一种皱盖假芝菌种球及制备方法及其皱盖假芝菌的栽培方法
阅读说明：本技术 一种皱盖假芝菌种球及制备方法及其皱盖假芝菌的栽培方法 (Ganoderma cockle seed ball, preparation method and cultivation method of ganoderma cockle ) 是由 张煜隆 黄流塘 李治君 黄盛如 杨小平 陈丽丽 相杰 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了提供一种皱盖假芝菌种球及制备方法及其皱盖假芝的栽培方法,其采用液体培养的方式,4-6天内就可得到大量菌龄一致的同批次菌种球,且本技术方案得到的菌种球单球分离简单、活力旺盛,菌丝萌发点多,成本低,为后续的皱盖假芝菌规模化栽培提供大量的接种原料,降低皱盖假芝菌的栽培成本。本技术方案适合得到菌种球后,后续工厂化大量接种、出芝生产,也更符合国家生态要求。(The invention provides a strain seed ball of Erythrophlamus rudor, a preparation method thereof and a culture method of Erythrophlamus rudor, wherein a liquid culture mode is adopted, a large number of strain seed balls with consistent fungus age in the same batch can be obtained within 4-6 days, and the strain seed ball obtained by the technical scheme has the advantages of simple single-ball separation, vigorous activity, multiple hypha germination points and low cost, thereby providing a large amount of inoculation raw materials for the subsequent large-scale culture of the Erythrophlamus rudor and reducing the culture cost of the Erythrophlamus rudor. The technical scheme is suitable for subsequent industrialized mass inoculation and ganoderma lucidum production after the strain balls are obtained, and the national ecological requirements are met.)
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种皱盖假芝菌种球及制备方法及其皱盖假芝的栽培方法。
背景技术
皱盖假芝(Amauroderma rugosum)，又名黑假芝、乌芝、黑芝，属于真菌门，层菌纲，非褶菌目，灵芝科，假芝属。因其子实体在硬物触划损伤后会分泌出如血一样的红色汁液，因此又称为血灵芝、香血灵芝。皱盖假芝子实体菌盖肾型、半圆形，具辐射的深皱纹和细微绒毛，往往有同心环带，边缘薄，后期增厚呈平截、波浪状(赵继鼎、张小青《中国真菌志》第十八卷)，是一种热带亚热带地区特有的珍稀药用真菌(赵继鼎，1992；毕志树，1994)。《神农本草经》中早有记载：黑芝“咸，平，无毒”，主治“癃”，“利水道，益肾气，通九窍，聪察”。近年研究表明，皱盖假芝的多糖含量较高(肖自添等，2013)，很有研究前景。
目前人工栽培皱盖假芝还处于起步阶段，其规模化种植中，接种采用的菌种是传统在固体培养基上繁殖原种后进行批量接种，但该种栽培方法，原种的生产效率有限，原种及菌丝容易粘连，接种效率低，同时菌种生长同步性差，导致后续的出芝时间不一致，给规模化种植造成一定的困难。
