具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种能够有效促进巨噬细胞由M1向M2亚型转化的无细胞脂肪提取物，对糖尿病、炎症和胰岛素抵抗具有优异的改善作用。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。

如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

如本文所用，“糖尿病”是指以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。代表性地，所述的高血糖包括1型糖尿病和2型糖尿病。

如本文所用，“1型糖尿病”又可称为胰岛素依赖型糖尿病，是由于体内胰岛素绝对不足引起的糖尿病，多发生在儿童和青少年，也可发生于各种年龄。起病比较急剧，体内胰岛素绝对不足，容易发生酮症酸中毒，必须用胰岛素治疗才能获得满意疗效，否则将危及生命。

如本文所用，“2型糖尿病”是指患者体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果较差。

如本文所用，“胰岛素抵抗”是一种机体对内源性分泌或外源性注射的胰岛素反应均下降的异常生理状态。胰岛素抵抗是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗易导致代谢综合征和2型糖尿病。50年代Yallow等应用放射免疫分析技术测定血浆胰岛素浓度，发现血浆胰岛素水平较低的病人胰岛素敏感性较高，而血浆胰岛素较高的人对胰岛素不敏感，由此提出了胰岛素抵抗的概念。

在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法。本文中使用的"预防"还包括延迟疾病和/或它的附随症状的发作和降低对象的得病的风险。

本发明所述的“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的组合物、药盒、食品盒或保健品盒、活性成分组合时观察到的水平相比，本发明所述组合物或药物组合物减轻、抑制和/或逆转了糖尿病例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。

如本文所用，“改善”包括预防、治疗、缓解、逆转和减轻等等。

如本文所用，“IL-1b”指白介素-1b。

如本文所用，“IL-6”指白介素-6。

如本文所用，“TNF-α”指肿瘤坏死因子α。

无细胞脂肪提取物(Cell free fat extract,CEFFE)及其制备方法

如本文所用，术语“本发明的无细胞脂肪提取物”、“本发明提取物”、“本发明的脂肪提取物”等可互换使用，指在脂肪提取物制备过程中(除漂洗步骤外)未添加任何溶液、溶剂、小分子、化学制剂、和生物添加剂所制备的源自脂肪组织的提取物(或提取液)。一种典型的制备本发明提取物的方法如上本发明第二方面中所述。此外，应理解，虽然本发明提取物在制备过程中不必添加任何添加剂(或添加成分)，但是也可以添加一些或少量的对本发明提取物的活性无负面或不利影响的安全的物质(如少量水)。

代表性地，本发明所述的无细胞脂肪提取物通过以下方法制备：

(1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料剪碎，并进行漂洗(如用生理盐水)，从而获得经漂洗的脂肪组织；

(2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物；

(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)；

(4)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)；

(5)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物；和

(6)对所述脂肪初提物进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地1-8min，最佳地1-5min。

在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述的乳化为机械乳化。

在另一优选例中，所述机械乳化为经注射器反复吹打(如吹打20-200次，较佳地20-150次，更佳地20-100次，更佳地30-50次)进行机械乳化。

在另一优选例中，所述的吹打的方式为2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打。

在另一优选例中，，所述的步骤(4)中，所述乳化为通过组织匀浆机打碎的方法。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，在将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理前，还包括对所述乳化的脂肪混合物冷冻后解冻处理。

在另一优选例中，冷冻后解冻处理后，将解冻后的混合物用于离心。

在另一优选例中，所述的冷冻的温度为-50℃至-120℃，较佳地-60℃至-100℃，更佳地-70℃至-90℃。

在另一优选例中，所述的解冻的温度为20-40℃，较佳地25-40℃，更佳地37℃。

在另一优选例中，所述的冷冻后解冻的循环次数为1-5次(优选为1、2、3或4次)。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，离心后，所述乳化的脂肪混合物分层4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层(即为中间液体层)，第四层为细胞/组织碎片沉淀层。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地2-8min，最佳地3-7min。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，第一层、第二层、第三层和第四层从上到下依次排列。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述的中间液体层为透明或基本透明层。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤包能够将脂肪初提物中的脂肪细胞除去。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是通过滤器(如0.22μm微孔滤膜)进行。

