具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如附图1所示，在本发明的一个实施例中，提供了一种检测伪结核棒状杆菌抗体的检测卡，其包括：

缓冲液垫2；以及

硝酸纤维素膜4，设置在所述缓冲液垫2的一侧；所述硝酸纤维素膜4与所述缓冲液垫2之间设置有胶体金垫3；所述硝酸纤维素膜4上远离所述胶体金垫3的一端依次设置有用抗原蛋白划的测试线7以及用第二抗体划的质控线8；

其中，所述抗原蛋白为伪结核棒状杆菌重组磷脂酶D蛋白；所述胶体金垫3上附着有胶体金联接的兔抗羊IgG抗体。

具体的，第二抗体具有双重性，既可以作为抗体与相应抗原结合，也可以作为抗原再制备相应抗体；在本发明实施例中，第二抗体可以采用伪结核棒状杆菌IgG抗体；硝酸纤维素膜4可以采用微孔硝酸纤维素膜，伪结核棒状杆菌重组磷脂酶D蛋白可以通过物理吸附的方式固定于微孔硝酸纤维素膜上；其中，伪结核棒状杆菌重组磷脂酶D蛋白是伪结核棒状杆菌主要毒力因子，该蛋白含有伪结核棒状杆菌主要属、亚属和次要的种特异性抗原决定簇，可以作为诊断抗原。

在实际应用中，伪结核棒状杆菌的重组PLD蛋白的核苷酸序列为：ATGAGGGAGAAATTTGCTTTATTATTATCAATAATTATGGCAATCATGCTTCCGGTAGGGAATGCAGCTGCAGCGCCTGTTGTACATAACCCAGCTTCTACAGCAAATCGGCCAGTCTATGCGATTGCCCACCGCGTTTTAACCACTCAAGGCGTGGATGACGCAGTTGCGATCGGTGCGAATGCGTTGGAAATTGACTTCACTGCGTGGGGTCGTGGCTGGTGGGCAGATCATGATGGTATTCCTACTAGTGCAGGTGCTACTGCAGAGGAAATTTTTAAGCATATAGCTGATAAGCGTAAGCAGGGGGCAAATATTACTTTCACCTGGCTTGACATCAAGAATCCAGACTACTGCAGGGATGCTCGTAGTGTGTGCTCCATAAATGCGTTGCGTGATTTGGCACGTAAATATCTTGAGCCAGCAGGGGTTCGAGTTCTCTATGGGTTCTATAAGACAGTCGGTGGACCTGCCTGGAAGACAATCACCGCTGATCTTCGGGATGGCGAGGCAGTAGCTCTTAGCGGCCCGGCGCAGGACGTATTAAATGATTTTGCAAGGTCTGGAAATAAGATCCTTACTAAACAAAAAATCGCTGACTATGGTTACTACGACATTAACCAAGGGTTTGGTAACTGCTATGGAACCTGGAATAGGACTTGTGATCAACTCCGTAAGTCCAGCGAAGCTCGTGACCAAGGAAAACTCGGTAAAACTTTTGGGTGGACAATCGCTACAGGTCAGGACGCGCGAGTTAATGATCTTTTAGGAAAAGCCAACGTAGATGGGCTGATCTTTGGCTTTAAGATGACTCACTTCTACCGTCATCCAGACACCGAAAATTCTTTCAAAGCCATCAAGAGGTGGGTGGATAAGCACTCCGCTACTCACCATCTGGCTACCGTAGCGGATAACCCGTGGTGA，具体如序列表SEQ ID NO:1所示；该伪结核棒状杆菌的重组PLD蛋白可以参考以下制备方法制成：设计合成引物（上游引物：5'-CGCGGATCCATGAGGGAGAAAGTTGTTTTATTCT-3'，如序列表SEQ ID NO:2所示；下游引物：5'-CCGCTCGAGCCACGGGTTATCCGCTACGGTAGCC-3'，如序列表SEQID NO:3所示），以伪结核棒状杆菌陕西分离株基因组为模板，通过PCR扩增得到PLD蛋白的扩增产物，扩增产物连接其表达载体并同时进行双酶切，然后连接，构建重组质粒；将挑选的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得阳性重组质粒单克隆菌，阳性重组质粒单克隆菌在IPTG诱导下进行蛋白表达得到诱导产物，诱导产物依次经裂解沉淀、纯化及六阶段梯度复性后得到重组PLD蛋白。