中国专利202011587130.1(申请号)公开了一种皱盖假芝菌种及其栽培、采摘、保存方法，其提供了一种新的皱盖假芝菌种，其子实体成熟部分漆黑、幼嫩部分雪白，生长速度快，芝型好，杆粗壮坚硬。但其接种依然是采用固定培养基上繁殖原种后进行批量接种，规模化批量生产时接种采用的菌种需要无菌条件下多批次进行制备，大约需要30-40天的时间，导致菌种生长同步性差且成本较高。
发明内容
发明人提供一种皱盖假芝菌种球和制备方法，其采用液体培养的方式，4-6天内就可得到大量菌龄一致的同批次菌种球，且本技术方案得到的菌种球单球分离简单、活力旺盛，菌丝萌发点多，成本低，为后续的皱盖假芝菌规模化栽培提供大量的接种原料，降低皱盖假芝菌的栽培成本。
为实现上述目的，本发明的第一方面，发明人提供了一种皱盖假芝菌种球的制备方法，包括以下步骤：
母种制备：将皱盖假芝菌种接入灭菌后的母种培养料，22-28℃条件下培养，获得母种；
原种制备：无菌条件下，将所述母种接入灭菌后的原种培养料，22-28℃缺氧条件下培养至菌丝长满放置原种培养料的密封容器，获得原种；所述原种培养料的含水量为62-65％；
液体培养：将所述原种接入液体培养料，22-28℃条件下，摇菌培养4-6天，得到菌种球。
采用液体培养方式得到的菌种球生长周期一致、大小一致，直径约4.5-5.5mm，活力旺盛，菌丝萌发点多。菌种球悬浮于液体培养料中，采用简单过滤方式就可得到固态菌种球，菌种球彼此没有粘连，不需要分离，后续接种简单。除了传统的人工接种方式外，也可以采用自动化接种的方式进一步提高接种效率。
液体培养要注意培养时间，若培养时间过长，则菌种球会发生沉淀，菌丝生长过快也会发生粘连，成为大团块。
进一步的，所述液体培养步骤中，所述液体培养料1L的配方包括以下含量的组分：红糖：10-30g、鱼粉或蛋白胨：1-5g、磷酸二氢钾：1-2g、硝酸钾：1-2g、磷酸铵：1-2g、氯化钙：0.1-0.5g、硫酸锌：5-10mg、硫酸亚铁：5-20mg、甘氨酸：1-10mg、乙二胺四乙酸二钠：30-40mg、硫酸镁：0.1-0.2g、肌醇：0.05-0.2g。
进一步的，所述液体培养步骤中，摇菌速度为140-160rpm。
进一步的，所述液体培养步骤中，原种的接种量为2-3.2g/L液体培养料。
进一步的，所述母种制备步骤中，所述母种培养料由以下质量百分比含量的组分组成：马铃薯5-10％、琼脂1-2％、蔗糖1-2％、鱼粉1-2％、磷酸二氢钾0.05-0.2％，余量为水。
进一步的，所述原种制备步骤中，所述原种培养料采用原种基料加水配制，其中原种基料由以下质量百分比含量的组分构成：10-30目的麦麸：10-40％、红糖：0.2-2％、鱼粉：0.5-5％、石膏：1-3％、磷酸二氢钾：0.05-0.3％、余量为10-30目的玉米芯粉或谷壳粉。
本发明的第二方面，提供了一种皱盖假芝菌种球，所述皱盖假芝菌种球由本发明第一方面所述制备方法制得。
本发明的第三方面，提供了一种皱盖假芝的栽培方法，包括以下步骤；接种：无菌条件下，将本发明第二方面所述的皱盖假芝菌种球接入灭菌后的栽培料，22-28℃、空气相对湿度为70-80％，避光、缺氧条件下培养至菌丝长满放置所述灭菌后栽培料的密封容器；所述栽培料的pH值为5.4-5.6，含水量为56-65％；
出芝：将完成接种步骤，菌丝长满的栽培料移入22-28℃、空气相对湿度为80-120％的环境中，进行出芝栽培，至子实体生长成熟。
进一步的，所述接种步骤中，所述栽培料包括以下质量份的组分：栽培基料50-150质量份、玉米粉1-5质量份、磷酸二氢钾0.1-0.2质量份、石膏0.5-1质量份、轻质碳酸钙0.5-1质量份；所述栽培基料包括30-120质量份的主料与20-30质量份的辅料，所述主料包括木屑、竹屑、五节芒、玉米秸秆、棉籽壳、芦苇、芦竹、芒萁、斑茅或其组合物；所述辅料包括麦麸、米糠或其组合物。
进一步的，所述出芝步骤：当出芝前期，当芝柄高度小于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度大于0.1％；当芝柄高度大于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度小于0.1％。
