具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明实施例的主要材料如下：

Benzonase，来自翌圣生物科技（上海）有限公司。

弗氏完全佐剂、弗氏非完全佐剂， 购自Sigma。

新西兰大白兔（2-2.5 kg）， 购自上海甲干生物有限公司。

NHS活化琼脂糖， 购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

生物素-N-琥珀酰亚胺基脂， 购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

HRP标记亲和素， 购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

HRP标记羊抗鼠IgG二抗， 来自翌圣生物科技（上海）有限公司。

96孔酶标板， 购自Thermo Fisher Scientific。

TMB显色液，来自翌圣生物科技（上海）有限公司。

PBS pH7.4, 甘氨酸洗脱液pH2.7，吐温20，BSA，脱脂奶粉，DMSO，Tris Base，NaCO₃NaHCO₃，硫酸，明胶，Tween-20，NP40，Proclin300，PEG400，PEG6000，MPD，乳糖，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

纯化或未经纯化的腺病毒液，获赠于普瑞金生物科技有限公司。

Benzonase ELISA试剂盒，购自北京义翘生物科技有限公司。

实施例1抗Benzonase多克隆抗体制备与纯化

1.1 兔免疫血清制备

将Benzonase与弗氏完全佐剂等体积混合，用注射器推动乳化完全。将乳化后的抗原用于新西兰兔背部皮下多点免疫12周，每二周免疫一次。初次免疫用弗氏完全佐剂乳化Benzonase，加强免疫用弗氏非完全佐剂乳化Benzonase。一组初次免疫抗原剂量为0.5 mg/只，加强免疫免疫抗原剂量为0.25 mg/只，另一组免疫剂量为常规免疫剂量，初免为1 mg/只，加强免疫为0.5 mg/只。免疫3次后取静脉血ELISA检测血清效价，以后每隔2周进行效价检测，血清效价达1：20万以上停止免疫，颈动脉取兔子全血，室温静置1小时后，10000转/min，离心5分钟，取血清，加一倍体积甘油，混匀后放置-20℃备用。

ELISA检测血清效价步骤：将Benzonase溶解于PBS，以1 μg/ml的浓度，100 μl酶孔包被酶标板，37℃放置1小时包被或者4℃过夜包被，PBST（含0.05%吐温20的PBS）洗板3次。5%的脱脂奶粉，每孔200 μl，37℃放置2小时封闭。用PBS稀释兔血清，以2倍分别稀释1000倍，2000倍，4000倍等共11个梯度，设置用PBS的阴性对照。每孔加血清稀释样品100 μl，37℃1小时，PBST洗板5次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗（1：5000稀释）37℃40分钟，PBST洗板5次后，加入TMB显色液，每孔100 μl。

如表1所示，1#-7#兔子，初免0.5 mg/只，加强免疫0.25 mg/只，免疫6次后，效价均超过了1：20万，部分兔子的血清效价甚至超过了1：100万。8#兔子初免1 mg/只，加强免疫0.5 mg/只，免疫6次后效价为1：25.6万。如图1所示，高剂量的抗原免疫兔子，免疫3周后效价高于低剂量免疫，但随着免疫次数增多，低剂量免疫能得到效价更高的血清。

表1 8只兔子免疫6次后血清效价检测

1.2 Protein G纯化兔血清

Protein G亲和纯化兔血清步骤：将兔血清用PBS稀释10倍。用PBS平衡好ProteinG亲和纯化介质。将稀释后的兔血清与Protein G亲和纯化介质于4℃孵育2小时。将孵育后的Protein G纯化介质上到重力层析柱中，收集流穿液，用20倍柱体积的PBS洗涤，洗涤后用10倍柱体积的甘氨酸洗脱缓冲液洗脱抗体。放入4℃待用抗原亲和层析柱进一步纯化。

