具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种能够有效预防和/或治疗急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、低氧血症、肺组织炎症、肺组织损伤、全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭的无细胞脂肪提取物。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。

如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

在本发明中，术语“急性肺损伤(acute lung injure)”与“ALI”可互换使用。

在本发明中，术语“急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distresssyndrome)”与“ARDS”可互换使用。

在本发明中，术语“全身炎症反应综合征”与“SIRS”可互换使用。

在本发明中，术语“多器官功能衰竭”与“MODS”可互换使用。

在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法。本文中使用的"预防"还包括延迟疾病和/或它的附随症状的发作和降低对象的得病的风险。

本发明所述的“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的组合物、药盒、食品盒或保健品盒、活性成分组合时观察到的水平相比，本发明所述组合物或药物组合物减轻、抑制和/或逆转了糖尿病例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。

如本文所用，“改善”包括预防、治疗、缓解、逆转和减轻等等。

无细胞脂肪提取物(Cell free fat extract,CEFFE)及其制备方法

如本文所用，术语“本发明的无细胞脂肪提取物”、“本发明提取物”、“本发明的脂肪提取物”等可互换使用，指在脂肪提取物制备过程中(除漂洗步骤外)未添加任何溶液、溶剂、小分子、化学制剂、和生物添加剂所制备的源自脂肪组织的提取物(或提取液)。一种典型的制备本发明提取物的方法如上本发明第二方面中所述。此外，应理解，虽然本发明提取物在制备过程中不必添加任何添加剂(或添加成分)，但是也可以添加一些或少量的对本发明提取物的活性无负面或不利影响的安全的物质(如少量水)。

代表性地，本发明所述的无细胞脂肪提取物通过以下方法制备：

(1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料剪碎，并进行漂洗(如用生理盐水)，从而获得经漂洗的脂肪组织；

(2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物；

(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)；

(4)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)；

(5)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物；和

(6)对所述脂肪初提物进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地1-8min，最佳地1-5min。

在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述的乳化为机械乳化。

在另一优选例中，所述机械乳化为经注射器反复吹打(如吹打20-200次，较佳地20-150次，更佳地20-100次，更佳地30-50次)进行机械乳化。

在另一优选例中，所述的吹打的方式为2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打。

在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述乳化为通过组织匀浆机打碎的方法。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，在将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理前，还包括对所述乳化的脂肪混合物冷冻后解冻处理。

在另一优选例中，冷冻后解冻处理后，将解冻后的混合物用于离心。

在另一优选例中，所述的冷冻的温度为-50℃至-120℃，较佳地-60℃至-100℃，更佳地-70℃至-90℃。

在另一优选例中，所述的解冻的温度为20-40℃，较佳地25-40℃，更佳地37℃。

在另一优选例中，所述的冷冻后解冻的循环次数为1-5次(优选为1、2、3或4次)。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，离心后，所述乳化的脂肪混合物分层4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层(即为中间液体层)，第四层为细胞/组织碎片沉淀层。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地2-8min，最佳地3-7min。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，第一层、第二层、第三层和第四层从上到下依次排列。

在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述的中间液体层为透明或基本透明层。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤包能够将脂肪初提物中的脂肪细胞除去。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是通过滤器(如0.22μm微孔滤膜)进行。

在另一优选例中，所述的过滤器为微孔滤膜过滤器。

在另一优选例中，所述的微孔滤膜的孔径大小为0.05-0.8μm，较佳地0.1-0.5μm，更佳地0.1-0.4μm，更佳地0.15-0.3μm，更佳地0.2-0.25μm，最佳地0.22μm。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是先通过可滤去细胞的第一过滤器，然后再通过可滤去病原体(如细菌)的第二滤器(如0.22μm的滤器)进行的。

在另一优选例中，所述的步骤(6)中，还包括对所述脂肪提取物进行分装，形成分装的产品。(所述分装后的提取物可于-20℃保存待用；可低温(如-4℃)或常温解冻后直接使用，或解冻后置于低温(如4℃)保存一段时间，然后使用)。

用途

本发明所述的无细胞脂肪提取物能够有效预防和/或治疗急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、低氧血症、肺组织炎症、肺组织损伤、全身炎症反应综合征和/或多器官功能衰竭。