在另一优选例中，所述的过滤器为微孔滤膜过滤器。

在另一优选例中，所述的微孔滤膜的孔径大小为0.05-0.8μm，较佳地0.1-0.5μm，更佳地0.1-0.4μm，更佳地0.15-0.3μm，更佳地0.2-0.25μm，最佳地0.22μm。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是先通过可滤去细胞的第一过滤器，然后再通过可滤去病原体(如细菌)的第二滤器(如0.22μm的滤器)进行的。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，还包括对所述脂肪提取物进行分装，形成分装的产品。(所述分装后的提取物可于-20℃保存待用；可低温(如-4℃)或常温解冻后直接使用，或解冻后置于低温(如4℃)保存一段时间，然后使用)。

用途

本发明所述的无细胞脂肪提取物能够有效促进巨噬细胞由M1向M2亚型转化的无细胞脂肪提取物，对糖尿病、炎症和胰岛素抵抗具有优异的改善作用。

代表性地，本发明所述的无细胞脂肪提取物包括选自下组的一种或多种用途：i)促进巨噬细胞由M1向M2亚型转化；(ii)预防和/或治疗糖尿病及其并发症；(iii)预防和/或治炎症；和/或(iv)改善胰岛素抵抗。

在一个优选例中，所述的糖尿病选自下组：1型糖尿病、2型糖尿病，或其组合。

在另一优选例中，所述的糖尿病包括由胰岛素抵抗引起的糖尿病。

在另一优选例中，所述的糖尿病包括肥胖型糖尿病。

在另一优选例中，所述的糖尿病包括高脂饮食引起的糖尿病。

代表性地，所述的糖尿病并发症选自下组：糖尿病性视网膜病变、与糖尿病相关的葡萄膜炎、糖尿病性白内障、糖尿病足、糖尿病心血管并发症、糖尿病性脑血管病、糖尿病神经病变，或其组合。

在另一优选例中，所述的预防和/或治疗糖尿病及其并发症包括选自下组的一种或多种进行预防和/或治疗：

(ii-1)降低血糖含量；

(ii-2)改善胰岛素抵抗

(ii-3)减轻外周组织巨噬细胞浸润。

在另一优选例中，所述的胰岛素抵抗包括肥胖引起的胰岛素抵抗。

在另一优选例中，所述的胰岛素抵抗包高脂饮食引起的胰岛素抵抗。

在另一优选例中，所述的糖尿病包括外周组织和器官的炎症和/或外周组织和器官的巨噬细胞浸润引起的胰岛素抵抗。

在另一优选例中，所述的胰岛素抵抗包括外周组织和器官的炎症和/或外周组织和器官的巨噬细胞浸润引起的胰岛素抵抗。

在另一优选例中，所述的预防和/或治炎症包括降低炎症炎症因子水平。

在另一优选例中，所述的炎症因子选自下组：IL-1b、IL-6、TNF-α、F4/80，或其组合。

在另一优选例中，所述的炎症包括外周组织和器官的炎症。

在另一优选例中，所述的炎症包括肥胖引起的炎症。

在另一优选例中，所述的炎症包括高脂饮食引起的炎症。

在另一优选例中，所述的改善胰岛素抵抗包括选自下组的一种或多种进行改善：

(iv-1)改善外周组织和器官的炎症；

(iv-2)改善外周组织和器官的巨噬细胞浸润。

在另一优选例中，所述的外周组织选自下组：脂肪组织、骨骼肌肌组织，或其组合。

在另一优选例中，所述的脂肪组织包括腹股沟脂肪组织。

在另一优选例中，所述的骨骼肌肌组织包括腓肠肌组织。

在另一优选例中，所述的器官包括肝脏。

在另一优选例中，所述的巨噬细胞包括表达CD68的巨噬细胞。

本发明还提供一种(i)促进巨噬细胞由M1向M2亚型转化；(ii)预防和/或治疗糖尿病及其并发症；(iii)预防和/或治炎症；和/或(iv)改善胰岛素抵抗的方法，所述方法包括步骤：对需要的对象施用本发明所述的无细胞脂肪提取物。

在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如大鼠、小鼠。

组合物和施用

本发明所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、保健组合物、膳食补充剂等。

代表性地，可将本发明的无细胞脂肪提取物制备成药物组合物，诸如片剂、胶囊、粉剂、微粒剂、溶液剂、锭剂、胶冻、乳膏制剂、醑剂、悬液、酊、泥敷剂、搽剂、洗剂、和气雾剂之类的剂型。药物组合物能够由通常已知的制备技术来制备，并且合适的药物添加剂能够被添加到该药物中。

本发明的组合物还可以包括药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体。“药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明组合物施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内)、局部施用，优选的施用方式为口服施用和注射施用。

