酵罐培养，于30L发酵罐中通气发酵，发酵温度30～35℃，pH控制4.8～6.0。发酵过程中当培养液糖浓度降至≤0.05g/L时，流加补糖培养基，调节发酵罐参数，使DO≥30%，补糖培养基补加流速为12g糖/h/L基础培养基；当发酵液的生物量至0.18g/mL（湿菌体/发酵液）时，补加诱导培养基补加流速为1.5g蛋氨酸/h/L基础培养基，发酵至48h时，下罐。

发酵基础培养基、补糖培养基及诱导培养基配方同实施例1。

（2）腺苷蛋氨酸粗液的制备：

将发酵液放入陶瓷膜设备中，陶瓷膜孔径为100nm，陶瓷膜设备循环液的温控控制0～10℃。同时向陶瓷膜物料桶中加入纯化水清洗菌体，直至出水电导率＜1500μs/min，该过程后获得55%浓缩湿菌体,共14.73Kg。主要目的是去除大部分发酵残留培养基，浓缩菌液。

采用快速升温降温法破碎，将清洗后的菌液快速升温至80℃，保温15min后，快速降温至室温。

破碎后的菌液迅速陶瓷膜设备中，陶瓷膜孔径为100nm，陶瓷膜设备循环液的温控控制0～10℃。至接近设备最少循环体积时，加纯化水置换，直至出水电导率＜3000μs/min，收集透出液。获得的透出液为透明的淡黄色液体，共38.80Kg，腺苷蛋氨酸含量为0.7%。

将上述透出液进行超滤和纳滤，超滤膜材质为聚醚砜材质，截留分子量为10KD。纳滤膜的材质为聚酰胺材质，截留分子量为200D，得到2.58Kg 10%的腺苷蛋氨酸浓缩液。

（3）1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液的制备：

向上步骤中制备的腺苷蛋氨酸粗液中加入1,4-丁二磺酸钠，使物料中1,4-丁二磺酸根与腺苷蛋氨酸的摩尔比为1.65，共需加入280g1,4-丁二磺酸钠。物料溶解、混匀后，加入电渗析装置的物料室中，电极液为4%NaOH，出水为去离子水。启动设备，选择二室双极膜模式，设置输出电压为25V、输出电流为4.4A，置换至物料中Na+含量≤0.005%，收集物料，得到1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液2.43Kg，此1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液中腺苷蛋氨酸浓度约为10%，1,4-丁二磺酸浓度约9%。

（4）1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐提纯：

将上步骤中的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸粗液以2BV/h流速过大孔吸附树脂，收集的出料为无色溶液，共2.45Kg，腺苷蛋氨酸浓度为为9.8%。经提纯后的溶液中腺苷蛋氨酸HPLC的检测结果≥98%。

（5）干燥：

采用喷雾干燥，将提纯后的1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐进行干燥，得到1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐产品，共458.5g，其中1,4-丁二磺酸的含量为46.4%（干重），腺苷蛋氨酸的含量为51.6%（干重），腺苷蛋氨酸HPLC纯度为98.9%，S-S型异构体占比为72%，腺苷蛋氨酸总收率为82.8%。