代表性地，本发明所述的无细胞脂肪提取物包括选自下组的一种或多种用途：(i)预防和/或治疗急性呼吸窘迫综合征和/或急性肺损伤；(ii)预防和/或治疗低氧血症；(iii)改善肺组织炎症；(iv)改善肺组织损伤；(v)预防和/或治疗全身炎症反应综合征；和/或(vi)预防和/或治疗多器官功能衰竭。

在另一优选例中，所预防和/或治疗急性呼吸窘迫综合征和/或急性肺损伤包括选自下组的一种或多种方式进行预防和/或治疗：

(ii)提高血氧含量；

(ii)改善肺组织炎症；

(iii)改善肺组织损伤；和/或

(iv)改善呼吸功能。

在另一优选例中，所述的预防和/或治疗低氧血症包括提高血氧含量。

在另一优选例中，所述的提高血氧含量包括提高血氧分压和/或提高血氧饱和度。

在另一优选例中，所述的改善肺组织炎症包括减轻肺内炎细胞浸润。

在另一优选例中，所述的炎细胞包括(但不限于)：白细胞、中性粒细胞数、淋巴细胞、单核细胞，或其组合。

在另一优选例中，所述的改善肺组织损伤包括选自下组的一种或多种方式进行改善：

(iii-1)减轻肺内炎细胞浸润；

(iii-2)抑制肺泡内巨噬细胞聚集；

(iii-3)抑制肺泡壁增厚；

(iii-4)抑制肺泡和/或肺泡血管周围出血；和/或

(iii-5)抑制肺泡内纤维素样物质沉积。

在另一优选例中，所述低氧血症的患者患有急性呼吸窘迫综合征和/或急性肺损伤。

在另一优选例中，所述肺组织炎症的患者患有急性呼吸窘迫综合征和/或急性肺损伤。

在另一优选例中，所述肺组织损伤的患者患有急性呼吸窘迫综合征和/或急性肺损伤。

本发明还提供一种(i)预防和/或治疗急性呼吸窘迫综合征和/或急性肺损伤；(ii)预防和/或治疗低氧血症；(iii)改善肺组织炎症；(iv)改善肺组织损伤；(v)预防和/或治疗全身炎症反应综合征；和/或(vi)预防和/或治疗多器官功能衰竭的方法，所述方法包括步骤：对需要的对象施用本发明所述的无细胞脂肪提取物。

在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如大鼠、小鼠。

组合物和施用

本发明所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、保健组合物、膳食补充剂等。

代表性地，可将本发明的无细胞脂肪提取物制备成药物组合物，诸如片剂、胶囊、粉剂、微粒剂、溶液剂、锭剂、胶冻、乳膏制剂、醑剂、悬液、酊、泥敷剂、搽剂、洗剂、和气雾剂之类的剂型。药物组合物能够由通常已知的制备技术来制备，并且合适的药物添加剂能够被添加到该药物中。

本发明的组合物还可以包括药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体。“药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明组合物施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内)、局部施用，优选的施用方式为口服施用和注射施用。

用于口服施用或给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，。

用于口服施用或给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部施用或给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明无细胞脂肪提取物可以单独施用或给药，或者与其它预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症的药物联合施用或给药。

施用组合物时，是将安全有效量的本发明无细胞脂肪提取物适用于需要治疗的人或非人动物(如大鼠、小鼠、狗、猫、牛、鸡、鸭等)，其中施用时剂量为药学上、食品上或保健品上可接受认为的有效给药剂量。如本文所用，术语“安全有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“安全有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。例如，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.1～1000mg，优选1～600mg，更优选为2-300mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

本发明首次发现无细胞脂肪提取物能够有效预防和/或治疗急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、低氧血症、肺组织炎症、肺组织损伤、全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

1.1.无细胞脂肪提取液(Cell free fat extract,CEFFE)的制备

脂肪由自愿者在获得知情同意的条件下获得。无细胞脂肪组织提取液的制备方法如下：

(1)脂肪组织获取自6名行常规脂肪抽吸术的健康女性，平均年龄31岁(24-36岁)。局部注射肿胀液麻醉后，使用具有大侧孔(2mm x 7mm)的3mm吸脂抽脂套管连接20mL注射器，人工负压下放射状抽吸，将获得的脂肪直立静止，去除肿胀液后，用生理盐水漂洗3遍。