1.3 抗原亲和层析柱制备

抗原亲和层析柱制备步骤：

Buffer的准备

所有的水和缓冲液均用0.22 μm或0.45 μm的滤膜过滤。

所需附加材料

（1）空柱以及兼容的离心机/收集管。

（2）洗涤液：1 mM盐酸。

（3）偶联液：0.2 M NaHCO₃，0.5 M NaCl，pH 8.0或其它无胺缓冲液。

（4）洗涤液1：0.1 M乙酸-乙酸钠，0.5 M NaCl, pH 8.0。

（5）洗涤液2：0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH 8.0。

（6）保护液：包含20%乙醇的1ХPBS。

（7）2 ml偶联液中溶解20 mg Benzonase，透析置换成偶联液。

（8）封闭液：0.5 M乙醇胺，0.5 M NaCl，pH 8.3。

抗原偶联过程

颠倒混匀琼脂糖凝胶几次

（1）垂直放置含有NHS活化树脂的柱子，平衡柱至室温，使树脂沉降。用洗涤液通过抽滤洗涤三次，再用耦合缓冲液洗涤一次。在使用过程中不能使树脂床变干，通过吹打或震荡使结块溶解，可以通过冷溶液快速清洗预防水解作用。

（2）添加溶解好的Benzonase到清洗完毕的NHS活化的琼脂糖中（NHS活化琼脂糖4FF体积：样品溶液体积1：2。

（3）混合震荡反应在28℃进行4 小时，或者4℃过夜。NHS-Activated SefinoseTM4 FF必须是悬浮状态，否则会影响偶连效率。

（4）收集耦合样品，以便检测耦合效率。填料用去离子水进行洗涤。加入两倍柱体积的封闭液于28℃震荡反应1 小时。

（5）流干封闭液并去除，加入三倍柱体积的去离子水洗涤树脂。树脂分别通过洗涤液1、去离子水、洗涤液2、去离子水按照顺序重复洗涤两次，然后加入相同体积的保护缓冲液，于2-8℃贮存。

图2的第1道和第2道显示全能核酸酶偶联后比偶联前少，表明全能核酸酶偶联到了琼脂糖凝胶上了。

1.4 抗原亲和层析纯化兔多抗

抗原亲和层析柱纯化抗体步骤：

用PBS平衡抗原亲和纯化介质，将纯化介质与Protein G纯化洗脱液混合于4℃孵育2小时。将孵育后的介质上到重力层析柱中，收集流穿液，用20倍柱体积的PBS洗涤，洗涤后用10倍柱体积的甘氨酸洗脱缓冲液洗脱抗体。用50 kD的超滤浓缩管浓缩洗脱液，PBS透析置换浓缩液。加一倍体积的甘油放-20℃保存备用。3只兔血清的纯化结果见表2。抗体纯化纯度见图1中的第4条道。

表2 3只兔子的纯化结果

实施例2 生物素标记抗体

（1）从冷藏室里取出生物素试剂，在步骤3打开之前平衡至室温。

（2）用PBS稀释抗体，将1-10 mg抗体溶于0.5-2.0 ml PBS。

（3）在DMSO中制备10 mM生物素试剂溶液。2 mg NHS-Biotin溶于590 μl DMSO。

（4）以生物素与抗体的摩尔比为20：1的比例混合生物素试剂与抗体溶液。

（5）冰上孵育2小时或者室温孵育30分钟。

（6）此时抗体标记完成，使用透析去除过量的生物素试剂。

ELISA检测抗体的标记效果。1 μg/ml的Benzonase包被酶标板，5%的脱脂奶粉封闭，将标记的抗体从稀释1000倍（抗体终浓度1 μg/ml）开始二倍稀释成7个梯度，孵育洗板后加入HRP标记的亲和素。TMB显色。通过观察最高稀释倍数的阳性孔来判断标记效果，如表3所示，稀释16000倍时阳性，表明抗体标记成功。

