阅读说明：本技术 一种级联反应制备d-脂肪族氨基酸的方法 (Method for preparing D-aliphatic amino acid by cascade reaction ) 是由 倪晔 刘亚菲 许国超 韩瑞枝 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种级联反应制备D-脂肪族氨基酸的方法。本发明以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-N-氨甲酰水解酶作为催化剂,在海因酶过程级联反应中制备D-脂肪族氨基酸。本发明提供了一种D-N-氨甲酰水解酶可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D-脂肪族氨基酸,其可溶性好,催化效率高(转化率>99.9％)、立体选择性强(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好。本发明的D-N-氨甲酰水解酶催化效果佳,底物适用性广,具有很好的应用开发前景。(The invention discloses a method for preparing D-aliphatic amino acid by cascade reaction. The invention takes D-N-carbamyl hydrolase with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO.2 as a catalyst to prepare D-aliphatic amino acid in a hydantoinase process cascade reaction. The invention provides a D-N-carbamyl hydrolase which can be used as a catalyst for preparing optically pure D-aliphatic amino acid in a hydantoinase process, and has the advantages of good solubility, high catalytic efficiency (the conversion rate is more than 99.9%), strong stereoselectivity (e.e. > 99.9%), mild reaction conditions and environmental friendliness. The D-N-carbamyl hydrolase of the invention has good catalytic effect, wide substrate applicability and good application and development prospect.)

一种级联反应制备D-脂肪族氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及一种级联反应制备D-脂肪族氨基酸的方法，属于生物催化技术领域。

背景技术

D-氨基酸存在于微生物(Appl.Microbiol.Biotechnol.98,5363–5374.)，植物(Orig.Life Evolof.Biosph.,2002,32,103–127.)，和动物(Plant Soil,2012,354,21–39.)中，在制药、食品和化工行业中有着广泛用途。例如：D-丝氨酸对于兴奋性受体N-甲基-D-Asp具有激活作用，后者对于记忆的形成具有重要作用(J.Cerebr.Blood F.Met.,2014,34(12),1928-1935.)，D-丙氨酸可用于合成甜味剂Alitame，其甜度高(为蔗糖的2000倍)热值低，是一种重要的食品添加剂；D-苯甘氨酸可用作合成β-内酰胺类抗生素(Appl.Microbiol.Biotechnol.99,3341–3349.)。D-缬氨酸用作合成青霉素的核心。近年来，D-氨基酸在食品添加剂、医药中间体、以及化妆品等相关行业的需求迅速增长。全球行业分析公司在2011年发布的D-氨基酸市场报告中预测2017年全球D-氨基酸市场将超过37亿美元。其中，D-甲硫氨酸作为一种重要的手性氨基酸其作用更是广泛，例如：D-甲硫氨酸与庆大霉素可预防耳毒性发生(Inorganica chimica acta,1998,273(1-2),85-91)；与5-氟脲嘧啶可抑制胃癌细胞增殖，诱导胃癌细胞凋亡等(中华胃肠外科杂志，2002，5(3),189-192.)。因而研究D-甲硫氨酸的制备工艺具有重要意义，同时，实现D-甲硫氨酸的高效和绿色合成，对于满足市场需求和推动社会经济发展具有重要意义。

目前D-氨基酸的合成主要为酶法转化分离与不对称转化。在酶法转化分离制备研究方面已有较多的报道(WO2003044206)，制备过程一般是将DL-甲硫氨酸进行化学修饰(如接入乙酰基、氨基甲酰基、苯乙酰基等)，用相应的酶转化分离制备得到D-甲硫氨酸。酶法拆分法工艺复杂、操作条件较为苛刻；在不对称转化研究方面，Noda等(Tetrahedron:Asymmetry,2002,13(24),2649-2652.)报道了以L-氨基酸为原料，水杨醛为消旋催化剂，乙酸和甲苯为溶剂，反应得到消旋化产物，其收率82％～92％，之后以水作为溶剂，加入拆分剂D-二对甲基苯甲酰酒石酸加热反应，经过冷却析出复盐，该步骤的收率在42％～45％，后经盐酸解离制备得到D-氨基酸。Kim等(US20060173211)报道以L-甲硫氨酸为原料，加入S-2，2'-联二萘酚衍生物和三乙胺反应，能够实现将91.6％L-甲硫氨酸转化为D-甲硫氨酸，反应时间较长，需要48h左右，而且产物光学纯度不够高。廖本仁等(合成与工艺技术，2013，35(6),558-560)。以取代水杨醛为消旋化催化剂，通过加入手性有机酸助剂，实现了L-甲硫氨酸不对称转化制备得到D-甲硫氨酸，单程收率大于80％。以上这些方法普遍存在着最终产物得率低，中间物提取复杂，且产物光学纯度低等问题。因此寻找合适的制备D-甲硫氨酸和其他脂肪族氨基酸的方法是至关重要的。