(2)取经漂洗后的脂肪组织，置于离心管中，放入离心机中以1200g 4℃离心3分钟后，获得分层的混合物。

(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)。

(4)对所述中间层，用2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打30次，从而进行机械乳化，并获得经机械乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)。

(5)将所述经机械乳化的脂肪混合物置入-80℃冰箱冷冻，再进行37℃水浴解冻，单次冻融循环后，将解冻后的脂肪混合物以1200g 4℃离心5分钟，获得分层的混合物，分层的混合物共分为4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层，第四层为细胞/组织碎片沉淀层，去除油层和残余脂肪组织层，吸取液体层，吸取过程中避免细胞/组织碎片沉淀层污染，从而得到脂肪初提取液。

(6)将得到的脂肪初提取液经0.22μm滤器过滤除菌，从而灭菌并去除可能混有的活细胞，从而获得无细胞脂肪提取液，分装冻存于-20℃保存，使用时4℃解冻。

1.2大鼠ARDS模型建立及分组

脂多糖(LPS)用于构建ARDS(急性呼吸窘迫综合征)大鼠模型

8周龄雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将24只动物随机分为4组：对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，6只/组。24只动物均腹腔注射联合气道内雾化造模试剂脂多糖(LPS)。具体步骤如下：

Day0：各组根据动物体重,采用一次性微量注射器腹腔注射给予脂多糖(0.8mg/kg，400μL/kg)。

Day1(腹腔注射16h±30min后)：异氟烷吸入麻醉，各组动物气管内雾化给予脂多糖(5mg/kg，1000μL/kg)。主要实验步骤如下：动物异氟烷吸入麻醉，然后固定于呈45°放置的大鼠固定器上，使用小动物麻醉咽喉镜，压住动物舌根部，暴露声门，将抽取定量的脂多糖(LPS)溶液的肺部微型液体雾化器针头(钝性)轻柔的插入气管内，然后快速推动活塞，将LPS溶液雾化进入肺脏，快速拔出针头，从固定器上取下动物，头部朝上，左右旋转，使LPS尽可能的均匀分布于各肺叶。

1.3 CEFFE治疗剂量与方法

Day1动物气道内雾化给予造模试剂(LPS)约1h后，再按照下表1剂量给予CEFFE治疗或生理盐水对照。

表1

给药途径：尾静脉注射静脉注射给药，采用一次性无菌注射器抽取每只动物的药量，尾静脉缓慢(约10～60秒)注射给药。给药频率及期限：Day1动物气道内雾化给予造模试剂(LPS)约1h后开始首次给药；Day2进行第二次给药；两次给药间隔约24h(±20min)。

1.4存活率记录

计算试验周期内各组动物存活数与每组总动物数的比值，存活率(％)＝组存活动物数/组总动物数×100％。

1.5血气检测

检测时间：第二次给药结束后次日(Day3：造模后约48h)。

样品采集：大鼠腹腔注射水合氯醛(350mg/kg，100mg/mL)实施麻醉，腹中线纵向切开，分离腹主动脉，采用动脉采血器采集动脉血约0.2mL，采血器于手掌内搓动注射器及上下颠倒各5秒，绝对不能回抽采血器进行血液混匀处理。

检测方法：动脉血采集后，轻柔的将针头插入测试卡的血液注入口中，将血液缓慢推入，并加满样品加注管，当血液到达加样位时，停止加样，扣上盖子，血液会自动进入测试管内，将测试卡插入血气分析仪中，等待检测结果。

检测指标：氧分压PO2(mmHg)、二氧化碳分压PCO2(mmHg)、pH、血氧饱和度SO2％。

1.6肺灌洗液(BALF)检测

Day3所有动物腹腔注射水合氯醛(350mg/kg，100mg/mL)实施麻醉，腹主动脉放血实施安乐死。濒死动物采用异氟烷麻醉后，腹主动脉放血实施安乐死。

样本采集：动物安乐死后，剪开颈部和胸部皮肤及组织暴露气管、支气管及肺脏，分离右肺支气管，并结扎。在气管下穿缝合线，并在甲状软骨下适当位置于气管软骨环之间做1/2切口，将气管插管沿切口处向气道内缓慢插入至左侧支气管处，用穿好的缝合线在切口向心方向的适当部位将插管与气管扎紧固定。用注射器吸取3mL的PBS缓冲液缓慢注入，进行肺泡灌洗，反复灌洗3次，每次冲洗停留约10s，收集灌洗液于合适容量的离心管中(不低于2.1mL)。