表3 标记抗体效价检测

实施例3 夹心ELISA检测Benzonase方法调试。

夹心ELISA步骤为：兔多抗包被，洗板，酶标板封闭，加样，洗板，加生物素标记的兔多抗，洗板，加HRP标记的亲和素，洗板，加TMB显色，加终止液终止，OD450读数。在调试之初，发现阴性样品OD值大于0.2，这跟同时使用多抗作为包被抗体和检测抗体有关，只有摸索好最佳的包被抗体浓度和最佳的检测抗体浓度将阴性样本的OD值降到0.2以下，再调试优化其它条件才有意义。本发明中对调试顺序依次为：优化包被抗体的浓度和检测抗体的浓度，优化包被缓冲液、包被温度和时间，优化最佳的封闭条件，优化样本的孵育温度和时间，优化HRP标记亲和素的浓度和孵育时间，优化TMB显色的时间。

3.1 优化包被抗体的浓度和检测抗体的工作浓度。

采用棋盘滴定的方法，包被抗体的浓度设置1 μg/ml，1.5 μg/ml，2 μg/ml，2.5 μg/ml，3 μg/ml，3.5 μg/ml，4 μg/ml，每孔100 μl。检测抗体的浓度设置为0.4 μg/ml，0.6 μg/ml，0.8 μg/ml 1 μg/ml，每孔100 μl。包被溶液先选择PBS，4℃包被过夜，洗板液为含0.05%吐温20的PBS,名为PBST，洗板5次，封闭液先选择5%的脱脂奶粉，每孔200 μl，37℃封闭2小时，包被抗体37℃孵育1小时，HRP标记的亲和素1：5000稀释用，每孔100 μl，37℃孵育45分钟，TMB显色液每孔100 μl，37℃作用15分钟，每孔50 μl 2 M硫酸终止显色，读取OD₄₅₀值。阳性样本用的是含1 ng/ml Benzonase的PBS溶液，阴性样品用的是PBS溶液，每孔100 μl。对不同兔子来源的兔多抗，也就是不同批次的兔多抗的抗体使用浓度进行了测试，1#、2#兔子的多抗结果如表4和表5。从表4中可见1#兔的抗体包被浓度用2 μg/ml，检测抗体浓度为0.6 μg/ml时，P/N值最大，阴性样本（N）OD值低，且OD值在0.2以下，故该浓度确定为最佳抗体包被浓度和最佳检测抗体工作浓度。表5中显示2#兔的包被抗体浓度为2 μg/ml，检测抗体浓度为0.8 μg/ml时为最佳工作浓度。本发明还测试了其它几个批次的兔多抗，发现每个批次的兔多抗的包被抗体和检测抗体的工作浓度都是有差别的，所以每个批次的兔多抗都需要调试最佳的工作浓度。可知针对每批次的多抗，要摸索到最佳的包被抗体和检测抗体使用量比例才能达到最佳的检测效果，在优化每批次兔多抗最佳工作浓度时，需要将检测抗体的孵育条件固定，本发明固定在37℃ 1小时。

表4 1#兔子多抗包被抗体浓度和检测抗体浓度工作测试结果

表5 2#兔子多抗包被抗体浓度和检测抗体浓度测试结果

3.2 优化最适包被缓冲液、包被温度和时间。

用3种包被稀释液将包被抗体进行稀释，这3种包被稀释液分别为为Tris-HCl（0.02 M）、PBS（0.01 M）和CBS（0.05 M），包被抗体工作浓度采用2 μg/ml，每孔100 μl，4℃孵育16小时。洗板液为PBST，洗板5次。每孔加入200 μl 5%的脱脂奶粉，37℃孵育2小时封闭酶标板。阳性样本用含1 ng/ml的Benzonase溶液，阴性样本用PBS，每孔100 μl。样本37℃孵育1小时。检测抗体采用0.6 μg/ml，每孔100 μl，37℃孵育1小时。HRP标记的亲和素1：5000稀释用，每孔100 μl，37℃孵育45分钟。TMB显色液每孔100 μl，37℃作用15分钟，每孔50 μl2M 硫酸铵终止显色，读取OD₄₅₀值，如表6所示。阴性值低，P/N最大时为最佳的包被缓冲液，即为PBS。