海因酶过程是一个经典的多酶级联反应，包括：海因消旋酶，D/L-海因酶和D/L-氨甲酰水解酶。其中，海因消旋酶负责L-或D-海因的外消旋化，D/L-海因酶催化水解D-或L-海因生成D-或L-N-氨甲酰氨基酸，最终通过D-或L-N-氨甲酰水解酶获得D-或L-氨基酸，反应理论产率高，无中间提取和纯化步骤。该动态动力学拆分反应可实现100％的理论产率和高对映选择性，在手性氨基酸的生产制备中具有极大的应用潜力。目前报道的利用海因酶过程的方法可以实现对300mmol/L L-甲硫基乙基海因的完全转化生成相应的D-甲硫氨酸(Appl.Environ.Microbiol.,2007,73(5),1525-1531.)，仍处于一个较低的水平，因此有望开发出高效转化L-甲硫基乙基海因及其他脂肪族海因的催化反应系统。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种D-N-氨甲酰水解酶，其具有良好的可溶性，对D构型的氨甲酰氨基酸底物表现出高立体选择性，并对D-N-氨甲酰甲硫氨酸和其他脂肪族氨基酸具有高的催化活性。将其应用于海因酶级联反应制备D-脂肪族氨基酸中，催化效率高(转化率>99.9％)、立体选择性强(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好。

本发明的第一个目的是提供一种级联反应制备D-脂肪族氨基酸的方法，所述方法是以D-N-氨甲酰水解酶作为催化剂，在海因酶过程级联反应中制备D-脂肪族氨基酸，所述的D-N-氨甲酰水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的D-N-氨甲酰水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的方法具体是，以L-甲硫基乙基海因为底物，以D-N-氨甲酰水解酶、海因消旋酶和海因酶为催化剂，反应生成D-甲硫氨酸或其他脂肪族氨基酸。

进一步地，所述的L-甲硫基乙基海因的浓度为5～1000mmol/L。

进一步地，所述的D-N-氨甲酰水解酶的添加量为1～50kU/L。

进一步地，所述的海因消旋酶的添加量为1～15kU/L。

进一步地，所述的海因酶的添加量为1～20kU/L。

进一步地，所述的海因酶过程级联反应的温度为20-40℃。

在本发明中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-N-氨甲酰水解酶基因构建到pET28a为载体上，导入重组大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组菌BL21(DE3)/pET28a-CahyuC。培养重组菌，诱导获得重组的D-N-氨甲酰水解酶。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种D-N-氨甲酰水解酶可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D-脂肪族氨基酸，其可溶性好，催化效率高(转化率>99.9％)、立体选择性强(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好。本发明的D-N-氨甲酰水解酶催化效果佳，底物适用性广，具有很好的应用开发前景。

附图说明

图1为基因CahyuC的PCR扩增电泳图谱。M，Marker；1，基因CahyuC

图2为pET28a-CahyuC重组质粒物理图谱。

图3为重组D-N-氨甲酰水解酶的蛋白电泳图。M，Marker；泳道1、2、3分别为重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-CahyuC诱导后上清、沉淀，纯化后电泳图。

图4为D-N-氨甲酰水解酶的选择性分析液相检测图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：D-氨甲酰水解酶基因的克隆