BALF处理：将收集的灌洗液于4℃，约2000rpm条件下，离心20min。上清液于-70℃以下保存待用，沉淀用1mL PBS缓冲液重悬，用于白细胞计数及分类。

白细胞分类检测：重悬后的肺灌洗液，采用全自动血球分析仪进行白细胞计数及分类。

1.7组织病理学

各组动物进行解剖，并保存组织。尸检过程中，观察动物肺脏、气管及支气管是否异常。剪取右肺置于10％中性缓冲福尔马林溶液中固定、石蜡包埋、切片、制片、HE染色进行肺组织病理形态学观察，使用标准术语诊断和分类，按4分级法(轻微，轻度，中度，重度)对肺组织进行病理学检测。

1.8统计分析

数据采用SPSS软件进行单因素ANOVA检验，对数据差异显著性进行统计分析，并采用Bonferreni法进行事后检验，结果以平均数±标准差表示。

2.结果

2.1 CEFFE治疗有效提高ARDS大鼠存活率

记录各组大鼠存活情况，ARDS模型大鼠存活率的如图1所示，对照组死亡2只，存活率为67％，CEFFE治疗组未见死亡大鼠，表明CEFFE治疗有效提高了ARDS大鼠存活率。

2.2 CEFFE治疗有效改善ARDS大鼠呼吸功能，减轻低氧血症

动脉血气分析结果如表2和图2所示。

表2模型大鼠动脉血氧分压PO2与血氧饱和度SO2％(M±SD)

从表2和图2中可以看出，ADRS模型大鼠PO2明显受损。与对照组和低剂量治疗组相比，高剂量CEFFE治疗组氧分压PO2和血氧饱和度SO2％显著增高(P<0.05)，表明CEFFE治疗有效改善模型大鼠呼吸功能，减轻低氧血症。

2.3 CEFFE治疗有效减轻ARDS大鼠肺组织炎细胞浸润

BALF中炎细胞计数反应肺组织炎症情况，肺泡灌洗液炎细胞计数及分类情况如表3和图3所示。

表3肺泡灌洗液炎细胞计数及分类情况(M±SD)

备注：WBC指白细胞；Neut指中性粒细胞数；Lymph指淋巴细胞；Mono指单核细胞；

从表3和图3中可已看出，中剂量和高剂量CEFFE治疗组大鼠BALF中白细胞数目、中性粒细胞数目均显著低于对照组(P<0.05)，且呈剂量依赖性，表明肺内炎细胞浸润明显减轻，CEFFE治疗具有减轻ARDS大鼠肺内炎症的作用。

2.4 CEFFE治疗有效改善ARDS大鼠肺组织损伤

组织病理学HE染色结果如图4所示，其病理组织学半定量评价结果表4所示。

表4病理组织学半定量评价

从表4和图4中可以看出，对照组肺脏及支气管间质/肺泡以中性粒细胞为主的炎细胞浸润、肺泡内巨噬细胞聚集、肺泡壁增厚、肺泡/血管周围出血以及肺泡内纤维素样物质沉积；与模型对照组相比，CEFFE治疗中剂量组和高剂量组炎细胞浸润减轻、肺泡/血管周围出血有所改善，且存在剂量相关性，即高剂量组的改善作用较中剂量组明显；此外，高剂量组在肺泡内纤维素样物质沉积上同样有所改善，这些结果表明CEFFE治疗能够有效减轻ARDS大鼠肺组织损伤。

结论：

全身炎症反应综合征(SIRS)是由感染或损伤引起的一种临床综合征，全身炎症介质释放引起细胞因子/炎症因子风暴、炎症细胞激活等是其主要的促发因素，引起细胞凋亡、休克、免疫功能失调、脏器受损等。感染、创伤等引发了SIRS，失控的进一步发展为多器官功能衰竭(MODS)，肺脏是这一病程演变过程中最易受损伤的器官，因此，ALI/ARDS是SIRS患者重要的疾病症状。

本实验结果表明，CEFFE治疗能够有效改善ALI/ARDS引起的肺组织损伤，减轻肺内炎症，改善肺功能，纠正低氧血症，降低死亡率。CEEFE对ALI/ARDS的治疗作用提示了其对改善SIRS具有治疗价值，也提示了其对其他呼吸系统疾病的潜在治疗作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。