具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl₂ 0.1g、MgCl₂·6H₂o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl₂、MgCl₂·6H₂o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。

所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：

(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系升温至-20℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；

(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-25℃，保温；再升温至-15℃，保温；再升温至-5℃，保温；

(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃下持续保温；

冻干程序，如下表1：

表1实施例1的冻干程序

实施例2

一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸20g、NaCl 10g、ZnCl₂ 0.01g、MgCl₂·6H₂o 5g、牛血清白蛋白5g、酪蛋白10g、甘氨酸1g、聚乙二醇5g、海藻糖10g，吐温60 0.2ml。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl₂、MgCl₂·6H₂o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至5.8并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。

所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：

(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系升温至-20℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；

(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-25℃，保温；再升温至-15℃，保温；再升温至-5℃，保温；

(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃下持续保温；

冻干程序，如下表2：

表2实施例2的冻干程序

实施例3

一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸5g、NaCl 8g、ZnCl₂ 0.5g、MgCl₂·6H₂o 0.1g、牛血清白蛋白2g、酪蛋白15g、甘氨酸5g、聚乙二醇0.2g、海藻糖30g，吐温80 10ml。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl₂、MgCl₂·6H₂o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至7.5并定容至1000ml，使用0.45μm的滤膜过滤，即可。

所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：

(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系升温至-20℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；

(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-25℃，保温；再升温至-15℃，保温；再升温至-5℃，保温；

(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃下持续保温；

冻干程序，如下表3：

表3实施例3的冻干程序

实施例4

一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 12g、ZnCl₂ 0.01g、MgCl₂·6H₂o 10g、牛血清白蛋白13g、酪蛋白2g、甘氨酸1g、聚乙二醇7g、海藻糖10g，吐温20 5ml。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl₂、MgCl₂·6H₂o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至7.0并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。

所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：

(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系升温至-20℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；

(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-25℃，保温；再升温至-15℃，保温；再升温至-5℃，保温；

(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃下持续保温；

冻干程序，如下表4：

表4实施例4冻干程序

对比例1

与实施例1相比，区别在于将4-吗啉乙磺酸替换为三羟甲基氨基甲烷。

一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷10g、NaCl 9g、ZnCl₂ 0.1g、MgCl₂·6H₂o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入三羟甲基氨基甲烷、NaCl、ZnCl₂、MgCl₂·6H₂o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。

所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，同实施例1。

对比例2

与实施例1相比，区别在于将海藻糖替换为蔗糖。

一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl₂ 0.1g、MgCl₂·6H₂o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、蔗糖20g，吐温20 5ml。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl₂、MgCl₂·6H₂o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、蔗糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。

所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，同实施例1。

对比例3

与实施例1相比，区别在于将甘氨酸替换为甘油。

一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl₂ 0.1g、MgCl₂·6H₂o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘油10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl₂、MgCl₂·6H₂o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘油、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。

所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，同实施例1。

对比例4

与实施例1相比，区别在于将MgCl₂·6H₂o替换为酶法水解明胶。

一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl₂ 0.1g、酶法水解明胶0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。

所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl₂、酶法水解明胶、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。

所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，同实施例1。

对比例5

与实施例1相比，区别在于升温程序不同。

一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：

(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；

(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-30℃，保温；再升温至-20℃，保温；再升温至-10℃，保温；再升温至-5℃，保温；

(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃下持续保温；其中冻干程序，见下表：

表5对比例5冻干程序

效果评价

检测效果评价

使用实施例1-4及对比例1-5制成的缓冲液，配制不同浓度的PGP9.5冻干品，并进行冻干。免疫反应相关检测采用北京美联泰科生物技术有限公司自研的全自动化学发光免疫分析仪进行。

检测指标

1.含水量

取浓度为160pg/mL、1280pg/mL的冻干品各5瓶。将冻干品去除顶盖和胶塞后称重，记为M1_n(n＝1、2、3……10)。将其在200℃条件下进行烘干，直至质量不再发生变化为止，再次称重，记为M2_n(n＝1、2、3……10)。将这些装有样品的冻干瓶将依次清洗干净，在200℃条件下进行烘干，直至质量不再发生变化为止，对这些冻干瓶依次称重，记为M3_n(n＝1、2、3……10)。按公式进行计算含水量。冻干品含水量应小于2％。

含水量＝[(M1_n-M3_n)/(M2_n-M3_n)-1]×100％

使用上述方法测试实施例1-4及对比例5对应冻干品的平均含水量，结果见表6。

表6含水量

2.准确度

将浓度约为3000pg/mL(允许偏差±10％)的脑特异性蛋白产物9.5(PGP9.5)液(A)加入到浓度范围0pg/mL-80pg/mL的血清样本(B)中，所加入PGP9.5抗原与样本B之间的体积比例为1:9，使用冻干品和配套的脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒(磁微粒化学发光法)进行检测。根据下式计算回收率R，其回收率应在85％～115％范围内。

式中：R为回收率；V为样品A液的体积；V₀为血清样品B液的体积；C为血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；C₀为血清样品B液的3次测量平均值；C_S为样品A液的浓度。

3.线性区间

将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成5个浓度，分别为160pg/mL、320pg/mL、640pg/mL、1280pg/mL、2560pg/mL，。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(y_i)。以稀释浓度(x_i)为自变量，以测定结果均值(y_i)为因变量求出线性回归方程。

按下式计算线性回归的相关系数(r)，在[80,2560]pg/mL的线性区间内，相关系数r应≥0.990。

式中：r为相关系数；x_i为稀释比例；y_i为各个样本测定结果均值；为稀释比例的均值；为样本测定结果总均值。

4.重复性

重复测试浓度为320pg/mL的冻干品10次，计算10次测试结果的平均值和标准差SD。

按下式计算变异系数(CV)，结果CV应≤8％。

式中：S为样本测试值的标准差；为样本测试值的平均值。

5.灵敏度

将不含任何分析物的样本重复测试20次，得到20次测试结果的浓度值，计算其平均值和标准差(SD)。平均值即为空白限，结果应＜80pg/mL的要求。

6.批间差

用3个批号的试剂盒分别重复测试浓度为640pg/mL的质控品10次。，计算30次测试结果的平均值和标准差SD，根据下列公式得出变异系数(CV)，结果应≤15％。

式中：s为样本测试值的标准差；为样本测试值的平均值。

采用以上方法对冻干品冻干保存0个月、18个月、20个月、36个月、39个月的各项性能指标进行评价，结果如下。

表7检测数据(常温0月)

表8稳定性效果数据(4-8℃保存18个月)

表9稳定性效果数据(4-8℃保存20个月)

表10稳定性效果数据(-20℃保存36个月)

表11稳定性效果数据(-20℃保存39个月)

由此可知，本发明提供的缓冲液及冻干方法能够有效保存PGP9.5，能够使胶质纤维酸性蛋白检测过程中的抗压冻干品复融后有效保存其活性，提高检测灵敏度。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。