区别于现有技术，上述技术方案至少包括以下有益效果：提供一种皱盖假芝菌种球和制备方法，其采用液体培养的方式，4-6天内就可得到大量菌龄一致的同批次菌种球，且本技术方案得到的菌种球单球分离简单、活力旺盛，菌丝萌发点多，成本低，为后续的皱盖假芝菌规模化栽培提供大量的接种原料，降低皱盖假芝菌的栽培成本。本技术方案的效率高于现有方法2000倍，适合得到菌种球后，后续工厂化大量接种、出芝生产，也更符合国家生态要求。
附图说明
图1为实施例1所得到的皱盖假芝菌菌种球照片；
图2为实施例2所得到的皱盖假芝菌菌种球照片。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
本实施方式中所使用的皱盖假芝菌种，名称为RFC，拉丁分类名为：Amaurodermarugosum，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020534；地址为中国武汉武汉大学；保藏日期为2020年10月8日。实施例1一种皱盖假芝菌种球的制备母种制备：将皱盖假芝菌种接入121℃高压灭菌后的母种培养料，22-28℃条件下培养，获得母种；所述母种培养料由以下质量百分比含量的组分组成：马铃薯粉5％、琼脂1.2％、蔗糖1％、鱼粉1％、磷酸二氢钾0.1％，余量为水。原种制备：无菌条件下，将母种接入121℃高压灭菌后的原种培养料，22-28℃缺氧条件下培养至菌丝长满放置原种培养料的密封容器，获得原种；所述原种培养料的含水量为62％；所述原种培养料采用原种基料加水配制，其中原种基料由以下质量百分比含量的组分构成：10-30目的麦麸：20％、红糖：0.5％、鱼粉：0.5％、石膏：1.5％、磷酸二氢钾：0.1％、余量为10-30目的玉米芯粉。液体培养：将原种接入121℃高压灭菌后液体培养料，22-28℃条件下，150rpm摇菌培养4-6天，得到菌种球。所述液体培养料1L的配方包括以下含量的组分：红糖：15g、蛋白胨：2g、磷酸二氢钾：1g、硝酸钾：1g、磷酸铵：1g、氯化钙：0.2g、硫酸锌：5mg、硫酸亚铁：10mg、甘氨酸：5mg、乙二胺四乙酸二钠：30mg、硫酸镁：0.1g、肌醇：0.1g。
采用鱼粉为原种基料，进行液体培养方式得到的菌种球，如图1所示，菌种球中有沉淀物质，但不影响使用。实施例1得到的菌种球生长周期一致、大小一致，直径约4.5-5.5mm，活力旺盛，菌丝萌发点多。菌种球长满液体培养料空间为悬浮小颗粒，颗粒间无大块粘连，采用简单过滤方式就可得到固态菌种球，菌种球彼此没有粘连，不需要分离，后续接种简单。
实施例2一种皱盖假芝菌种球的制备：
母种制备：将皱盖假芝菌种接入121℃高压灭菌后的母种培养料，22-28℃条件下培养，获得母种；所述母种培养料由以下质量百分比含量的组分组成：马铃薯粉7％、琼脂1.5％、蔗糖1％、鱼粉1％、磷酸二氢钾0.1％，余量为水原种制备：无菌条件下，将母种接入121℃高压灭菌后的原种培养料，22-28℃缺氧条件下培养至菌丝长满放置原种培养料的密封容器，获得原种；所述原种培养料的含水量为62％；所述原种培养料采用原种基料加水配制，其中原种基料由以下质量百分比含量的组分构成：10-30目的麦麸：25％、红糖：1％、鱼粉：2％、石膏：2％、磷酸二氢钾：0.1％、余量为10-30目的玉米芯粉。液体培养：将原种接入121℃高压灭菌后液体培养料，22-28℃条件下，150rpm摇菌培养4-6天，得到菌种球。所述液体培养料1L的配方包括以下含量的组分：红糖：20g、蛋白胨：5g、磷酸二氢钾：2g、硝酸钾：1.5g、磷酸铵：1.1g、氯化钙：0.3g、硫酸锌：5mg、硫酸亚铁：20mg、甘氨酸：5mg、乙二胺四乙酸二钠：30mg、硫酸镁：0.2g、肌醇：0.1g。
采用蛋白胨为原种基料，进行液体培养方式得到的菌种球，如图2所示，菌种球为透明球体，实施例2得到的菌种球生长周期一致、大小一致，直径约4.5-5.5mm，活力旺盛，菌丝萌发点多。菌种球长满液体培养料空间为悬浮小颗粒，颗粒间无大块粘连，无大块粘连，采用简单过滤方式就可得到固态菌种球，菌种球彼此没有粘连，不需要分离，后续接种简单。