表6 最佳包被稀释液测试结果

选用PBS为最佳包被时间，包被时间设置37℃1小时，37℃2小时和4℃16小时三种。包被抗体工作浓度采用2 μg/ml，每孔100 μl，4℃孵育16小时。洗板液为PBST。每孔加入200μl 5%的脱脂奶粉，37℃孵育2小时封闭酶标板。阳性样本用含1 ng/ml的Benzonase溶液，阴性样本用PBS，每孔100 μl。样本37℃孵育1小时。检测抗体采用0.6 μg/ml，每孔100 μl，37℃孵育1小时。HRP标记的亲和素1：5000稀释用，每孔100 μl，37℃孵育45分钟。TMB显色液每孔100 μl，37℃作用15分钟，每孔50 μl 2 M 硫酸铵终止显色，读取OD₄₅₀值，如表7所示。P/N最大时为最佳包被条件，即4℃16小时包被效果最佳。

表7 最佳包被条件测试结果

3.3优化最佳封闭条件。

包被抗体浓度采用2 μg/ml，包被液用PBS，每孔100 μl，4℃16小时包被酶标板。封闭液采用BSA和脱脂奶粉两种，浓度均分别设置1%，3%，5%三种，每孔200 μl，封闭条件设置37℃1小时，37℃2小时，4℃过夜三种。洗板液为PBST，洗板5次。阳性样本用含1 ng/ml的Benzonase溶液，阴性样本用PBS，每孔100 μl。样本37℃孵育1小时。检测抗体采用0.6 μg/ml，每孔100 μl，37℃孵育1小时。HRP标记的亲和素1：5000稀释用，每孔100 μl，37℃孵育45分钟。TMB显色液每孔100 μl，37℃作用15分钟，每孔50 μl 2M 硫酸铵终止显色，读取OD₄₅₀值，如表8所示。P/N最大时为最佳封闭条件，即用5%的脱脂奶粉且37℃ 2小时封闭效果最佳。

表8 最佳封闭条件测试结果

3.4优化检测样本的孵育温度和时间

包被抗体的浓度采用2 μg/ml，包被液用PBS，每孔100 μl，4℃16小时包被酶标板。洗板液用PBST，洗板5次。封闭液采用5%脱脂奶粉，37℃封闭2小时。阳性样本用含1 ng/ml的Benzonase溶液，阴性样本用PBS，由于还不确定检测样本在37℃的稳定性，设置了16℃、25℃、37℃，分别孵育1小时、2小时这6个条件。检测抗体采用0.6 μg/ml，每孔100 μl，37℃孵育1小时。HRP标记的亲和素1：5000稀释用，每孔100 μl，37℃孵育45分钟。TMB显色液每孔100 μl，37℃作用15分钟，每孔50 μl 2M 硫酸铵终止显色，读取OD₄₅₀值，如表9所示。P/N最大时为最佳检测样本孵育条件，即在样本在37℃孵育2小时时检测效果最好，可见全Benzonase在本发明的检测体系中，在37℃稳定。

表9 最佳检测样本的孵育温度和时间测试结果

3.5优化HRP标记亲和素的浓度和孵育时间。

包被抗体的浓度采用2 μg/ml，包被液用PBS，每孔100 μl，4℃16小时包被酶标板。洗板液用PBST，洗板5次。封闭液采用5%脱脂奶粉，37℃封闭2小时。阳性样本用含1 ng/ml的Benzonase溶液，阴性样本用PBS，每孔100 μl。HRP标记的亲和素分别设置1：3000，1：5000，1：7000三个稀释度，孵育条件设置在37℃孵育30分钟，45分钟，1小时三个时长，每孔100 μl。TMB显色液每孔100 μl，37℃作用15分钟，每孔50 μl 2M 硫酸铵终止显色，读取OD₄₅₀值，如表10所示。P/N最大时为最佳HRP标记亲和素孵育条件，即HRP标记亲和素稀释5000倍用，37℃孵育45分钟为最佳工作条件。