用于口服施用或给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，。

用于口服施用或给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部施用或给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明无细胞脂肪提取物可以单独施用或给药，或者与其它预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症的药物联合施用或给药。

施用组合物时，是将安全有效量的本发明无细胞脂肪提取物适用于需要治疗的人或非人动物(如大鼠、小鼠、狗、猫、牛、鸡、鸭等)，其中施用时剂量为药学上、食品上或保健品上可接受认为的有效给药剂量。如本文所用，术语“安全有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“安全有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。例如，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.1～1000mg，优选1～600mg，更优选为2-300mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

本发明首次发现无细胞脂肪提取物能够促进巨噬细胞由M1向M2亚型转化，并以高脂饮食诱导的II型糖尿病模型小鼠为模型，证实了CEFFE治疗能够调节外周组织巨噬细胞极化，减少巨噬细胞募集，改善肥胖相关慢性炎症，提高胰岛素敏感性，提示了CEFFE在肥胖相关代谢性疾病中的治疗潜力，同样提示了CEFFE在巨噬细胞极化参与的免疫炎症反应相关疾病中的治疗价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

1.无细胞脂肪提取液(Cell free fat extract,CEFFE)的制备

脂肪由自愿者在获得知情同意的条件下获得。无细胞脂肪组织提取液的制备方法如下：

(1)取抽吸或手术切除得到的脂肪，剪碎后用生理盐水漂洗3遍。

(2)取经漂洗后的脂肪组织，置于离心管中，放入离心机中以1200g离心3分钟后，获得分层的混合物。

(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)。

(4)对所述中间层，用2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打30次，从而进行机械乳化，并获得经机械乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)。

(5)将所述经机械乳化的脂肪混合物置入-80℃冰箱冷冻，再进行37℃水浴解冻，单次冻融循环后，将解冻后的脂肪混合物以1200g离心5分钟，获得分层的混合物，分层的混合物共分为4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层，第四层为细胞/组织碎片沉淀层，去除油层和残余脂肪组织层，吸取液体层，吸取过程中避免细胞/组织碎片沉淀层污染，从而得到脂肪初提取液。

(6)将得到的脂肪初提取液经0.22μm滤器过滤除菌，从而灭菌并去除可能混有的活细胞，从而获得无细胞脂肪提取液，分装冻存于-20℃保存，使用时4℃解冻。

2.细胞培养：

小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7(M0巨噬细胞)购自中科院细胞库，脂多糖(LPS)和干扰素-γ(IFN-γ)购自美国Sigma公司。RAW264.7(M0巨噬细胞)采用高糖DMEM添加10％胎牛血清培养基培养于37℃、5％CO2培养箱中，隔日换液，90％密度时传代，得到M0巨噬细胞培养。

以100ng/mL LPS和30ng/mL IFN添加入巨噬细胞培养基，建立体外炎症模型。

CEFFE处理组以10％浓度CEFFE(v/v)添加入细胞培养基。

3.流式细胞学测定

将步骤2体外培养的M0巨噬细胞分成空白组(Control组)、CEFFE组、LPS+IFN-γ组和LPS+IFN-γ+CEFFE组，其中，在CEFFE组中，向M0巨噬细胞培养基中添加CEFFE，CEFFE的浓度为10％(v/v)的细胞培养基；在LPS+IFN-γ组中，向M0巨噬细胞培养基中添加LPS(100ng/mL)和IFN-γ(30ng/mL)；在LPS+IFN-γ+CEFFE组中，向M0巨噬细胞培养基中添加LPS(100ng/mL)、IFN-γ(30ng/mL)和CEFFE(浓度为10％(v/v)的细胞培养基)；Control组中不加任何药物处理。不同组的M0巨噬细胞体外培养24h后，消化、收集细胞，采用荧光标记的CD86、CD206抗体分别孵育细胞，4℃30min，清洗、重悬、流式细胞仪检测细胞荧光表达情况。

LPS和IFN能够刺激M0巨噬细胞向M1亚型极化，从而建立体外炎症模型。CD86是M1亚型巨噬细胞表面标志，CD206是M2亚型巨噬细胞表面标志，培养24h后，流式细胞仪检测M1亚型巨噬细胞表面标志CD86与M2亚型巨噬细胞表面标志CD206的阳性细胞数及其百分比如图1所示。

