一种灵芝菌株及其红肉灵芝子实体的培养方法
阅读说明：本技术 一种灵芝菌株及其红肉灵芝子实体的培养方法 (Ganoderma strain and culture method of ganoderma lucidum fruiting body ) 是由 刘虹 杨杰 郭尚 白瑶云 于 2021-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种灵芝菌株,命名为红肉灵芝Ganodermashanxiense,保藏编号为CGMCCNO:23077,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2021年8月11日。还提供了子实体的培养方法,在碳源基础培养基中添加葡萄糖,使得葡萄糖的浓度为30g/L,并调节培养基的pH值至4.0,在氮源基础培养基中添加酵母粉,使得酵母粉的浓度为2g/L,并调节培养基的pH值至4.0,得到红肉灵芝菌丝生长的适宜碳源和氮源培养基；然后将灵芝菌株接种至红肉灵芝生长用培养基中,在温度为30℃的条件下暗培养催芝,得到红肉灵芝子实体。本发明的红肉灵芝具有较强的天然富硒能力。(The invention provides a ganoderma lucidum strain named as ganoderma lucidum ganodermashanisense, the preservation number is CGMCC NO:23077, the preservation unit is China general microbiological culture Collection center, and the preservation date is 2021, 8 and 11 days. Adding glucose into a carbon source basal culture medium to ensure that the concentration of the glucose is 30g/L, adjusting the pH value of the culture medium to 4.0, adding yeast powder into a nitrogen source basal culture medium to ensure that the concentration of the yeast powder is 2g/L, and adjusting the pH value of the culture medium to 4.0 to obtain a carbon source and nitrogen source culture medium suitable for the growth of ganoderma lucidum mycelia; then inoculating the Ganoderma strain into culture medium for Ganoderma lucidum growth, and dark culturing at 30 deg.C to obtain Ganoderma lucidum fruiting body. The ganoderma lucidum has strong natural selenium enrichment capability.)
技术领域
本发明属于灵芝菌株技术领域，具体涉及一种灵芝菌株及其红肉灵芝子实体的培养方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma lingzhi)是我国最著名的药用真菌之一，在我国有着悠久的药用历史。现代科学研究证实，灵芝具有广泛的药理活性，包括提高免疫力、抗肿瘤、抗糖尿病、抗HIV-1型病毒、降血糖、保肝护肝等。
现有灵芝品种多属于中高温品种，栽培方式以熟料栽培和椴木栽培为主，灵芝菌种在栽培过程中极易发生逐代退化现象，表现为灵芝多糖、有机硒等有效成分含量逐代减少，保健和药用效果越来越不显著，致使高效的药用开发相对滞后。
“灵芝中具有天然富硒能力的较少，大力开发天然富硒能力灵芝品种尤为重要。中国营养学会将硒列为人体必需的15种营养素之一，国内外大量临床实验明，人体缺硒可引起某些重要器官的功能失调，导致许多严重疾病发生，全世界40多个国家处于缺硒地区，中国22个省份的几亿人口都处于缺硒或低硒地带，这些地区的人口肿瘤、肝病、心血管疾病等发病率很高。研究表明，低硒或缺硒人群通过适量补硒不但能够预防肿瘤、肝病等的发生，而且可以提高机体免疫能力，维护心、肝、肺、胃等重要器官正常功能，预防老年性心、脑血管疾病的发生。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种灵芝菌株及其红肉灵芝子实体的培养方法，该红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)具有较强的天然富硒能力。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种灵芝菌株，所述灵芝菌株命名为红肉灵芝Ganoderma shanxiense，保藏编号为CGMCC NO:23077，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年8月11日。
