从吸脂废液中制备的脂肪组织精华、其制备方法和应用
阅读说明：本技术 从吸脂废液中制备的脂肪组织精华、其制备方法和应用 (Adipose tissue essence prepared from liposuction waste liquid, and preparation method and application thereof ) 是由 田卫东 于湄 伍月 刘磊 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了从吸脂废液中制备的脂肪组织精华、其制备方法和应用,属于生物医学技术领域,解决现有技术中脂肪组织提取物有效成分含量低、无法满足临床需求的问题。本发明提供的从吸脂废液中制备脂肪组织精华的方法包括以下步骤：取吸脂手术产生的手术废弃液,去除油脂和脂肪颗粒,得到液体部分；将液体过滤,收集滤液；将滤液差速离心,收集上清液；将上清液超滤浓缩,即得。本发明以临床抽脂后的脂肪废液为原料,变废为宝,且来源广泛,便于临床推广。本发明制得的精华无活细胞,细胞外囊泡和脂肪因子成液体状态,可注射性好。实验表明,本发明的精华具有良好的促进包括毛发再生的组织再生的作用。(The invention discloses adipose tissue essence prepared from liposuction waste liquid, a preparation method and application thereof, belongs to the technical field of biomedicine, and solves the problems that in the prior art, an adipose tissue extract is low in effective component content and cannot meet clinical requirements. The method for preparing the adipose tissue essence from the liposuction waste liquid comprises the following steps: taking operation waste liquid generated in liposuction operation, and removing grease and fat particles to obtain a liquid part; filtering the liquid, and collecting filtrate; centrifuging the filtrate at a differential speed, and collecting supernatant; and (4) performing ultrafiltration concentration on the supernatant to obtain the product. The invention takes the fat waste liquid after clinical liposuction as the raw material, changes waste into valuable, has wide sources and is convenient for clinical popularization. The essence prepared by the invention has no living cells, and the extracellular vesicles and the fat factors are in a liquid state and have good injectability. Experiments show that the essence of the invention has good effect of promoting the regeneration of tissues including hair regeneration.)
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种从吸脂废液中制备脂肪组织精华的方法、采用该方法制得的脂肪组织精华和应用。
背景技术
近年来，随着社会竞争增加以及环境日益恶化，脱发发生的比例呈上升态势，并且年轻化趋势明显。脱发不仅影响外貌，还可能导致心理问题。现有技术中，脱发的治疗方法包括采用米诺地尔、非那雄胺、富含血小板血浆(PRP)、低水平激光治疗(LLLT)、干细胞治疗、毛囊移植等方法。不幸地，现有技术中所有的治疗方法都有局限性的。根据以往的研究，米诺地尔引起不良反应的比率高，如应用部位灼烧或瘙痒，过敏性接触性皮炎和心血管疾病等。非那雄胺是与性欲减退，男性乳房发育和心理障碍并发症相关联的。低水平激光治疗可能导致皮肤干燥、瘙痒和头皮敏感等不良反应。PRP在准确的浓度、给药剂量和注射深度方面没有达成一致的给药标准，并且通常导致疼痛和红斑。干细胞治疗由于其安全性、有效性和可行性等方面因素限制其临床上使用。毛囊移植价格非常昂贵，并且毛囊供体来源有限。因此，探索一种新的脱发治疗方法是非常有必要的。
