阅读说明：本技术 双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽及其制备方法 (Active polypeptide in lactobacillus plantarum fermentation liquor by aqueous two-phase extraction and preparation method thereof ) 是由 丛丽娜 王晓坤 张靖轩 何媛媛 徐放 于 2021-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物活性肽的提取技术领域,具体公开了一种双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽及其制备方法,具体包括：植物乳杆菌发酵培养,将发酵液离心得到上清液；采用无水乙醇和硫酸铵配制双水相萃取体系；将发酵上清液加入到所获得的双水相萃取体系中进行萃取,静置分液成两相后,收集上相萃取液；向收集的上相萃取液中加入其体积2.5倍的无水乙醇,析出无机盐后,离心分离得到纯化的上清液；将纯化上清液使用旋转蒸发仪干燥浓缩后,得到活性多肽。本发明与传统分离手段相比,避免了挥发性有机溶剂的使用,整个过程无毒无害,提取的活性多肽具有更高抑菌活性,提取产品可用于食品和药品生产,能带来巨大的社会效益和经济效益。(The invention belongs to the technical field of extraction of bioactive peptides, and particularly discloses an active polypeptide in lactobacillus plantarum fermentation liquor extracted by two aqueous phases and a preparation method thereof, wherein the preparation method specifically comprises the following steps: fermenting and culturing lactobacillus plantarum, and centrifuging fermentation liquor to obtain supernatant; preparing a double aqueous phase extraction system by adopting absolute ethyl alcohol and ammonium sulfate; adding the fermented supernatant into the obtained aqueous two-phase extraction system for extraction, standing and separating the solution into two phases, and collecting the upper phase extract; adding absolute ethyl alcohol with the volume 2.5 times of that of the collected upper phase extraction liquid into the collected upper phase extraction liquid, separating out inorganic salt, and performing centrifugal separation to obtain purified supernatant liquid; and drying and concentrating the purified supernatant by using a rotary evaporator to obtain the active polypeptide. Compared with the traditional separation means, the method avoids the use of volatile organic solvent, the whole process is non-toxic and harmless, the extracted active polypeptide has higher bacteriostatic activity, and the extracted product can be used for food and medicine production and can bring huge social benefit and economic benefit.)

双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物活性肽的提取技术领域，特别是一种双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽及其制备方法。

背景技术

当今世界，随着科技进步，经济的快速发展，人民生活水平的提高，对卫生健康及药品医疗提出了更高的要求。应用于食品行业中的化学防腐剂效果虽好，但是越来越多的研究报道反映出其越来越多的副作用，其安全性受到各方面的质疑。因此，我们需要开发出一种新的安全无毒生物防腐剂，以应对人们对卫生安全提出更高更严格的要求。

研究已证明，由植物乳杆菌发酵所产生的多肽类活性物质(即植物乳杆菌素，一种细菌素)对生产、生活中常见的致病菌具有较高的抗性作用。近几年相关研究已发现，植物乳杆菌素具有抑菌谱广、抗逆性强、不易产生抗性、几乎没有副作用等优点，尤其它的抗菌谱比由乳酸链球菌产生的细菌素Nisin更为广泛。Nisin是目前被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的唯一一个用于食品防腐剂的细菌素，目前已广泛应用于食品加工领域。但Nisin只能抑制食品中革兰氏阳性菌的生长，对革兰氏阴性菌基本无影响，而植物乳杆菌素无论是对革兰氏阳性菌、还是对革兰氏阴性菌，其抑菌活性都非常强。但是作为发酵产物，植物乳杆菌素的提取难度相对较大，产率较低。因此，目前除了细菌素Nisin被规模化提取出来，其它仍旧停留在实验研究阶段。

目前研究中常用的细菌素提取方法为有机物萃取、分子筛柱层析、AKTA离子交换层析等。使用这些方法虽然能分离出来部分细菌素，但是整体过程耗时长、操作复杂、成本高，而且涉及到多种有机溶剂的使用。因此，这些方法仅适合于实验室提取分离，但无法应用于工业化规模生产。所以，如何能将植物乳杆菌发酵生产的活性多肽物质简便、快速地提取出来，这是影响其能否真正应用到实际生产中的关键技术因素。

双水相体系是指将两种水溶性物质混合后，在一定比例下出现自发分离成互不相溶的两相体系。利用目标物质在两相之间的选择性分配实现分离，因目标物质的物理性质及环境因素，其在上下两相中的分布不同，从而进行萃取。在萃取过程中，分子间氢键、盐析作用、电荷相互作用、范德华力、聚合现象、疏水作用、界面性质作用等都发挥重要作用。较之传统萃取方法，双水相萃取条件温和，不易引起蛋白质的变性失活，避免有机溶剂残留的问题。而且双水相萃取具有较高的生物相溶性，对设备要求较低，操作简单，易于放大生产。因此，双水相萃取作为一种新型的分离提取方法在多个领域发挥着重要作用，其对物质的组分分离与富集有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种有效、安全的提取方法，提高其生产效率，降低生产操作难度，减少时间和成本的消耗的双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽及其制备方法。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

本发明的第一个目的是要提供一种双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽的方法，包括以下步骤：