优选地，所述灵芝菌株的ITS核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种用上述的灵芝菌株培养红肉灵芝子实体的方法，该方法为：
在碳源基础培养基中添加葡萄糖，使得葡萄糖的浓度为30g/L，并调节培养基的pH值至4.0，得到红肉灵芝菌丝生长的适宜培养基；
或者在氮源基础培养基中添加酵母粉，使得酵母粉的浓度为2g/L，并调节培养基的pH值至4.0，得到红肉灵芝菌丝生长的适宜培养基；
然后将灵芝菌株接种至所述红肉灵芝菌丝生长的适宜培养基中，在温度为30℃的条件下暗培养催芝，得到红肉灵芝子实体。
优选地，所述红肉灵芝子实体的硒含量的平均值为2.75mg/kg～ 2.83mg/kg。
优选地，所述碳源基础培养基由以下质量浓度的原料组成：蛋白胨3.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO40.45 g/L和琼脂12.0g/L；所述氮源基础培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖20.0g/L、KH2PO42.0 g/L、MgSO4 0.45g/L和琼脂15.0g/L。
优选地，所述催芝的时间为1.5d～3.0d。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明的红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)具有较强的天然富硒能力，其子实体的硒含量的平均值为2.75mg/kg～2.83mg/kg。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1的红肉灵芝Ganoderma shanxiense的菌落形态图。
图2是本发明实施例1的红肉灵芝Ganoderma shanxiense的遗传系统发育树。
图3是本发明实施例5的不同温度对红肉灵芝Ganoderma shanxiense 菌丝生长速度的影响图。
图4是本发明实施例5的不同pH值对红肉灵芝Ganoderma shanxiense 菌丝生长速度的影响图。
图5是本发明实施例5的红肉灵芝Ganoderma shanxiense的子实体图。
具体实施方式
实施例1
一种灵芝菌株，所述灵芝菌株命名为红肉灵芝Ganoderma shanxiense，保藏编号为CGMCC NO:23077，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年8月11日。
2018年9月12日在山西省夏县泗交镇完成灵芝野生菌株采集，随后在山西省农业科学院食用菌研究所通过组织分离法获得纯菌种(F1代)，经形态学和its分析为新物种，定名为山西灵芝(Ganoderma shanxiense L. Fan&H.Liu sp.nov.)。
2018年9月至10月，在山西省农业科学院食用菌研究所对该野生菌株进行纯化和复壮处理，同时通过菌丝拮抗法初步证实该菌株的特异性。
2018年11月至12月在山西省农业科学院食用菌研究所实验室采用生物培养箱进行出芝驯化，并获得成功；2019年1月在山西省农业科学院食用菌研究所以新出子实体为材料通过组织分离法培养出新菌株(F2代)，于2019年1月通过ITS测序比确定为可栽培的新菌株。
2019年5月至10月山西省阳泉市平定县绿洋农业开发有限公司、沁水白云食用菌种植专业合作社和交城县绿鼎源造林合作社等三个不同生态区进行示范和稳定性栽培，获得菌盖漆状光泽明显菌肉为红褐色子实体，并分离形成新菌株(F3)，然后再经过纯度、活力度等检测后形成新灵芝菌株，定名为红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)；所述灵芝菌株的ITS核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本实施例的红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)的菌丝白色，丝状，菌落呈现同心轮纹状，不易形成菌膜(图1中的LH676)。显著区别于对照灵芝菌株(亮盖灵芝GanodermaLucidum)(图1中的GL003)。本实施例的红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)的遗传系统发育树如图2所示，红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)的序列聚集在单独的分支上，并获得很高的支持。
实施例2
本实施例提供了实施例1中的灵芝菌株培养红肉灵芝子实体的方法，该方法为：
在碳源基础培养基中添加葡萄糖，使得葡萄糖的浓度为30g/L，并调节培养基的pH值至4.0，得到红肉灵芝菌丝生长的适宜碳源培养基；
