迷迭香提取物在防控多子小瓜虫病药物制备中的应用
阅读说明：本技术 迷迭香提取物在防控多子小瓜虫病药物制备中的应用 (Application of rosemary extract in preparation of medicine for preventing and controlling ichthyophthiriasis ) 是由 顾泽茂 胡静波 杨浩 李丹 于 2021-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了迷迭香(Rosemarinus officinalis)提取物在防控多子小瓜虫病药物制备中的应用,属于渔业病害防控技术领域。本发明首次将迷迭香提取物应用于防控多子小瓜虫病,在有效剂量范围能实现100％杀灭多子小瓜虫。迷迭香提取物对金鱼的半致死浓度分别为其杀灭小瓜虫掠食体和滋养体的半数有效浓度的28.6和9.4倍,在杀虫的有效范围内对鱼安全。迷迭香资源丰富,其提取物的制备工艺简单,具有开发成新型防控小瓜虫病的绿色替代药物的潜力。(The invention discloses application of rosemary (Rosemarinus officinalis) extract in preparation of a drug for preventing and controlling ichthyophthiriasis, belonging to the technical field of fishery disease prevention and control. The rosemary extract is applied to preventing and controlling the ichthyophthiriasis for the first time, and 100 percent of ichthyophthiriasis can be killed within the effective dose range. The semi-lethal concentration of the rosemary extract on goldfish is 28.6 times and 9.4 times of the half effective concentration of the rosemary extract on killing ichthyophthirius multifiliis and trophozoite respectively, and the rosemary extract is safe to the goldfish within the insecticidal effective range. The rosemary has rich resources, the preparation process of the extract is simple, and the rosemary has the potential of being developed into a novel green substitute medicament for preventing and controlling ichthyophthiriasis.)
技术领域
本发明属于渔业病害防控技术领域，特别涉及迷迭香提取物在防控多子小瓜虫病药物制备中的应用，本发明还涉及一种杀灭多子小瓜虫的方法。
背景技术
小瓜虫病是由多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis Fouquet)(简称小瓜虫)寄生于淡水鱼类的体表和鳃部引起的一种寄生虫病，该病分布广、发病快、死亡率高，严重时可引起鱼类大量死亡，造成经济损失。目前，生产上防控多子小瓜虫病主要依靠福尔马林和硫酸铜等化学药物，但这些药物的使用面临着高残留、毒性大和环境不友好等问题。因此，迫切需要寻找安全、有效的绿色替代药物。
中草药作为天然产物，具有毒副作用小、残留低、环境友好等优点，是开发绿色药物的重要资源。其中，迷迭香(Rosemarinus officinalis Linn)是一种唇形科、迷迭香属药用植物，在抗氧化、抗菌、抗肿瘤、消炎、抗心血管等诸多方面有作用，具有治疗哮喘、咳嗽、消化不良、风湿牙痛和心脏病等功效。目前，尚无将迷迭香用于防控多子小瓜虫病的报道。