采用一步克隆法克隆节杆菌中的D-N-氨甲酰水解酶基因。

(1)首先使用LB培养基，于37℃下过夜培养上述节杆菌。离心获得菌体后，使用常规细菌基因组提取试剂盒获得基因组总DNA。

(2)根据已报道的D-N-氨甲酰水解酶基因设计简并引物(上游引物SEQ ID NO.3：CAGCAAATGG GTCGCGGATCCATGACCCGTATCGTCAATGTCG，下游引物SEQ ID NO.4：TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACTTAGTGGCTGGC CGACCA)，以水从毛单胞菌基因组为模板进行PCR，体系如下(μL)：10×PCR Mix 10，上游引物0.2，下游引物0.2，基因组0.2，DNA聚合酶0.2，dd H₂O 9.2。PCR程序为：95℃预变性10min，95℃裂解30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环29次，72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，并利用琼脂糖胶回收试剂盒回收500～1000bp区间的条带(图1)，即D-N-氨甲酰水解酶基因。所得D-N-氨甲酰水解酶基因命名为CahyuC，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：全长960bp，其起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。序列中无内含子，编码序列从第1个核苷酸起至960个核苷酸止，所编码的蛋白质序列如SEQ IDNo.2所示。

实施例2：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-CahyuC的构建及培养

用限制性内切酶BamH I和Sal I将质粒pET28a和CahycC于37℃水浴中酶切反应3h，次日经琼脂糖凝胶电泳纯化并利用琼脂糖回收试剂盒回收目标片段。37℃下，使用一步克隆法将基因CahyuC与酶切过的质粒pET28进行连接，即得重组表达载体pET28a-CahyuC(图2)。将构建好的重组表达载体pET28a-CahyuC转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布含卡那霉素抗性LB固体平板，过夜培养后进行菌落PCR验证，阳性克隆子即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-CahyuC。挑取阳性克隆子于LB培养基中过夜培养，次日按2％转接量转接入新鲜LB培养中，培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.2mmol·L^-1IPTG，30℃诱导培养6小时后，4℃、8000r/min离心10min收集菌体。将收集好的菌体悬浮于Tris-HCl缓冲液(100mmol·L^-1，pH 8.0)中，超声破碎，并通过SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(图3)。由图3可知，目的蛋白基本都在上清中，说明重组酶在大肠杆菌中成功得到可溶表达。

实施例3：D-N-氨甲酰水解酶的分离纯化

悬浮重组细胞于A液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1咪唑，pH7.4)中，超声波破碎离心后获得粗酶液。纯化所使用的柱子为亲和柱HisTrap HP crude(镍柱)，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和结合来完成。首先使用A液将镍柱平衡，粗酶液上样，继续使用A液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^{- 1}NaCl，1000mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组D-N-氨甲酰水解酶。对纯化后的蛋白进行酶活力测定(DL-N-氨甲酰色氨酸为底物)及SDS-PAGE分析(图3)。由图3可知，镍柱纯化后，在38kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。之后使用His Trap Desalting脱盐柱(GE Healthcare)将纯化后的D-N-氨甲酰水解酶置换到Tris-HCl(100mmol·L^-1，pH 8.0)缓冲液中，进行下一步酶学性质分析。

实施例4：D-N-氨甲酰水解酶的酶活力测定

测定D-N-氨甲酰水解酶对底物DL-N-氨甲酰甲硫氨酸的酶活力。测定体系为：适量酶液、10mmol·L^-1DL-N-氨甲酰色氨酸。于30℃静置反应10min。反应结束后，取样进行液相检测。液相检测条件：色谱柱为Diamonsil Plus C18(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(25：75)，流速为0.2～1mL·min^-1,检测波长为210nm。

酶活力单位定义(U)：

在30℃下，D-N-氨甲酰水解酶催化底物DL-N-氨甲酰甲硫氨酸生成1μmol的D-甲硫氨酸所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。

实施例5：底物谱分析

测定D-N-氨甲酰水解酶(CaHyuC)催化不同的DL-N-氨甲酰氨基酸的酶活力，以DL-N-氨甲酰色氨酸为底物测得的酶活力为100％对照，其他底物测得的酶活力以二者的百分比计算。测定结果如表1所示。

表1 NiHyuC的底物谱

表1显示，CaHyuC不仅能够催化DL-N-氨甲酰甲硫氨酸，同时能够催化其他脂肪族的氨基酸，例如对DL-N-氨甲酰缬氨酸，DL-N-氨甲酰亮氨酸，DL-N-氨甲酰异亮氨酸的相对活力分别为DL-N-氨甲酰甲硫氨酸的112％，60％和55％，同时对芳香族底物也显示出了催化活性，对DL-N-氨甲酰色氨酸，DL-N-氨甲酰苯丙氨酸和DL-N-氨甲酰苯甘氨酸，DL-N-氨甲酰邻氯苯甘氨酸的相对活力为DL-N-氨甲酰甲硫氨酸的66.5％，39.0％和3.18％。