然后将灵芝菌株接种至所述红肉灵芝生长用培养基中，在温度为30 ℃的条件下暗培养催芝1.5d，得到红肉灵芝子实体；
所述碳源基础培养基由以下质量浓度的原料组成：蛋白胨3.0g/L、 KH2PO41.0 g/L、MgSO40.45 g/L和琼脂12.0g/L。
实施例3
本实施例提供了实施例1中的灵芝菌株培养红肉灵芝子实体的方法，该方法为：
在氮源基础培养基中添加酵母粉，使得酵母粉的浓度为2g/L，并调节培养基的pH值至4.0，得到红肉灵芝菌丝生长的适宜氮源培养基；
然后将灵芝菌株接种至所述红肉灵芝生长用培养基中，在温度为30 ℃的条件下暗培养催芝3.0d，得到红肉灵芝子实体；
所述氮源基础培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖20.0g/L、KH2PO42.0 g/L、MgSO40.45 g/L和琼脂15.0g/L。
实施例4
将实施例2-3培养的红肉灵芝子实体和对照灵芝菌株(亮盖灵芝 GanodermaLucidum)的子实体烘干粉碎、过筛(60目)。各组灵芝子实体每组取3株子实体进行测定。采用原子吸收法测定各微量元素，锌含量参照GB5009.14-2017进行测定，铁含量参照GB5009.90-2016进行测定，钙含量参照GB5009.92-2016进行测定，镁含量参照GB5009.241-2017进行测定，锗含量参照GB 5009.151-2003进行测定，铬含量参照GB 5009.123-2014进行测定，硒含量参照GB 5009.93-2017进行测定，结果如表1所示，实施例2-3培养的红肉灵芝子实体具有较强的天然富硒能力，天然富硒量是对照灵芝的13～18倍：
表1本发明的红肉灵芝和对照灵芝的子实体的为了元素成分含量(mg/kg)
项目
锌
镁
铬
硒
实施例2
45.63±3.6a
1050.1±41.8a
0.21±0.08a
2.75±0.68a
实施例3
46.75±2.8a
1003.1±36.9a
0.19±0.06a
2.83±0.55a
对照组
21.08±2.1b
676.6±36.7b
0.11±0.12a
0.24±0.02b
注：字母相同差异不显著(P＜0.05)。
实施例5
本实施例为实施例1中的灵芝菌株培养红肉灵芝子实体的条件筛选：
(一)培养基的筛选：红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)适宜碳源为30g/L葡萄糖，适宜氮源为2.0g/L酵母粉。
1、在碳源基础培养基上，分别添加葡萄糖(P)，蔗糖(Z)，乳糖 (R)和甘露醇(G)4种不同碳源，每个碳源的浓度梯度都分为10g/L， 20g/L和30g/L 3个，即形成12个供试碳源配方。用灭菌完全的打孔器(φ＝6mm)在红肉灵芝的菌种培养皿获取生长一致的接种块到供试碳源培养基培养皿中心，置于25℃暗培养6d，按照十字交叉法用游标卡尺测定菌落直径，计算菌丝生长速度，并观察菌丝长势。每个处理设5个重复；所述碳源基础培养基由以下质量浓度的原料组成：蛋白胨3.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、MgSO40.45 g/L和琼脂12.0g/L。由表1可知，30g/L葡萄糖的条件下红肉灵芝菌丝生长速率最大。
表1不同碳源对红肉灵芝菌丝生长的影响
不同碳源及添加量
菌丝颜色
菌丝长势
生长速度/mm·d<sup>-1</sup>
10g/L葡萄糖
乳白
2+
2.99±0.03e
20g/L葡萄糖
乳白
3+
3.55±0.12b
30g/L葡萄糖
乳白
2+
3.87±0.05a
10g/L蔗糖
乳白
2+
2.71±0.07f
20g/L蔗糖
乳白
2+
2.94±0.07e
30g/L蔗糖
乳白
2+
3.51±0.01b
10g/L乳糖
雪白
3+
2.30±0.02h
20g/L乳糖
雪白
3+
2.48±0.06g
30g/L乳糖
雪白
3+
3.22±0.10cd
10g/L甘露醇
白
2+
2.80±0.07f
20g/L甘露醇
白
2+
3.30±0.02c
30g/L甘露醇
白
2+
3.14±0.03d
说明：+，2+，3+表示菌丝长势逐渐增强。字母相同时差异不显著(P＜0.05)。
2、在氮源基础培养基上，分别添加尿素(添加量为1.0g/L，2.0g/L 和3.0g/L)，(NH4)2SO4(添加量为1.0g/L，2.0g/L和3.0g/L)、蛋白胨(添加量为1.0g/L，3.0g/L和5.0g/L)和酵母浸出粉(添加量为2.0g/L， 4.0g/L和6.0g/L)4种不同氮源，形成12个供试配方。将红肉灵芝的试验菌种大小一致的接种到上述供试培养基中央，置于25℃暗培养5d后，并观察菌丝长势，测定菌丝生长速度。其它与碳源试验相同；所述氮源基础培养基由以下质量浓度的原料组成：葡萄糖20.0g/L、KH2PO42.0g/L、 MgSO40.45g/L和琼脂15.0g/L。由表2可知，2.0g/L酵母粉的条件下红肉灵芝菌丝生长速率最大。
表2不同氮源对红肉灵芝菌丝生长的影响
不同氮源及添加量