S1、植物乳杆菌发酵培养，将发酵液离心得到上清液；

S2、采用无水乙醇和硫酸铵配制双水相萃取体系，其中双水相萃取体系中无水乙醇的体积浓度为32-36％，硫酸铵的质量体积比为20-24％；

S3、将上述步骤S1获得的发酵上清液加入到步骤S2获得的双水相萃取体系中进行萃取，静置分液成两相后，收集上相萃取液；

S4、向步骤S3收集的上相萃取液中加入其体积2.5倍的无水乙醇，析出无机盐后，离心分离得到纯化的上清液；

S5、将步骤S4的纯化上清液使用旋转蒸发仪干燥浓缩后，得到活性多肽。

进一步地，所述步骤S1中，植物乳杆菌发酵培养方法为：将植物乳杆菌活化菌液接种于MRS发酵培养基中，在37℃、180r/min的条件下发酵培养48h。

进一步地，所述步骤S1中，发酵液离心是在转数为8000r/min的离心机中进行固液分离，离心时间10min。

进一步地，所述步骤S3中，发酵上清液与双水相萃取体系体积百分比为50-58％，所述双水相萃取体系pH为3.5-4.0，萃取温度为55-65℃，萃取时间为30-60min。

进一步地，所述步骤S4中，离心分离是在转数为5000r/min的离心机中离心处理5min。

进一步地，所述步骤S5中，旋转蒸发仪干燥温度为65℃，压力0.1Mpa。

进一步地，每升MRS发酵培养基包括以下组分：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，含水醋酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，所述MRS发酵培养基的pH为6.2-6.6。

本发明的第二个目的是要提供一种利用上述双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽的方法制得的活性多肽。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用乙醇和硫酸铵双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽物质，具有较好的分离提取作用和较高的提取效率。与传统分离手段对比具有工艺简单、耗时短、成本低等优点。

(2)本发明萃取后的有机物及盐可以富集回收，循环再利用，而且无副产物，提供了一种绿色的、节能的、高效的提取手段。

(3)本发明与传统分离手段相比，避免了挥发性有机溶剂的使用，整个过程无毒无害，提取的活性多肽具有更高抑菌活性，提取产品可用于食品和药品生产，能带来巨大的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为本发明的双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽的过程示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

实施例1

参照图1，在100mL的萃取总体系中，首先取50mL发酵上清液，加入34％(v/v)的无水乙醇34mL，在搅拌下缓慢逐步加入研细烘干的22％(m/v)的硫酸铵22g，继续搅拌至完全溶解，调节该体系的pH为3.75，最后用发酵上清液定容至100mL，并形成上下两相双水相体系。在60℃条件下萃取30min，发酵液中目标物质在两相中进行萃取再分配。经双水相萃取后，收集上相(乙醇水溶液)液体并测量体积，再加入2.5倍无水乙醇，搅拌抽提10min，除盐有少量沉淀产生。再离心5000r/min、5min，收集提取液体。最后将该提取液经旋转蒸发仪浓缩干燥，其干燥温度为65℃，压力为0.1Mpa，即得到纯化的活性多肽物质。经生物活性分析测定，这个过程提取总收率为92.3％。

实施例2

参照图1，在100mL的萃取总体系中，首先取50mL发酵上清液，加入32％(v/v)的无水乙醇32mL，在搅拌下缓慢逐步加入研细烘干的20％(m/v)的硫酸铵20g，继续搅拌至完全溶解，调节该体系的pH为3.75，最后用发酵上清液定容至100mL，并形成上下两相双水相体系。在60℃条件下萃取30min，发酵液中目标物质在两相中进行萃取再分配。经双水相萃取后，收集上相(乙醇水溶液)液体并测量体积，再加入2.5倍无水乙醇，搅拌抽提10min，除盐有少量沉淀产生。再离心5000r/min、5min，收集提取液体。最后将该提取液经旋转蒸发仪浓缩干燥，其干燥温度为65℃，压力为0.1Mpa，即得到纯化的活性多肽物质。经生物活性分析测定，这个过程提取总收率为71.6％。

实施例3

参照图1，在100mL的萃取总体系中，首先取50mL发酵上清液，加入36％(v/v)的无水乙醇36mL，在搅拌下缓慢逐步加入研细烘干的24％(m/v)的硫酸铵24g，继续搅拌至完全溶解，调节该体系的pH为3.75，最后用发酵上清液定容至100mL，并形成上下两相双水相体系。在60℃条件下萃取30min，发酵液中目标物质在两相中进行萃取再分配。经双水相萃取后，收集上相(乙醇水溶液)液体并测量体积，再加入2.5倍无水乙醇，搅拌抽提10min，除盐有少量沉淀产生。再离心5000r/min、5min，收集提取液体。最后将该提取液经旋转蒸发仪浓缩干燥，其干燥温度为65℃，压力为0.1Mpa，即得到纯化的活性多肽物质。经生物活性分析测定，这个过程提取总收率为69％。

对比例1

有机试剂萃取法：取发酵上清液100mL，与乙酸乙酯按照1:1.5的比例混合，于20℃下搅拌萃取12h，利用分液漏斗将发酵液与有机萃取液分离。收集该有机萃取液，并经旋转蒸发仪浓缩干燥，其干燥温度为65℃，压力为0.1Mpa，即得到纯化的活性多肽物质。

分别取实施例1和对比例1得到纯化的活性多肽样品50mg，分别用5mL无菌水溶解，以几种常见的食品加工和水产养殖过程的致病菌作为指示菌，采用滤纸片法进行抑菌活性测定。即在固体培养基平皿上，接种100μL的待测指示菌培养液并涂布均匀。将滤纸片贴放在平皿中，往纸片上注入10μL的样品溶液，将该平皿进行培养后，最终测量抑菌圈大小。

实施例1和对比例1得到纯化的活性多肽样品的抑菌活性的比较如表1所示。

表1

由表1可知，本发明制得的活性多肽与常规有机试剂萃取法制得的活性多肽相比，具有更高抑菌活性。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。