表10 HRP标记亲和素的工作浓度和孵育时间测试结果

3.6优化TMB显色时间。

包被抗体的浓度采用2 μg/ml，包被液用PBS，每孔100 μl，4℃ 16小时包被酶标板。洗板液用PBST，洗板5次。封闭液采用5%脱脂奶粉，37℃封闭2小时。阳性样本用含1 ng/ml的Benzonase溶液，阴性样本用PBS，每孔100 μl。样本37℃孵育1小时。检测抗体采用0.6μg/ml，每孔100 μl，37℃孵育1小时。HRP标记的亲和素1：5000稀释用，每孔100 μl，37℃孵育45分钟。TMB显色液每孔100 μl，设置37℃作用15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，每孔50 μl 2M 硫酸铵终止显色，读取OD₄₅₀值，如表11所示。P/N最大时为最佳TMB显色时间。TMB作用30分钟为最佳工作条件。

表11 最佳TMB显色时间

实施例4 试剂盒稳定性优化

试剂盒的稳定性与试剂盒的各组分的稳定性相关，包括：包被封闭后的酶标板，生物素标记的抗体，亲和素标记的HRP，Benzonase标准品，TMB显色液和硫酸。采用37℃放置6天后4℃放置一天的热加速实验测试各组分的稳定性。每次用一种经热加速的组分，其它组分4℃放置（酶标板为当天封闭包被，Benzonase标准品为当天配制），采用夹心ELISA法，Benzonase浓度用1 ng/ml。

表12 各组分热加速稳定性测试结果

如表12显示，包被封闭后的酶标板，生物素标记的抗体，Benzonase标准品经热加速均不稳定，亲和素标记的抗体，TMB显色液，硫酸终止液的稳定性不受热加速的影响。本发明对封闭液的配方进行了大量的测试，最终发现含5%脱脂奶粉，0.05% tween-20，0.05%Proclin300，1% PEG6000的PBS可稳定封闭后的酶标板。本发明对生物素标记的抗体的贮存液培养进行了摸索，最终发现含1% BSA，0.05% Proclin300，0.01% Tween-20，10% MPD的PBS可稳定贮存生物素标记的抗体。本发明对Benzonase标准品的贮存液进行了大量测试，最终发现含3%乳糖，1% BSA，0.05% NP40，0.5%明胶，0.05% Proclin，0.5% PEG400的PBS可以稳定Benzonase，且将该配方的Buffer用于配制试剂盒的样本稀释液。

实施例5 ELISA特异性测试

用建立的ELISA方法进行检测，具体为包被抗体的浓度采用2 μg/ml，包被液用PBS，每孔100 μl，4℃ 16小时包被酶标板。洗板液用PBST，洗板5次。封闭液采用5%脱脂奶粉，37℃封闭2小时。样本37℃孵育1小时。检测抗体采用0.6 μg/ml，每孔100 μl，37℃孵育1小时。HRP标记的亲和素1：5000稀释用，每孔100 μl，37℃孵育45分钟。TMB显色液每孔100 μl，显色30 分钟。每孔50 μl 2M 硫酸终止显色，读取OD₄₅₀值。阳性含Benzonase样本（0.1ng/ml），阴性样本稀释液，5%兔血清样本，5%鼠血清样本，5%羊血清样本，E.coli HCP（0.5mg/ml），293 HCP（1.8 mg/ml），CHO HCP（1 mg/ml），Vero HCP（0.5 mg/ml），1% BSA，及这些样本用样本稀释液2倍稀释的共8个浓度梯度的样本。检测结果如图3和表13，在样本高蛋白浓度和低蛋白浓度下，检测的OD值均在0.15以下，高浓度蛋白样本的OD值低并非是高浓度蛋白抑制夹心ELISA反应所致，表明该试剂盒夹心ELISA法特异性强。