实施例6：最适pH

配制100mmol·L^-1不同pH的缓冲液：Tris-HCl(7.0～9.0)、磷酸钠缓冲液(pH 6.0～8.0)、甘氨酸–NaOH缓冲液(pH 8.0～10.0)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.5～10.5)。然后以DL-N-氨甲酰甲硫氨酸为底物，测定CaHyuC在不同pH缓冲液的相对酶活力。CaHyuC的最适反应pH为7.0～9.0，酶活力为0.6～0.8U·mg^–1.。在pH为9.5～10.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，酶活力降至20％以下。

实施例7：最适反应温度

分别以DL-N-氨甲酰甲硫氨酸为底物，测定CaHyuC在不同温度(20～55℃)下的酶活，测得的最高酶活力定为100％，其他温度下测得的酶活力以相对于最高活力的百分比计算。结果显示CaHyuC的最适反应温度为25～35℃，为0.7～1.2U·mg^–1。

实施例8：动力学参数分析

测定CaHyuC对底物DL-N-氨甲酰-色氨酸的动力学参数。动力学参数测定体系列举如下：Tris-HCl缓冲液(100mmol·L^-1，pH 8.0)，DL-N-氨甲酰-色氨酸(0～20mmol·L^-1)。通过计算比酶活力来表征反应速率，从而计算动力学参数。测定的CaHyuC对底物DL-N-氨甲酰-甲硫氨酸的动力学参数分别为K_m为0.55mmol·L^-1，V_max为1.0μmol·min^–1·mg^–1。

实施例9：立体选择性分析

测定CaHyuC催化底物DL-N-氨甲酰水解酶的选择性。反应体系(10mL)为：适量纯化的酶液、10mmol·L^-1DL-N-氨甲酰-甲硫氨酸。于30℃反应30min。反应结束后，取样进行液相检测。检测条件：Astec CHIROBIOTICTM T色谱柱(15cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为甲醇：水(40：60)，流速为0.2～1mL/min。由图4可知，该酶具有非常好的立体选择性，仅有D-甲硫氨酸生成。

实施例10：D-N-氨甲酰水解酶应用于海因酶过程制备D-甲硫氨酸

取2～500U所得的重组D-N-氨甲酰水解酶和2～500U的海因消旋酶(AaHyuA)、1～25U D-海因酶(AtHyuH)于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，加入5-20％PEG400，10～500mmol·L^-1L-甲硫基乙基海因(表2)，反应液总体积为10mL。将反应置于20～40℃下，取样检测转化过程，条件如下：Diamonsil Plus C18色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(10～30：90～70)，流速为0.5～1mL/min。在1L级别进行反应制备D-甲硫氨酸，添加20kU AaHyuA，15kU AtHyuH和50kUCaHyuC，500mmol L-甲硫基乙基海因(114.5g)，5％PEG400至于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，搅拌至反应结束。反应结束后加入盐酸终止反应，离心经阳离子交换树脂纯化得到D-甲硫氨酸。

表2 D-氨甲酰水解酶应用于海因酶过程制备D-甲硫氨酸

实施例11：D-N-氨甲酰水解酶应用于海因酶过程制备D-缬氨酸

取2～500U所得的重组D-N-氨甲酰水解酶和2～500U的海因消旋酶(AaHyuA)、1～25U D-海因酶(AtHyuH)于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，加入5-20％PEG400，10～500mmol·L^-1L-异丙基海因(表2)，反应液总体积为10mL。将反应置于20～40℃下，取样检测转化过程，条件如下：Diamonsil Plus C18色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(10～30：90～70)，流速为0.5～1mL/min。在1L级别进行反应制备D-缬氨酸，添加20kU AaHyuA，15kU AtHyuH和50kU CaHyuC，500mmol L-异丙基海因(71g/L)，5％PEG400至于Tris-HCl缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，搅拌至反应结束。反应结束后加入盐酸终止反应，离心经阳离子交换树脂纯化得到D-缬氨酸。

表3D-氨甲酰水解酶应用于海因酶过程制备D-缬氨酸

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种级联反应制备D-脂肪族氨基酸的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 960