从图1中可以，与Control组相比，CEFFE组中CEFFE培养未能使M0巨噬细胞出现明显极化亚型，虽然CD86+细胞百分比略增加至3.73％，但仍远低于LPS+IFN-γ组(35.96％)。与M1常规诱导的LPS+IFN-γ组相比，LPS+IFN-γ+CEFFE组中，添加CEFFE能够明显降低CD86+细胞百分比，增加CD206+细胞比例，且两种表型细胞比例的降低与增加幅度基本相同(约12％)，表明CEFFE处理促进了巨噬细胞由M1向M2亚型的转化。

4.高脂诱导的胰岛素抵抗小鼠模型建立和药效学研究

4.1高脂诱导的胰岛素抵抗小鼠模型建立、分组和给药处理

6周龄C57小鼠购自上海实验动物中心，小鼠胰岛素抵抗模型通过连续15周高脂饮食诱导。喂养15周后，小鼠进行空腹糖耐量和胰岛素耐量检测。随后，将小鼠分为三组，空白对照组(普通饮食喂养，Chow组)，阴性对照组(高脂饮食+注射PBS，PBS组)和CEFFE组(高脂饮食+注射CEFFE，CEFFE组)。4天尾静脉注射一次，一共注射7次，治疗周期为30日，其中，每次CEFFE注射剂量为250μl，以注射PBS作为阴性对照，以CHOW作为空白对照。治疗期间定期监测随机血糖和体重。

30日治疗结束后，再次进行空腹糖耐量实验和胰岛素耐量实验，并抽取小鼠血液进行血液学检查；取模型小鼠肝脏、腹股沟脂肪和腓肠肌组织，分别进行RT-PCR检测外周组织炎性因子表达和免疫染色，结果如下：

4.2高脂诱导的胰岛素抵抗小鼠模型进行药效学研究

统计分析：数据采用SPSS软件进行单因素ANOVA检验，对数据差异显著性进行统计分析，结果以平均数±标准差表示。

4.2.1糖耐量及胰岛素耐量检测：

对葡萄糖耐量检测：空腹12h后腹腔注射葡萄糖分别于0、15、30、60、90和120min检测小鼠尾静脉血糖水平。对葡萄糖耐量检测如图2所示。

对胰岛素耐量检测：小鼠禁食6h后腹腔注射胰岛素，分别于0、15、30、60、90和120min检测小鼠尾静脉血糖水平。对胰岛素耐量检测如图3所示。

从图2和图3中可以看出，与空白对照组相比，高脂饮食阴性对照组小鼠0、15、30、60、90、120min血糖水平显著增高，糖耐量和胰岛素耐量曲线下面积(AUC)显著增加。与阴性对照组相比，CEFFE治疗组小鼠血糖水平与AUC均显著降低，说明CEFFE治疗能够提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗。以上结果表明，CEFFE治疗能够通过调节外周组织巨噬细胞极化改善胰岛素抵抗。

4.2.2RT-PCR检测外周组织炎性因子表达

取模型小鼠肝脏、腹股沟脂肪和腓肠肌组织，Trizol提取总RNA，分光光度法在260/280nm波长下计算RNA浓度。EZbioscience试剂盒进行逆转录后，通过RT-PCR荧光检测IL-1b、IL-6、TNF-a、F4/80表达水平。总反应体系20ul，扩增条件：95℃10min初变性；95℃15s，62℃60s，循环40次。反应结束后对RT-PCR结果进行相对定量统计，RT-PCR检测外周组织和器官炎性因子基因的相对表达如图4所示：

从图4中可以看出，与空白对照组相比，高脂喂养阴性对照组小鼠肝脏、脂肪与骨骼肌组织中炎症因子表达增加，而CEFFE治疗后明显下降，说明CEFFE能够有效减轻糖尿病小鼠外周组织和器官炎症。

4.2.3免疫染色

取模型小鼠肝脏、腹股沟脂肪和腓肠肌组织，浸于4％多聚甲醛，固定24h后石蜡包埋，常规做石蜡切片、脱蜡、水化后高压修复，5％BSA封闭后采用1:100CD68孵育4℃过夜，第二天于充分清洗后滴加HRP-二抗，37℃30min孵育后DAB显色。光学显微镜拍照，ImageJ计数分析，肝脏、脂肪与骨骼肌组织中巨噬细胞标志物CD68染色如图5所示。

从图5中可以看出，与阴性对照组相比，CEFFE治疗组CD68+巨噬细胞数明显下降，说明CEFFE治疗能够有效减轻外周组织巨噬细胞浸润。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。