表13 ELISA特异性测试结果

实施例6 ELISA检测灵敏度试验和检测标准曲线制作

使用PBS稀释Benzonase标准品，浓度分别为3 ng/ml，1.5 ng/ml，0.75 ng/ml，0.375 ng/ml，0.188 ng/ml，0.093ng/ml，0.047 ng/ml，0.024 ng/ml，0.012 ng/ml，0.006ng/ml。用所建立的ELISA方法进行检测，确定其最低可以检测到的Benzonase浓度，从而确定该方法的灵敏度。如图4所示，随着Benzonase含量的降低，其OD450nm值呈下降趋势，当Benzonase低于0.024 ng/ml时，OD450nm趋于平稳，表明该双抗夹心ELISA法的Benzonase检测最低测限为0.024 ng/ml。

取3 ng/ml，1.5 ng/ml，0.75 ng/ml，0.375 ng/ml，0.188 ng/ml，0.093 ng/ml，0.047 ng/ml几个浓度及其对应的OD值，在ELISA Calc软件上采用二次曲线回归拟合曲线，如图5所示。方程：y=a+bx+cx²，a=0.19034，b=1.11350，c=-0.13038，r²=0.9995。

实施例7 实际样本回收率测试

实际样本回收率反映的是检测的准备性。对于普瑞金生物科技有限公司赠与的一种实际样本腺病毒纯化液，浓度以3 ng/ml开始2倍稀释加入Benzonase，在Benzonase浓度3-0.093 ng/ml之间，试剂盒检测回收率在80%-110%之间，如表14所示，可见本发明的试剂盒检测准确度高。

表14 实际样本回收率测试结果

实施例8 ELISA 检测精密度测试

8.1板内差异测试

在同一个ELISA板上重复6次标准品的曲线构建，结果如表15所示，CV值<5%，可见本发明的试剂盒板内差异很小。

表15 板内差异测试结果

8.2 批间差测试

用不同时期制备的兔多抗生产3批ELISA试剂盒，测试这三批试剂盒的批间差。对未经纯化的腺病毒收获液，浓度以3 ng/ml开始2倍稀释加入Benzonase，在Benzonase浓度3-0.188 ng/ml之间，如表16所示，试剂盒检测回收率在70%-110%之间，CV<10%，可见本发明的试剂盒批间差异很小。

表16 批间差测试结果

8.3 中间精密度测试

由3名实验员独立检测，测试由3 ng/ml的Benzonase标准品稀释成含1.5 ng/ml，0.375 ng/ml，0.094 ng/ml Benzonase的未经纯化的腺病毒样本。如表17所示，CV<15%。

表17 中间精密度测试结果

实施例9 ELISA检测法抗干扰测试

用所检测的ELISA方法，检测Benzonase含量为1 ng/ml的BSA溶液，BSA浓度分别为500 μg/ml，200 μg/ml，50 μg/ml，5 μg/ml。与竞品的Benzonase试剂盒（该试剂盒抗体原料为兔单抗）对比。实验结果如图6所示，在不同的BSA浓度下，ELISA检测的回收率在正常范围（70%-120%）内。可以看出，本发明的ELISA的抗干扰能力强于竞品，这可能是多抗作为原料的优点。

实施例10 试剂盒稳定性测试

将包被好的板条以及通用试剂在37℃放置6天，再转移至4℃放置1天后检测。如表18所示，结果显示试剂盒性能未有明显下降，跌幅在20%以内为合格。

表18 试剂盒稳定性测试结果