发明内容
本发明的首要目的在于提供迷迭香提取物在防控多子小瓜虫病药物制备中的应用，本发明的另一目的是提供一种杀灭多子小瓜虫的方法。
上述目的通过下述方案实现：
体外杀虫试验结果表明：迷迭香提取物对小瓜虫的掠食体、滋养体和包囊均具有杀灭效果且具有量效关系，能通过杀灭虫体以防控多子小瓜虫病。
所述迷迭香的药用部位为迷迭香的叶。
所述迷迭香提取物为迷迭香用水或乙醇温浸提取得到的产物，优选是用乙醇温浸提取。
一种杀灭多子小瓜虫的方法，该方法包括向多子小瓜虫的虫液中施加迷迭香提取物的步骤。
优选地，所述迷迭香提取物的有效杀虫浓度为4-32mg/L，其中对掠食体的有效浓度≥4mg/L，对滋养体的有效浓度≥8mg/L，对包囊的有效浓度≥16mg/L。
本发明相对于现有技术具有以下的优点：
(1)本发明首次将迷迭香提取物应用于防控多子小瓜虫病药物的制备中，在有效剂量范围能实现100％杀灭小瓜虫。
(2)本发明的植物原材料在我国资源丰富，易于获得且制备工艺简单，应用前景广阔。
(3)本发明的迷迭香提取物对金鱼的半致死浓度(LC50)为48.7mg/L，分别是其对掠食体、滋养体半数有效浓度(EC50)的28.6和9.4倍，在杀虫有效范围内对鱼安全。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中使用的材料为：寄主模型为金鱼，全长7.1-10.0(8.2±0.7)cm、体长4.6-5.8(5.1±0.3)cm、体重3.1-7.0(4.7±1.0)g，来源于上海某养殖场。寄生虫模型为小瓜虫，来源于华中农业大学水产学院养殖基地。迷迭香提取物为发明人所在实验室提取所得。
在试验开始前，申请人首先选择了蒲公英、板蓝根、穿心莲、金钱草、鱼腥草、迷迭香等70多种中草药，经水或乙醇提取后观察在离体情况下对小瓜虫掠食体的杀灭效果，初步筛选出几种具有较强活性的中草药，其中迷迭香对小瓜虫具有较强的杀虫活性，而有些中草药没有活性或活性很低。接着考察了迷迭香对其他常见淡水鱼类寄生虫(指环虫、三代虫)的杀虫活性，结果发现迷迭香对指环虫和三代虫均不能有效杀灭，说明迷迭香对小瓜虫的药效具有一定的特异性，于是接着进行以下试验。
迷迭香提取物的提取工艺为：
迷迭香叶于55℃烘箱内干燥至恒重后，经粉碎机粉碎、60目筛网过滤后，得到药物粉末。取1kg粉末，按照1:10比例加入10L无水乙醇，于45℃水浴锅内浸提2次，每次提取2h，合并提取液并过滤残留药物粉末得到滤液。将滤液于55℃旋转蒸发仪中减压浓缩，浓缩产物于55℃烘箱内干燥以去除剩余乙醇，至恒重后得到迷迭香乙醇提取物。
实施例1：迷迭香提取物对小瓜虫感染性幼虫(掠食体)的杀灭作用
(1)药物的配制：准确称取迷迭香提取物0.1g，用1mL二甲亚砜促溶，配成100g/L的药液，再稀释至试验所需浓度。同时配制含0.02％二甲亚砜的不含化合物的对照组处理液。
(2)设置6个试验组、1个二甲亚砜对照组和1个空白对照组，每组设置3个平行，试验于96孔板中完成。向96孔板的各孔中加入160μL含掠食体的溶液，分别在每孔内吸取6滴10μL虫液于载玻片上计数以估计该孔100μL所含掠食体的数量。在各孔中加入100μL不同浓度的药液，使最终药物浓度依次为8、4、2、1、0.5、0.25mg/L，将仅添加蒸馏水和仅添加含量为0.02％二甲亚砜的组设为阴性对照。试验温度24℃，记录不同处理组掠食体100％致死时间，4h后统计各孔掠食体的数量，并计算掠食体的死亡率和半数有效浓度(EC50)，计算公式如下：
死亡率(％)＝(1-试验组存活掠食体数/未加药前掠食体数)×100％
结果显示：迷迭香提取物对小瓜虫的杀灭效果呈剂量依赖性，浓度越高，致死时间越短。当浓度为8.0mg/L时，可在30min内杀灭100％掠食体；当浓度为4.0mg/L时，可在150min内杀灭100％掠食体。经SPSS计算迷迭香提取物对小瓜虫掠食体的EC50为1.7mg/L。
表1迷迭香提取物对多子小瓜虫掠食体的杀灭效果
浓度(mg/L)
致死时间(min)
死亡率(％)
8
28.7±2.5
100.0±0.0
4
149.5±6.5
100.0±0.0
2
﹣
68.7±5.5
1
﹣
14.9±12.0
0.5
﹣
0.0±0.0
0.25
﹣
0.0±0.0
0(H<sub>2</sub>O)
﹣
0.0±0.0