菌丝颜色
菌丝长势
生长速度
尿素1.0g/L
白
2+
2.11±0.02g
尿素2.0g/L
白
3+
1.40±0.02h
尿素3.0g/L
白
-
-
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>1.0g/L
灰白
2+
3.36±0.03b
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>2.0g/L
灰白
+
2.78±0.06e
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>3.0g/L
灰白
+
2.63±0.14f
蛋白胨1.0g/L
白
2+
3.41±0.05b
蛋白胨3.0g/L
白
2+
2.92±0.04d
蛋白胨5.0g/L
白
3+
3.24±0.02c
酵母粉2.0g/L
白
3+
3.67±0.01a
酵母粉4.0g/L
白
3+
3.42±0.07b
酵母粉6.0g/L
白
3+
3.40±0.04b
说明：+，2+，3+表示菌丝长势逐渐增强，-表示无统计数据。字母相同时差异不显著(P＜0.05)。
(二)红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)菌丝生长适宜条件：红肉灵芝(Ganodermashanxiense)菌丝的适宜培养温度为30℃，可在pH值为3.0-8.0时进行生长，最适宜pH值为4.0。
1、温度特性试验：将试验菌种接种到PDA培养基上，分别置于10 ℃，15℃，20℃，25℃，30℃和35℃条件下暗培养，其它操作与碳源试验相同。如图3所示，在30℃暗培养红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)菌丝生长速度最快，可达4.69mm·d-1。
2、基质酸碱性试验：以PDA为基础配方，在倒平板前于超净工作台内用1.0M的NaOH溶液和1.0M HCl溶液配成pH值分别为3.0，4.0，5.0， 6.0，7.0，8.0和9.0的7个供试配方，将试验菌种接种到供试配方上，置于25℃暗培养5d后，观察菌丝长势并测定生长速度，其它要求与碳源试验相同，如图4所示，在pH值为4.0时，菌丝生长速度最快，可达4.96 mm·d-1。
(三)红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)在不同温度催芝试验中，以温度为26℃进行催芝管理，红肉灵芝菌盖不分化，极易形成鹿角灵芝，在30℃条件下，能菌盖和菌柄皆可正常分化。
如图5红肉灵芝(Ganoderma shanxiense)的菌盖表面和菌肉均为红褐色，菌盖光滑，漆状光泽明显(图5中LH676)。与对照灵芝(亮盖灵芝Ganoderma Lucidum)(图5中GL003)相比有明显区别。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山西农业大学山西功能食品研究院
<120> 一种灵芝菌株及其红肉灵芝子实体的培养方法
<130> 2021.3.10
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 643
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcatacaggt tttcgtaggt gacctgcgga ggtcattatc gagttttgac tgggttgtag 60
ctggccttcc gaggcatgtg cacgccctgc tcatccactc tacacctgtg cacttactgt 120
gggtttcagg tcgcgaagcg ggctctgtac gggcttgtga agcgcatctg tgcctgcgtt 180
tatcacaaac tccataaagt attagaatgt gtattgcgat gtaacgcatc tttatacaac 240
tttcagcaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt 300
aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg cgctccttgg 360
tattccgagg agcatgcctg tttgagtgtc atgaaatctt caacctacaa gctttgtagg 420
cttggacttg gaggcttgtt ggccgttatt ggtcagctcc tcttaaacaa attagcttga 480
ttccttgtgg atcggctctc ggtgtgataa tgtctacgcc gcgaccgtga agcgtttggc 540
gagcttctaa ccgtcccatt cggagacaac tttatgacct ctgacctcaa atcaggtagg 600
actacccgct gaacttaagc atatcaatag gccggaggaa aga 643