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgacccgta tcgtcaatgt cgccctgggc caactgggtc cggtgcagaa ggccgactcc 60

cgcgccagcg tggtgcgccg cctgtgcgcc atgatgcgcg aggcccacag cctgggggcg 120

gatgtcatcg tctaccccga gctggcgctg accaccttct tcccgcgctg gtacatcgag 180

gacgtggccg agctgcaccg ctactacgag cgcagcatgc cgaatgccga tacgcagccg 240

ctgttcgacc tggcgcgcac cctgggcatc ggcttttacc tgggttacgc cgagctggcc 300

gaagagggtg cggccctggt gcagtacaac accgccatcc tggtggaccg cacgggttca 360

atagtgggca agtaccgcaa gatccatgtg cccggccatt tcgagcacga gccctggcgc 420

cagtttcagc acctggaaaa gcgctatttc acacctggca agtccttcga tgtgtaccag 480

gcctttggcg gcaccgtggg catggcgctg tgcaacgacc gccgctgggc cgagagctac 540

cgcgtgatgg cgctgcaggg ggcggagatg atcttcatcg gctacaacac gccggtgcac 600

aacgcccccg cgccgcagca cgacgacctg tcgctgttcc acaaccagct gtccgtgcag 660

gccggggcct accagaacgg ctgctgggtg gccagcgtcg ccaagggcgg ggtggaagag 720

ggcgtggaca gcattgccgg cagcctgctg gtggcgccca gcggcgaggt ggtggcacgc 780

tgcgtgacca agggcgacga ggtggtgctg ggccgggccg acctggattt ctgcgccgtc 840

tacaagcgca ccaccttcaa cttcgacctg caccgccacc ccgagtgcta tggcctgatc 900

acgcagaaga agggggaaac cctggcggcc gacggcacgc cgtggtcggc cagccactaa 960

<210> 2

<211> 319

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Thr Arg Ile Val Asn Val Ala Leu Gly Gln Leu Gly Pro Val Gln

1 5 10 15

Lys Ala Asp Ser Arg Ala Ser Val Val Arg Arg Leu Cys Ala Met Met

20 25 30

Arg Glu Ala His Ser Leu Gly Ala Asp Val Ile Val Tyr Pro Glu Leu

35 40 45

Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Tyr Ile Glu Asp Val Ala Glu

50 55 60

Leu His Arg Tyr Tyr Glu Arg Ser Met Pro Asn Ala Asp Thr Gln Pro

65 70 75 80

Leu Phe Asp Leu Ala Arg Thr Leu Gly Ile Gly Phe Tyr Leu Gly Tyr

85 90 95

Ala Glu Leu Ala Glu Glu Gly Ala Ala Leu Val Gln Tyr Asn Thr Ala

100 105 110

Ile Leu Val Asp Arg Thr Gly Ser Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile

115 120 125

His Val Pro Gly His Phe Glu His Glu Pro Trp Arg Gln Phe Gln His

130 135 140

Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Thr Pro Gly Lys Ser Phe Asp Val Tyr Gln

145 150 155 160

Ala Phe Gly Gly Thr Val Gly Met Ala Leu Cys Asn Asp Arg Arg Trp

165 170 175

Ala Glu Ser Tyr Arg Val Met Ala Leu Gln Gly Ala Glu Met Ile Phe

180 185 190

Ile Gly Tyr Asn Thr Pro Val His Asn Ala Pro Ala Pro Gln His Asp

195 200 205

Asp Leu Ser Leu Phe His Asn Gln Leu Ser Val Gln Ala Gly Ala Tyr

210 215 220

Gln Asn Gly Cys Trp Val Ala Ser Val Ala Lys Gly Gly Val Glu Glu

225 230 235 240

Gly Val Asp Ser Ile Ala Gly Ser Leu Leu Val Ala Pro Ser Gly Glu

245 250 255

Val Val Ala Arg Cys Val Thr Lys Gly Asp Glu Val Val Leu Gly Arg

260 265 270

Ala Asp Leu Asp Phe Cys Ala Val Tyr Lys Arg Thr Thr Phe Asn Phe

275 280 285

Asp Leu His Arg His Pro Glu Cys Tyr Gly Leu Ile Thr Gln Lys Lys

290 295 300

Gly Glu Thr Leu Ala Ala Asp Gly Thr Pro Trp Ser Ala Ser His

305 310 315

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

cagcaaatgg gtcgcggatc catgacccgt atcgtcaatg tcg 43

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

tgcggccgca agcttgtcga cttagtggct ggccgacca 39