吸脂手术产生的物质置于同一容器中时，其主要分为上下两部分：上层为油性的脂肪层，下层为含有脂肪、细胞、组织液、血液和麻醉液的吸脂手术废弃液。现有技术中，利用上层的脂肪层物质可以制备干细胞以及细胞外基质产品，但对于下层的吸脂手术废弃液，一直被当做医疗废液处理，尚未见到相关报导将其加以利用。
此外，在临床中发现，采用自体脂肪移植的区域的皮肤状况得到了改善。并且脂肪组织无细胞衍生物，例如脂肪干细胞培养基、脂肪干细胞外泌体能够抗皮肤衰老，促进伤口愈合和减少瘢痕形成的作用在实验和临床中得以证明。但是干细胞的提取和大量的扩增培养对操作环境要求高，操作过程繁琐，费时费力。然后再从其培养基中获取有效成分，例如外泌体等，这无疑又是一个费时费力的复杂过程。如果我们能够将大体积的抽脂废液加以开发利用，并解决快速高效地获取其中有效成分的问题，这将为抽脂废弃物的变废为宝和满足临床治疗需求提供新的思路。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种脂肪组织精华的制备方法，解决现有技术中吸脂手术废液未被有效利用的问题。
本发明的目的之二在于，提供采用上述方法制得的脂肪组织精华。
本发明的目的之三在于，提供用上述方法制得的脂肪组织精华的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的一种脂肪组织精华的制备方法，包括以下步骤：
S1.取吸脂产生的手术废弃液，去除油脂和脂肪颗粒，得到液体部分；
S2.将S1得到液体过滤，收集滤液；
S3.将S2得到的滤液差速离心，收集上清液；
S4.将上清液超滤浓缩，即得所述脂肪组织精华。
本发明的部分实施方案中，所述吸脂产生的手术废弃液中包括有残留脂肪、细胞、组织液、血液和麻醉药剂。
吸脂手术在操作过程中，先将肿胀液打入皮下脂肪层后，通过超声或者抽脂针的移动，使组织解离(部分细胞会在此过程中破裂)，通过吸脂针的负压作用吸出脂肪细胞。皮下脂肪层内有血管，所以抽脂过程中，不仅抽到脂肪细胞还有其他血液。将吸脂抽出的物质静置后分为上下两层，上层为油性脂肪，下层为本发明的原料：吸脂产生的手术废弃液。因此，该手术废弃液中包括有残留脂肪、细胞、组织液、血液和麻醉药剂。
本发明的部分实施方案中，S2中的过滤为采用细胞过滤筛过滤。
本发明的部分实施方案中，所述细胞过滤筛的筛网孔径为10～100μm，优选为30μm。
本发明将S1得到的液体经过滤后，去除大块的脂肪组织悬浮物。
本发明的部分实施方案中，S3中所述的差速离心至少包括三次不同离心速度的离心，每次离心后，收集上清液，离心转速由低至高分别为200～400g/min、1500～2500g/min、10000～20000g/min。
本发明的部分实施方案中，第一次和第二次离心的时间均为5～20min，第三次的离心时间为0.5～2小时。
优选地，第一次和第二次离心的时间均为10min，第三次的离心时间为1小时。
本发明将S2得到的滤液经三次离心，第一次离心去除液体中的细胞成分(10μm～30μm)，第二次离心再去除细胞碎片成分(1～10μm)，第三次离心去除液体内大囊泡(0.3～2μm)，例如凋亡小体。
本发明的部分实施方案中，浓缩倍数为5～15倍；优选为10倍。
本发明的部分实施方案中，还包括除菌步骤：将S3得到的上清液经过滤除菌后，再超滤浓缩。
本发明提供的制备方法制得的脂肪组织精华。
本发明提供的制备方法制得的脂肪组织精华在制备促进组织再生的产品中的应用，优选地，在制备促进毛发再生的产品中的应用。
采用本发明方法得到的脂肪组织精华，不仅含有高浓度的细胞外囊泡，还含有大量蛋白成分(例如脂肪因子)，具有更好的促进毛发再生的作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计科学，构思巧妙，以抽脂产生的手术废弃液为原料，实现变废为宝。
本发明的原料来源广泛，便于临床推广。
本发明方法简单，操作简便，能快速高效地从大体积样本中获取细胞外囊泡和蛋白，具有规模化生产的潜能。
本发明方法采用为纯物理性操作，所得精华中没有添加任何化学试剂，安全性好，便于临床应用。
采用本发明方法制得的精华无活细胞，无需对细胞活性进行进一步的检测。精华为液体状态，可注射性好；且经过浓缩后的精华有效成分(细胞外囊泡及蛋白)含量高，麻药(利多卡因)的浓度低于手术注射浓度，可安全进行后续体内施用。实验表明，本发明的精华具有良好的促进毛发再生、血管再生和组织再生的作用。
附图说明
附图1为本发明的AT-XOs制备流程图；
附图2为脂肪组织精华的显微图。
附图3A为不同浓缩倍数的AT-XOs中细胞外囊泡粒径大小比较结果图；
附图3B为相同体积的不同浓缩倍数的AT-XOs中蛋白含量比较结果图；
附图3C为相同体积的不同浓缩倍数的AT-XOs中细胞外囊泡颗粒数比较结果图；
附图4为试验例1的利多卡因检测结果比较图；
附图5为实施例1制备的AT-XOs中所含脂肪因子检测结果图；