实施例3一种皱盖假芝菌种球的制备
母种制备：将皱盖假芝菌种接入121℃高压灭菌后的母种培养料，22-28℃条件下培养，获得母种；所述母种培养料由以下质量百分比含量的组分组成：马铃薯粉5％、琼脂1％、蔗糖1％、鱼粉1％、磷酸二氢钾0.05％，余量为水。原种制备：无菌条件下，将母种接入121℃高压灭菌后的原种培养料，22-28℃缺氧条件下培养至菌丝长满放置原种培养料的密封容器，获得原种；所述原种培养料的含水量为62％；所述原种培养料采用原种基料加水配制其中原种基料由以下质量百分比含量的组分构成：10-30目的麦麸：10％、红糖：0.2％、鱼粉：0.5％、石膏：1％、磷酸二氢钾：0.05％、余量为10-30目的谷壳粉。液体培养：将原种接入121℃高压灭菌后液体培养料，22-28℃条件下，150rpm摇菌培养4-6天，得到菌种球。所述液体培养料1L的配方包括以下含量的组分：红糖：10g、蛋白胨：1g、磷酸二氢钾：1g、硝酸钾：1g、磷酸铵：1g、氯化钙：0.1g、硫酸锌：5mg、硫酸亚铁：5mg、甘氨酸：1mg、乙二胺四乙酸二钠：30mg、硫酸镁：0.1g、肌醇：0.05g。
实施例4一种皱盖假芝菌种球的制备
母种制备：将皱盖假芝菌种接入121℃高压灭菌后的母种培养料，22-28℃条件下培养，获得母种；所述母种培养料由以下质量百分比含量的组分组成：马铃薯粉10％、琼脂2％、蔗糖2％、鱼粉2％、磷酸二氢钾0.2％，余量为水。原种制备：无菌条件下，将母种接入121℃高压灭菌后的原种培养料，22-28℃缺氧条件下培养至菌丝长满放置原种培养料的密封容器，获得原种；所述原种培养料的含水量为65％；所述原种培养料采用原种基料加水配制其中原种基料由以下质量百分比含量的组分构成：10-30目的麦麸：40％、红糖：2％、鱼粉：5％、石膏：3％、磷酸二氢钾：0.3％、余量为10-30目的谷壳粉。
液体培养：将原种接入121℃高压灭菌后液体培养料，22-28℃条件下，150rpm摇菌培养4-6天，得到菌种球。所述液体培养料1L的配方包括以下含量的组分：红糖：30g、鱼粉或蛋白胨：5g、磷酸二氢钾：2g、硝酸钾：2g、磷酸铵：2g、氯化钙：0.5g、硫酸锌：10mg、硫酸亚铁：20mg、甘氨酸：10mg、乙二胺四乙酸二钠：40mg、硫酸镁：0.2g、肌醇：0.2g。
实施例5一种皱盖假芝的栽培方法
接种：无菌条件下，将实施例2所制备的皱盖假芝菌种球接入含灭菌后的栽培料，22-28℃、空气相对湿度为70-80％，避光、缺氧条件下培养至菌丝长满放置栽培料的密封容器；所述栽培料的pH值为5.4-5.6，含水量为56-65％；所述栽培料包括以下质量份的组分：木屑100质量份、麦麸20质量份、玉米粉1-5质量份、磷酸二氢钾0.1-0.2质量份、石膏0.5-1质量份、轻质碳酸钙0.5-1质量份。
出芝：将栽培前处理后的菌袋移入22-28℃、空气相对湿度为80-120％的环境中，进行出芝栽培，至子实体生长成熟。出芝栽培前期，当芝柄高度小于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度大于0.1％；当芝柄高度大于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度小于0.1％。
在接种步骤中，采用本技术方案所述的菌种球进行接种，原种的接种量为2-3.2g/L液体培养料，而4ml的含菌种球的液体培养料即可接种一袋1.2kg栽培料的菌袋，而传统的原种接种方式，一袋1.2kg的菌袋则需要21.4g的原种进行接种。按照本技术方案采用菌种球进行接种，相比现有的原种接种方法，效率可提高2000倍左右。由于菌种球一批次可大量生产，因此菌种球的制备过程可在无菌实验室中进行，而皱盖假芝的接种和出芝步骤则可在普通芝厂中进行。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
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