0(0.02％DMSO)
﹣
0.0±0.0
实施例2：迷迭香提取物对小瓜虫成虫(滋养体)的杀灭作用
(1)药物配制同实施例1。
(2)设置5个试验组、1个二甲亚砜对照组和1个空白对照组，每组设置3个平行，试验于12孔板中完成。向12孔板的各孔中加入1mL约含30个成熟滋养体的虫液并准确计数各孔滋养体数，再分别加入1mL不同浓度的药液，使最终药物的浓度依次为32、16、8、4、2mg/L，将仅添加蒸馏水和仅添加含量为0.05％二甲亚砜的组设为阴性对照。24℃恒温培养箱中孵育6h后，记录各处理组存活的虫体的数量并计算死亡率。将12孔板静置于24℃恒温培养箱中，12h后统计各孔中的掠食体数量，并计算各处理组平均每个包囊孵出掠食体数，计算公式如下：
死亡率(％)＝(试验组死亡滋养体个数/未加药前滋养体个数)×100％
平均每个包囊孵出掠食体数＝各孔掠食体总数/各孔包囊数
结果显示，当迷迭香提取物浓度大于8.0mg/L时，可在6h内杀灭100％滋养体。经SPSS计算其对小瓜虫滋养体的EC50为5.2mg/L。
表2迷迭香提取物对多子小瓜虫滋养体的杀灭效果
浓度(mg/L)
死亡率
孵化数
32
100.0±0.0
0.0±0.0
16
100.0±0.0
0.0±0.0
8
100.0±0.0
0.0±0.0
4
10.0±8.8
551.5±84.4
2
3.3±3.3
650.5±63.7
0(H<sub>2</sub>O)
0.0±0.0
713.6±16.9
0(0.05％DMSO)
0.0±0.0
696.5±73.7
实施例3：迷迭香提取物对多子小瓜虫包囊的杀灭作用
(1)药物配制同实施例1。
(2)设置5个试验组、1个二甲亚砜对照组和1个空白对照组，每组设置3个平行，试验于12孔板中完成。向12孔板的各孔中加入1mL约含30个成熟滋养体的虫液并准确计数各孔滋养体数，将12孔板置于24℃恒温培养箱孵育4h，待滋养体发育成包囊后，准确计数各孔包囊数，再分别加入1mL不同浓度的药液，使最终药物的浓度依次为32、16、8、4、2mg/L，将仅添加蒸馏水和仅添加含量为0.05％二甲亚砜的组设为阴性对照。将12孔板置于24℃恒温培养箱中孵育12h，记录各处理组包囊的死亡率，统计各孔中的掠食体数量，并计算各处理组平均每个包囊孵出掠食体数，计算公式如下：
死亡率(％)＝(试验组死亡包囊个数/试验组形成包囊的个数)×100％
平均每个包囊孵出掠食体数＝各孔掠食体总数/各孔包囊数
结果显示，当迷迭香提取物浓度为32.0mg/L时，可在12h内对包囊的致死率为100％；当浓度为16.0mg/L时，包囊所孵出的掠食体形态均异常。经SPSS计算其对小瓜虫包囊的EC50为10.753mg/L。
表3迷迭香提取物对多子小瓜虫包囊的杀灭效果
浓度(mg/L)
死亡率
孵化数
32
100.0±0.0
0.0±0.0
16
100.0±0.0
0.0±0.0
8
5.6±6.9
360.7±113.9
4
4.4±3.8
518.6±89.9
2
0.0±0.0
680.9±85.7
0(H<sub>2</sub>O)
0.0±0.0
715.6±71.3
0(0.05％DMSO)
0.0±0.0
695.6±36.7
实施例4：迷迭香提取物对金鱼的急性毒性试验
(1)药液配制：方法同实施例1。
(2)预实验：测定迷迭香提取物使试验金鱼在24h内全部死亡的浓度为100mg/L，96h不发生死亡的浓度为20mg/L。
(3)向21个水族箱中分别装入3L曝气自来水和10尾金鱼，试验温度保持为23±0.5℃，并由充氧泵供氧。在预试验的基础上设置100、80、60、40、20mg/L五个浓度组，同时将仅添加蒸馏水和仅添加含量为0.1％二甲亚砜的组设为阴性对照，每一浓度设3个平行重复。试验期间随时观察各浓度下试验鱼的中毒情况，若发现金鱼中毒死亡，及时捞出，以免破坏水质影响试验结果。96h统计试验结果，计算半致死浓度(LC50)和95％置信区间(使用SPSS软件probit程序计算)。
迷迭香提取物对金鱼的急性毒性试验结果显示，在96h内，迷迭香提取物对金鱼的全部致死浓度为100.0mg/L，对金鱼的LC50为48.7mg/L，分别是其对掠食体、滋养体EC50的28.6和9.4倍，可见迷迭香提取物在杀虫有效范围内对鱼安全。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。