附图6为试验例1的不同时间点各组小鼠的大体观图；
附图7为试验例1第12天时各组小鼠脱毛区背部毛发生长典型图；
附图8为试验例1第15天对照组和实验组背部皮肤内面观图；
附图9为试验例1对照组和实验组背部皮肤样本组织学分析图；其中A图为对照组背部皮肤样本组织学分析图，图C为图A框线部分放大图；B图为实验组背部皮肤样本组织学分析图，图D为图B框线部分放大图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术方案均属于本发明的范围。
实施例1
本实施例公开了本发明的脂肪组织精华的制备方法，其流程参见附图1，具体为：
S1.取吸脂产生的手术废弃液(附图1中所示容器的下层液体部分)，去除油脂和脂肪颗粒，得到液体部分；
S2.将S1得到液体通过500目细胞过滤筛(30μm孔径)过滤，收集滤液；
S3.将S2得到的滤液差速离心，首先于转速300g/min条件下离心10min，收集离心后的上清液；
将上清液于转速2000g/min条件下离心时长为10min，收集离心后的上清液；
将第二次离心后得到的上清液于转速15000g/min条件下离心1h，收集离心后的上清液。
S4.将上清液用0.22μm孔径的过滤器过滤除菌，滤液通过切向流超滤系统进行10X浓缩，安装500KD Millipore过滤器，得到的回流液为脂肪组织精华(AT-XOs)。
实施例2
对实施例1制得的脂肪组织精华的显微结构进行了观察取脂肪组织精华用4％多聚甲醛固定10min，将其适当稀释后，滴于载样铜网上，用滤纸吸去多余液体，晾干，加入1％乙酸双氧铀负染，透射电镜下观察。结果参见附图2。
由附图2可知，脂肪组织精华中主要含有200nm以下的囊泡(如空心箭头所示)。
实施例3
本实施例对脂肪组织精华的浓缩倍数进行了考察。脂肪组织精华的制备方法同实施例1，区别在于步骤S4的浓缩倍数不同。本发明对S3离心后的上清液分别进行5倍浓缩、10倍浓缩、15倍浓缩，并对浓缩得到的脂肪组织精华进行细胞外囊泡(EV)的数量以及蛋白浓度两方面评估。
结果如附图3A、3B、3C所示。
从DLS数据(附图3A)中可以看出经过切向流超滤系统浓缩后脂肪组织精华中含有粒径大小在100nm左右的囊泡，且不同浓缩倍数得到的AT-XOs粒径大小没有明显差别。
BCA蛋白定量(附图3B)结果表明，脂肪组织精华中的蛋白浓度随着浓缩倍数递增而等比例增加。
采用Nanoparticle tracking analysis(NTA)对不同浓缩倍数的脂肪组织精华中的细胞外囊泡进行计数，结果(附图3C)显示，脂肪组织精华中的细胞外囊泡浓度随着浓缩倍数递增而增加，但是，相较于5倍浓缩、10倍浓缩的细胞外囊泡增加比例，15倍浓缩后细胞外囊泡的浓度比10倍浓缩的样本没有明显提高。
所以，由细胞外囊泡和蛋白的浓缩效率两个方面评估，5～15倍浓缩均能得到精华，以10倍浓缩为最佳。
试验例1脂肪组织精华中残留利多卡因的检测
按实施例1的方法制备脂肪组织精华，取S4中10倍浓缩后的样品，采用高效液相色谱串联质谱法(LC-MS，安捷伦)检测麻药利多卡因的含量。结果如附图4所示，10倍浓缩的脂肪组织精华中，利多卡因的浓度为40μg/ml，按照临床使用1ml的剂量计算，远远低于临床小儿用量4.0～4.5mg/kg。
试验例2.AT-XOs中脂肪因子含量的检测
按实施例1的方法制备脂肪组织精华，取3个独立的精华样本，根据操作手册用人脂肪因子固相抗体芯片进行分析(QAH-ADI-3)(Raybiotech，美国)。参照附图5。结果显示：脂肪组织精华中含有多种脂肪因子。研究表明多种脂肪因子在组织再生过程(脂肪再生、毛发再生和血管再生等)中发挥重要作用，这些脂肪因子包括：adiponectin、leptin、PAI-1、IL-6、IGF-1、PDGF-BB、VEGF等。
试验例3.AT-XOs体内毛发再生能力的检测
取按实施例1的方法制备脂肪组织精华进行毛发再生能力试验，具体为：
将7周龄的C57小鼠进行背部脱毛后随机分成4组，分别为PBS组和来自于不同供体的AT-XOs-1组、AT-XOs-2组、AT-XOs-3组。将PBS和AT-XOs分别进行皮内注射100μl到小鼠背部，每隔一天注射一次。分别在第2天、10天、12天和15天四个时间点拍照记录。结果如附图6-9所示。
附图6表示不同时间点各组小鼠的大体观。
从体内实验结果可以看出，三个不同供体来源的脂肪组织精华均可以促进毛发再生，尤其在注射后第12天，效果差别最为显著(附图7)。
附图8表示15天背部皮肤的内面观，对照组未见明显的血管再生，硅胶片内未见明显的组织再生(实心箭头所示)；脂肪组织精华组可以看见大量新生的血管，硅胶片内充满新生的组织(空心箭头所示)。
附图9表示取15天的对照组和实验组背部皮肤样本进行苏木素-伊红(HE)染色，红色实框为对照组局部放大图，红色虚框为实验组局部放大图，黑色虚线间表示再生的组织厚度；黑色实心三角形箭头表示再生的血管。
上述结果表明，本发明方法制得的脂肪组织精华具有良好的促进组织再生的作用，特别是促进毛发再生。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。