需要说明的是，缓冲液垫2以及硝酸纤维素膜4均可设置在底板1上，底板1的材质具体可以采用聚氯乙烯等高分子材料，但不限于此。

在本发明实施例中，结合了分子生物学、免疫生物学及物理分离技术的有关原理，通过将免疫胶体金技术应用到羊伪结核病的快速诊断中，其可以在养殖现场由非专业实验人员操作，并在十多分钟就能得到检测判断结果，可有效检测出羊（包括山羊、绵羊）血清或全血中的伪结核棒状杆抗体。

如附图1和2所示，在本发明的一个优选实施例中，所述缓冲液垫2上设置有用于添加缓冲液的缓冲液孔；所述硝酸纤维素膜4上设置有用于添加待检测样本的样本孔6，且所述样本孔6位于所述测试线7与所述胶体金垫3之间；另外，所述硝酸纤维素膜4上还设置有用于防止反应液回流的蒸发孔。

在本发明实施例中，通过设计分离的样本孔6和缓冲液孔，使样本中的抗体可以优先和硝酸纤维素膜4上的抗原反应，从而可以提高检测的敏感度；此外，本发明实施例通过设置蒸发孔，可以防止反应液回流，从而可以使反应更加充分。

在本发明的一个优选实施例中，所述胶体金垫3为玻璃纤维素膜，但不限于此，也可以采用其他纤维素膜或有机高分子膜。

在实际应用中，可以先将兔抗羊IgG抗体与胶体金微球联接构成免疫胶体金，然后将联接物干燥附着在胶体金垫3上。

如附图1所示，在本发明的一个优选实施例中，检测卡还包括：

吸水滤纸5，设置在所述硝酸纤维素4膜远离所述缓冲液垫2的一侧。

通过吸水滤纸5的设置，便于将反应液朝测试线7和质控线8的方向进行引流。

在本发明的另一个实施例中，还提供一种上述的检测卡在制备用于检测伪结核棒状杆菌抗体的试剂盒中的应用以及提供了一种检测伪结核棒状杆菌抗体的试剂盒。

具体的，该试剂盒包括检测卡，以及还可包括干燥剂、定量采样管、缓冲液、产品说明书等。其中，缓冲液可包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、吐温-20、叠氮钠。在实际应用，缓冲液中各组分的浓度可以根据实际情况进行调整，譬如各组分的浓度可以在0.05~0.5g/L的范围内进行调整。

需要说明的是，该试剂盒在检测时所需的样本量可控制在10μL左右，其检测所需时间为15分钟左右；该试剂盒在常温下保存，有效期为2年左右。

另外，如附图1所示，本发明实施例提供的试剂盒在使用时，采用免疫胶体金侧向流实验原理，在底座上设置卡槽，并装入上述检测卡，在检测卡上对应设有观察窗；在硝酸纤维素膜4上用伪结核棒状杆菌重组PLD蛋白划有测试线7、用第二抗体划有质控线8，在胶体金垫3上附着有胶体金联接的兔抗羊IgG抗体。在检测时，用定量采样管吸取10μL待检测样品（山羊或绵羊的血清或全血样本液体）滴入样本孔6，静止5分钟，待检测样品沿硝酸纤维素膜4向检测卡的另一端移动，与固定有伪结核棒状杆菌重组PLD蛋白的测试线7结合；接着向缓冲液垫2上的缓冲液孔滴加4~5滴缓冲液，并置于室温下放置10分钟，使得缓冲液沿硝酸纤维素膜4向检测卡的另一端移动，将胶体金垫3上的免疫胶体金溶解并带动向前流动（如图1的a方向）；免疫胶体金继续前行逐一与测试线7、质控线8反应显色，即可检测待检测样品中是否含有伪结核棒状杆菌抗体。具体的，该检测卡对检测结果的判断方法如附图3的a，b，c，d所示：若质控线8显色、测试线7不显色，表示待检测样品中不含有伪结核棒状杆菌抗体，待检测样品为阴性；若质控线8显色、测试线7显色，表示待检测样品中含有伪结核棒状杆菌抗体，待检测样品为阳性；若质控线8不显色、测试线7不显色，表明检测操作过程不正确或检测卡已失效，需重新检测。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳芬德生物技术有限公司

西北农林科技大学

<120> 检测伪结核棒状杆菌抗体的检测卡及其应用和试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagggaga aatttgcttt attattatca ataattatgg caatcatgct tccggtaggg 60

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<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 34

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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